脫除阿魏酸后車前子多糖的溶液性質(zhì)、構(gòu)象特征及固體形貌

殷軍藝, 劉曉瑩, 聶少平, 謝明勇

(南昌大學食品科學與技術(shù)國家重點實驗室, 南昌 330047)

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脫除阿魏酸后車前子多糖的溶液性質(zhì)、構(gòu)象特征及固體形貌

殷軍藝, 劉曉瑩, 聶少平, 謝明勇

(南昌大學食品科學與技術(shù)國家重點實驗室, 南昌 330047)

摘要分別采用NaOH和阿魏酸酯酶對車前子多糖(PLCP)進行脫除阿魏酸處理, 得到的多糖分別記為PLCP-FAS和PLCP-FAE. 通過基本理化性質(zhì)測定和單糖組成分析比較了處理前后多糖的基本結(jié)構(gòu)特征, 并采用烏式黏度計、高效體積排阻色譜(HPSEC)和掃描電子顯微鏡(SEM)等方法表征了多糖的溶液性質(zhì)、構(gòu)象特征及固體形貌. 結(jié)果表明, 經(jīng)NaOH或阿魏酸酯酶處理后多糖的單糖組成基本不變, 但糖含量和糖醛酸含量增加, 表觀黏度顯著下降; PLCP-FAS和PLCP-FAE在0.1 mol/L NaCl和0.5 mol/L NaOH中的特性黏度基本相同; HPSEC分析結(jié)果表明, PLCP-FAE的重均分子量(Mw)為3.17×106, PLCP-FAS的Mw為2.83×106, PLCP-FAS和PLCP-FAE的持續(xù)圍長值一致, 但相同分子量下PLCP-FAS的特性黏度低于PLCP-FAE; SEM測定結(jié)果顯示, PLCP-FAS和PLCP-FAE仍保留一定線性鏈特征. 上述結(jié)果表明, 脫除阿魏酸的大粒車前子多糖呈現(xiàn)半柔順鏈的構(gòu)象特征, 樣品固體形貌仍保留一定的線性鏈特征.

關(guān)鍵詞車前子; 多糖; 阿魏酸; 溶液性質(zhì); 構(gòu)象特征

車前子為車前(PlantagoasiaticaL., 又稱大粒車前子)或平車前(PlantagodepressaWilld.)的干燥成熟種子, 主要產(chǎn)自江西、河南[1], 可用作保健食品. 車前子除了含有苯乙醇苷類化合物外[2], 還含有大量黏液質(zhì), 具有抗氧化[3,4]、免疫調(diào)節(jié)[5,6]和提升腸道健康[7,8]等功能. 大粒車前子富含阿拉伯糖和木糖, 主鏈由β-1,4-linked Xylp順序連接組成, 大量阿拉伯糖和木糖殘基分布在支鏈上, 同時支鏈上帶有部分GlcA[9,10]. 前文[11]研究表明, 阿魏酸對于維持大粒車前子高黏性和弱凝膠特征起重要作用, 采用NaOH脫除車前子多糖中的阿魏酸后多糖黏度顯著下降. 對于和車前子多糖具有相似結(jié)構(gòu)的阿拉伯木聚糖, 其高黏性特征通常與其支鏈末端Ara上存在的阿魏酸密切相關(guān), 多糖鏈間的阿魏酸通過交聯(lián)等作用賦予了阿拉伯木聚糖獨特的分子結(jié)構(gòu)和理化特征[12～14]. 阿拉伯木聚糖類多糖通常呈現(xiàn)出半柔順鏈的構(gòu)象特征[15～17], 其支鏈上的阿拉伯糖取代度對該類型多糖構(gòu)象特征的影響很小[15,18], 而多糖上的阿魏酸對其構(gòu)象有一定影響[19], 迄今未見關(guān)于阿魏酸和阿拉伯木聚糖溶液、構(gòu)象特征之間相互作用關(guān)系的報道. 大粒多糖為阿拉伯木聚糖, 含有一定量的阿魏酸, 本文通過堿法或者酶法脫除車前子多糖上的阿魏酸, 表征了脫除阿魏酸后多糖溶液的構(gòu)象特征, 進而分析了脫除阿魏酸前后的車前子多糖在結(jié)構(gòu)和構(gòu)象特征等方面的變化, 以期為車前子多糖高黏度性質(zhì)提供更科學、合理的解釋.

1實驗部分

1.1試劑與儀器

大粒車前子產(chǎn)自江西省吉安市; 單糖標準品葡萄糖(Glucose)、鼠李糖(Rhamnose)、巖藻糖(Fucose)、阿拉伯糖(Arabinose)、木糖(Xylose, Xyl)、甘露糖(Mannose)和半乳糖(Galactose)購自德國Merck公司/美國Sigma化學制劑公司; 阿魏酸酯酶購自愛爾蘭Megazyme公司; 其它試劑均為分析純.

ICS 500型離子色譜儀(美國Dionex公司); 高效體積排阻色譜(HPSEC)系統(tǒng)包括Wyatt D05SFD01泵、Dawn Heleos型多角度激光光散射檢測器、OPTILAB T-rEX示差檢測器和Visco Star Ⅱ型黏度檢測器(美國Wyatt公司), 色譜柱為Ohpak SB-G保護柱(8 mm×50 mm)、Ohpak SB-806 HQ型色譜柱和Ohpak SB-804 HQ型色譜柱(日本Showa Denko公司) 串聯(lián)使用; ALPHA 1-2型冷凍干燥機(德國Martin Christ公司); Milli-Q 超純水儀(美國Millipore公司); ARES流變儀(美國TA公司); 透析袋(截留分子量8000～10000); QUANTA 200F掃描電子顯微鏡(美國FEI公司).

1.2實驗過程

1.2.1多糖樣品的制備參考文獻[10]方法制備車前子精制多糖(PLCP). 稱取1.0 g PLCP溶解于50 mL水中, 加入150 mL 5 mg/mL NaBH4的NaOH溶液(終濃度為2.0 mol/L), 在N2氣保護下攪拌4 h, 用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至1.5以下, 加入300 mL無水乙醚萃取3次. 將萃取后的多糖溶液減壓濃縮, 經(jīng)透析、凍干得到脫除阿魏酸后的車前子多糖PLCP-FAS(收率63%).

稱取1.0 g PLCP溶解于300 mL磷酸鈉緩沖液(0.1 mol/L)中, 加入50 μL 0.39 mmol/L阿魏酸酯酶, 于40 ℃反應3 h后, 透析、離心收集上層清液, 經(jīng)濃縮、凍干得到多糖PLCP-FAE(收率89%).

1.2.2測試與表征以Xyl為標準品, 采用苯酚-硫酸法測定總糖含量[20]; 以葡萄糖醛酸為標準品, 采用改良硫酸-咔唑法測定糖醛酸含量[21]; 以牛血清白蛋白為標準品, 采用考馬斯亮藍法測定蛋白含量[22]. 取一定量多糖加入2 mol/L H2SO4中, 于100 ℃水解2 h后, 用離子色譜儀測定單糖組成[23].

利用烏氏黏度計分別測定PLCP-FAS和PLCP-FAE在水溶液、0.1 mol/L NaCl溶液和0.5 mol/L NaOH溶液中的特性黏度, 測試溫度為25.0 ℃. 依據(jù)Huggins和Kramer公式計算特性黏度

(1)

(2)

式中,ηsp為表觀黏度,ηrel為相對黏度,c為待測物濃度,k為常數(shù), 通過濃度外推法可計算得到

(3)

(4)

HPSEC測定: 將PLCP-FAS和PLCP-FAE溶解在0.1 mol/L NaNO3溶液中(含0.2 mg/mL NaN3), 室溫下攪拌溶解12 h以上(樣品濃度為0.5 mg/mL), 然后用0.45 μm濾膜過濾. 以0.1 mol/L NaNO3為流動相(含0.2 mg/mL NaN3), 流速為0.6 mL/min, 進樣量100 μL進行HPSES測定. 示差折光指數(shù)濃度增量(dn/dc)值取0.146. 以Mw為40000的葡聚糖(Dextran)為標樣對儀器進行歸一化處理. 采用Wyatt公司ASTRA軟件(6.1.1.84)采集和分析數(shù)據(jù).

2結(jié)果與討論

2.1基本理化性質(zhì)和單糖組成分析

PLCP經(jīng)脫除阿魏酸處理后的基本理化性質(zhì)和單糖組成結(jié)果如表1所示. 與原有樣品相比[11], 多糖脫除阿魏酸后糖含量和糖醛酸含量顯著上升, 但主要單糖組成種類和相對比例幾乎無變化, 特別是阿拉伯糖(Arabinose)和木糖(Xylose)的比例基本穩(wěn)定, 說明無論是用NaOH還是阿魏酸酯酶處理, 多糖主要結(jié)構(gòu)均未發(fā)生顯著變化. 但是多糖經(jīng)脫除阿魏酸處理后, 阿魏酸之間的交聯(lián)作用以及阿魏酸與Ca2+的相互作用消失, 導致多糖黏度急劇下降(圖S1～圖S3, 見本文支持信息).

Table 1　Physicochemical properties and monosaccharide compositions of PLCP-FAS and PLCP-FAE*

* ND: Not determined.

2.2特性黏度分析

特性黏度用于衡量給定溶劑中被單獨的聚合物鏈所占據(jù)的流體體積. PLCP-FAS和PLCP-FAE在不同溶劑中的特性黏度存在一定差異, 如PLCP-FAS和PLCP-FAE在純水中特性黏度最高, 分別達到43.68和32.94 dL/g, 當2個組分溶解于0.1 mol/L NaCl溶液中時, 由于Na+可以消除多糖中酸性電荷引起的排斥作用, 致使多糖的特性黏度降低(均為3.45 dL/g). 在0.5mol/L NaOH溶液中, PLCP-FAS和PLCP-FAE的特性黏度則分別降至2.64和2.68 dL/g.

2.3HPSEC檢測

HPSEC-激光光散射儀聯(lián)用稱為絕對方法, 除可得到Mw, 還能得到多分散指數(shù)(Mw/Mn)和均旋轉(zhuǎn)半徑(Rg)等構(gòu)象參數(shù)[24], PLCP-FAE和PLCP-FAS的HPSEC測定結(jié)果見表2(HPSEC色譜圖見圖S4和圖S5, 見本文支持信息). 由HPSEC結(jié)果可知, PLCP-FAS的Mw大于PLCP-FAE, PLCP-FAS的多分散指數(shù)(Mw/Mn)和PLCP-FAE相當, 但二者的Mw和Mn均小于PLCP[25]. PLCP-FAE和PLCP-FAS的樣品回收率較高, 與其它來源的小分子量阿拉伯木聚糖在HPSEC測試中的數(shù)值接近[15,16].

Table 2　Analysis results of PLCP-FAS and PLCP-FAE from HPSEC*

* Injection volume: 100 μL; flow rate: 0.6 mL/min; sample concentration: 0.5 mg/mL; mobile phase: 0.1 mol/L NaNO3containing 0.2 mg/mL NaNO3.Rg: Mean-square radius of gyration;Rh: hydrodynamic radius.

Fig.1　Logarithmic plot of molecular weight against intrinsic viscosity of PLCP-FAS(A), 　PLCP-FAE(B) and wmbination(C)

由Mark-Houwink經(jīng)驗公式([η]=KMα, 其中K和α是經(jīng)驗常數(shù), 隨聚合物的種類、溶劑以及測定溫度不同而呈現(xiàn)一定差異)可知, 在一個特定溶劑中測定的特性黏度與相對分子質(zhì)量M有關(guān). 對于線性無規(guī)卷曲多糖, 指數(shù)α介于0.5～0.8之間, 且隨著鏈條剛性的增加而增大. 對于PLCP-FAS, 在低分子量(占總數(shù)的50%)和高分子量區(qū)域(占總數(shù)的47%)的α值分別為0.84和0.20, 而PLCP-FAE在低分子量(占總數(shù)的70%)和高分子量區(qū)域(占總數(shù)的26%)的α值分別為0.64和0.18(見圖1). 通過蠕蟲狀鏈模型(Bohdanecky模型)可分析PLCP-FAS和PLCP-FAE的構(gòu)象參數(shù), 伸展無規(guī)線團的(M2/[η])1/3和M1/2存在以下線性關(guān)系[26，27]

(5)

式中:M為HPSEC測得的相對分子質(zhì)量; [η]為每個級分對應的特性黏度;ML為單位圍長摩爾質(zhì)量;Lp為持續(xù)圍長;A0和B0為常數(shù)[25];Φ0,∞=2.86×1023mol-1;ML取值為420 g/(mol·nm). PLCP-FAS和PLCP-FAE的Bohdanecky擬合圖見圖2, 通過計算得到PLCP-FAS和PLCP-FAE的Lp值均為2.1 nm. 持續(xù)圍長Lp的大小常用于衡量多糖鏈剛性結(jié)構(gòu)的強弱, 如非常柔順的普魯蘭的Lp介于1.2～1.9 nm之間, 而剛性結(jié)構(gòu)非常強的黃原膠的Lp可達到100～150 nm[17], 通過HPSEC測試計算得到PLCP-FAS和PLCP-FAE的持續(xù)圍長Lp均為2.1 nm, 說明脫除阿魏酸后的多糖表現(xiàn)出半柔順鏈構(gòu)象特征, 文獻[15～17]也報道阿拉伯木聚糖類多糖通常呈現(xiàn)出半柔順鏈的構(gòu)象特征.

Fig.2　Bohdanecky plot of PLCP-FAS(A) and PLCP-FAE(B) in 0.1 mol/L NaNO3

2.4SEM表征

采用SEM表征了脫除阿魏酸后車前子多糖的形態(tài)變化情況, 結(jié)果如圖3所示. 在未脫除阿魏酸之前, 車前子多糖PLCP基本上呈現(xiàn)線性形態(tài), 存在少量無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)[10]. 由圖3(A)可見, PLCP-FAS基本上表現(xiàn)為短小的細絲狀鏈結(jié)構(gòu), 有少部分鏈上出現(xiàn)圓形或橢圓形節(jié)點. 而PLCP-FAE還能觀察到細絲狀鏈構(gòu)象, 但鏈的直徑大小不一, 重要的是多糖鏈上出現(xiàn)了大量的圓形或橢圓形節(jié)點[圖3(B)]. 上述結(jié)果表明, 車前子多糖脫除阿魏酸后, 多糖鏈的形貌發(fā)生了一定變化.

Fig.3　SEM images of PLCP-FAS(A) and PLCP-FAE(B)

綜上所述, 分別采用NaOH和阿魏酸酶對車前子多糖PLCP進行脫除阿魏酸處理, 制得多糖PLCP-FAS和PLCP-FAE. 與PLCP相比, PLCP-FAS和PLCP-FAE的結(jié)構(gòu)特征未發(fā)生明顯改變, 但其表觀黏度和特性黏度數(shù)值顯著降低, 同時相對分子質(zhì)量和可持續(xù)圍長等值也有一定程度的降低. PLCP-FAS和PLCP-FAE呈現(xiàn)半柔順鏈的構(gòu)象特征, 二者的固體形貌發(fā)生了改變, 但均仍保留一定的線性鏈特征.

支持信息見http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20150513.

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Solution, Conformational Properties and Morphology of Psyllium

Polysaccharide with Ferulic Acid Removal?

YIN Junyi, LIU Xiaoying, NIE Shaoping, XIE Mingyong*

(StateKeyLaboratoryofFoodScienceandTechnology,NanchangUniversity,Nanchang330047,China)

AbstractThis study was aimed at investing the solution and conformation properties of polysaccharide from psyllium(or seeds ofPlantagoasiaticaL.). The fraction which was subjected with NaOH to remove ferulic acid was named as PLCP-FAS, while another fraction was PLCP-FAE whose ferulic acid was removed by feruloyl esterase. Ubbelohde capillary viscometer, HPSEC with refractive index, light scattering and viscometric detectors and scanning electron microscope(SEM) were applied to investigate the two fractions’ solution, conformation properties and solid form. The results showed that there was little change in monosaccharide compositions of the polysaccharide after ferulic acid removing, not mater by NaOH or enzyme. Sugar contents and uronic acid contents were much higher both for the two fractions. However, its apparent viscosity reduced remarkably. Intrinsic viscosity of PLCP-FAS and PLCP-FAE were close either in 0.1 mol/L NaCl or 0.5 mol/L NaOH. HPSEC analysis results showed that weight average molecular weight of PLCP-FAS was 3.17×106, while it was 2.83×106for PLCP-FAE. Persistence length of PLCP-FAS and PLCP-FAE were similar. SEM results showed that both PLCP-FAE and PLCP-FAS still exhibited certain linear chain characteristics. The above results indicated that the psylliun polysaccharide after removing ferulic acid was semi flexible, and morphology of the polysaccharide remained some linear chain characteristics.

KeywordsPsyllium; Polysaccharide; Ferulic acid; Solution property; Conformation characteristic

(Ed.: P, H, S, K)

? Supported by the National Natural Science Foundation of China(Nos.31301434, 21564007), the National Key Technology Research and Development Program of China for the 12th Five-year Plan(No.2012BAD33B06), the Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education of China(No.20133601120009) and the Natural Science Foundation of Jiangxi Province, China(No.20142BAB214004).

doi:10.7503/cjcu20150490

基金項目：國家自然科學基金(批準號: 31301434, 21564007)、“十二五”國家科技支撐計劃項目(批準號: 2012BAD33B06)、教育部高等學校博士學科點專項科研基金(批準號: 20133601120009)和江西省自然科學基金(批準號: 20142BAB214004)資助.

收稿日期:2015-07-01. 網(wǎng)絡(luò)出版日期: 2015-12-20.

中圖分類號O629.12

文獻標志碼A

聯(lián)系人簡介: 謝明勇, 男, 博士, 教授, 博士生導師, 主要從事食品化學和營養(yǎng)學研究. E-mail: myxie@ncu.edu.cn