基于鏈置換循環(huán)無標(biāo)記檢測(cè)端粒酶RNA的熒光法

張霞菲, 成　銳, 時(shí)志路, 金　燕

(陜西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 陜西省生命分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 陜西 710062)

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基于鏈置換循環(huán)無標(biāo)記檢測(cè)端粒酶RNA的熒光法

張霞菲, 成銳, 時(shí)志路, 金燕

(陜西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 陜西省生命分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 陜西 710062)

摘要以氧化石墨烯(GO)作為DNA載體和熒光猝滅劑, SYBR Green Ⅰ(SGⅠ)為熒光信號(hào)探針, 發(fā)夾核酸探針為分子識(shí)別探針, 基于目標(biāo)物啟動(dòng)的發(fā)夾核酸探針鏈置換循環(huán)反應(yīng), 建立了一種利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移和鏈置換循環(huán)放大技術(shù)檢測(cè)端粒酶RNA(hTR)的熒光新方法. 發(fā)夾核酸探針hpDNA1和hpDNA2吸附在GO表面, 嵌插在發(fā)夾DNA探針莖部的SGⅠ的熒光信號(hào)被GO猝滅. 當(dāng)人工合成的目標(biāo)物(T1)存在時(shí), T1與hpDNA1雜交打開hpDNA1的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)而引發(fā)hpDNA2與T1之間的鏈置換循環(huán)反應(yīng), 由此累積產(chǎn)生大量的hpDNA1/hpDNA2雜交雙鏈. 剛性的雙鏈DNA脫離GO表面, 導(dǎo)致所嵌插的SGⅠ產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光信號(hào). 基于熒光信號(hào)的變化, 可定量檢測(cè)0.2～50 nmol/L的T1, 檢出限為90 pmol/L. 該方法為端粒酶RNA檢測(cè)提供了一種高靈敏、高特異性且無需標(biāo)記的熒光新途徑.

關(guān)鍵詞端粒酶RNA; 鏈置換循環(huán); 熒光共振能量轉(zhuǎn)移; 無標(biāo)記

E-mail: jinyan@snnu.edu.cn

端粒酶(Telomerase)是一種核糖核蛋白酶, 其主要功能是催化端粒(Telomere)末端不斷延伸(TTAGGG)n序列, 從而克服細(xì)胞分裂過程中的端?？s短問題. 研究表明, 端粒酶在85%以上的人類腫瘤細(xì)胞中被高表達(dá), 而在正常體細(xì)胞中的表達(dá)量則極低甚至不表達(dá). 因此, 端粒酶與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化及持續(xù)分裂增殖具有密切關(guān)系, 是惡性腫瘤發(fā)展程度的衡量指標(biāo)[1～8]. 端粒酶由3個(gè)主要成分組成, 其中端粒酶RNA(hTR)是端粒酶活性表達(dá)的核心組件[9～11], 它是長為451 bp 的核苷酸短片段, 含有長11個(gè)堿基的模板區(qū)域(5′-CUAACCCUAAC-3′), 在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中都有表達(dá).

近年來的研究[12,13]表明, hTR在多種腫瘤中有異常的擴(kuò)增現(xiàn)象, 與正常組織相比表達(dá)水平偏高, 顯示出其在致腫瘤性上的重要作用. 目前, 檢測(cè)hTR的方法主要有原位雜交法[14,15]和逆轉(zhuǎn)錄PCR[16,17]法等. Shay等[18]采用原位雜交技術(shù)檢測(cè)了食道癌細(xì)胞中RNA的含量. Naoki等[19]采用實(shí)時(shí)熒光定量法檢測(cè)了hTR的表達(dá)水平. Gao等[20]以銀納米簇作為信號(hào)分子建立了檢測(cè)hTR的熒光分析法. 這些方法存在操作較為繁瑣和靈敏度不高等局限. 因此, 亟需發(fā)展一種簡(jiǎn)便、靈敏檢測(cè)hTR的新方法.

近年來, 信號(hào)放大技術(shù)[21,22]備受關(guān)注, 尤其是鏈置換信號(hào)放大技術(shù)作為一種等溫、無酶輔助的新型放大技術(shù), 被廣泛用于檢測(cè)DNA、蛋白質(zhì)、小分子及金屬離子等目標(biāo)物. 采用2個(gè)發(fā)夾核酸探針, 通過目標(biāo)物啟動(dòng)的鏈置換循環(huán)反應(yīng), 在無酶的條件下可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的高靈敏檢測(cè).

本文以氧化石墨烯(GO)為DNA載體和熒光猝滅劑, 以發(fā)夾核酸探針為分子識(shí)別探針, 基于GO對(duì)發(fā)夾核酸探針和雙鏈DNA吸附能力的差異, 將目標(biāo)物引起的熒光共振能量轉(zhuǎn)移變化和目標(biāo)物啟動(dòng)的鏈置換循環(huán)反應(yīng)相結(jié)合, 建立了一種在均相溶液中簡(jiǎn)便、快速且無需標(biāo)記檢測(cè)hTR的熒光新方法.

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑與儀器

氧化石墨烯(GO, 南京先鋒納米材料科技有限公司); SYBR Green Ⅰ[SGI, 美國NEB(Life Technologies)公司]; MgCl2(西安化學(xué)試劑廠); 三羥甲基氨基甲烷(Tris, 北京鼎國生物科技有限公司); 實(shí)驗(yàn)所用DNA序列如表S1(見本文支持信息)所示, 均由上海生物工程有限公司合成, 用20 mmol/L Tris-HCl(pH=7.4)和5 mmol/L MgCl2緩沖溶液配制成100 μmol/L的儲(chǔ)備液, 置于冰箱中備用. 實(shí)驗(yàn)用水均為超純水(18.2 MΩ·cm).

Hitachi F-7000型熒光分光光度計(jì)(日本日立公司); LS型超純水機(jī)(美國PALL公司); 5424R型小型離心機(jī)(德國Eppendorf公司); PowerPac Basic型電泳儀(美國伯樂BIO-RAD公司); BIO-RAD型凝膠成像系統(tǒng)(上海培清科技有限公司); WFH-204B型手提式紫外燈(上海精科實(shí)業(yè)); IX73型倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司); iXon X3 885 型電子倍增電荷耦合裝置(EMCCD, 英國Andor公司).

1.2實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1熒光測(cè)定向20 nmol/L hpDNA1中加入一定量的SGⅠ和GO, 在20 mmol/L Tris-HCl(pH=7.4)和5 mmol/L MgCl2緩沖溶液中培育10 min, 測(cè)定其熒光強(qiáng)度. 加入不同濃度的目標(biāo)物, 再測(cè)定熒光強(qiáng)度. 進(jìn)行鏈置換循環(huán)放大時(shí), 在hpDNA1/SGⅠ/GO混合物中加入不同濃度的目標(biāo)物和一定量的hpDNA2, 在室溫下培育20 min, 測(cè)定熒光強(qiáng)度. hpDNA1, hpDNA2, GO 和SGⅠ的最終濃度分別為20 nmol/L, 30 nmol/L, 15 μg/mL和6 μL 20×SGⅠ.

1.2.2比色法測(cè)定將1 μmol/L hpDNA1, 1.5 μmol/L hpDNA2, 1 μmol/L T1, 5 μL 50×SGⅠ 和50 μg/mL GO在20 mmol/L Tris-HCl(pH=7.4)和5 mmol/L MgCl2緩沖溶液中反應(yīng)1 h后, 在暗室中用紫外燈照射并拍照.

1.2.3凝膠電泳分析將100 nmol/L hpDNA1, 150 nmol/L hpDNA2和100 nmol/L目標(biāo)物T1混合于20 mmol/L Tris-HCl(pH=7.4)和5 mmol/L MgCl2緩沖溶液中, 培育30 min. 向每10 μL的樣品中加入1 μL染色液[0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))溴酚藍(lán)+0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))二甲苯藍(lán)(FF)+30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))甘油]充分混合, 取2 μL混合液上樣進(jìn)行電泳分析. 凝膠電泳在12.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行, 電泳液為1×TBE緩沖液(90 mmol/L Tris硼酸鹽+1 mmol/L EDTA, pH=8.3), 于200 V電壓下電泳20 min. 電泳結(jié)束后用硝酸銀染色, 再用凝膠成像儀成像.

1.2.4細(xì)胞培養(yǎng)將宮頸癌細(xì)胞(HeLa)培養(yǎng)于含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中(含有100 U/mL青霉素+0.01 mg/mL鏈霉素+10%胎牛血清), 傳代后在37 ℃, 95%(體積分?jǐn)?shù))空氣和5% CO2條件下培養(yǎng), 直至貼壁細(xì)胞的豐度>60%.

1.2.5GO對(duì)核酸保護(hù)作用的分析將100 nmol/L hpDNA1與10U DNase 1 混合, 分別培育0, 5, 10, 30和60 min, 于95 ℃失活5 min后進(jìn)行凝膠電泳分析. 同時(shí), 將100 nmol/L hpDNA1, 10U DNase 1和15 μg/mL GO 培育后進(jìn)行凝膠電泳分析.

1.2.6GO對(duì)細(xì)胞毒性的分析首先將Hela細(xì)胞以每孔104個(gè)細(xì)胞接種在96孔板中, 待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的GO并作用8 h, 用PBS緩沖液清洗, 再加入20 μL MTT(5 mg/mL)作用4 h后用二甲基亞砜(DMSO)溶解, 采用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的光密度OD值, 進(jìn)行細(xì)胞毒性分析.

1.2.7細(xì)胞中hTR的熒光成像分析將Hela細(xì)胞栽種在35 mm培養(yǎng)皿中, 用DMEM 培養(yǎng)基培育至細(xì)胞貼壁. 將F-hpDNA1/GO混合液和F-hpDNA1/hpDNA2/GO混合溶液分別與Hela 細(xì)胞進(jìn)行培育. 核酸探針的最終濃度為100 nmol/L F-hpDNA1和150 nmol/L hpDNA2, GO的最終濃度為15 μg/mL. 培育 6～8 h后, 用 PBS 緩沖液反復(fù)洗滌細(xì)胞, 最后加入適量PBS 緩沖溶液進(jìn)行顯微鏡分析.

2結(jié)果與討論

2.1實(shí)驗(yàn)原理

基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移和鏈置換循環(huán)放大技術(shù)建立的hTR表達(dá)水平檢測(cè)原理如Scheme 1所示. 該方法以GO作為熒光猝滅劑, 以發(fā)夾核酸探針作為分子識(shí)別探針, SGⅠ作為熒光信號(hào)分子. SGⅠ自身熒光信號(hào)很微弱, 當(dāng)其嵌插到核酸探針磷酸骨架的雙鏈區(qū)則會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)熒光信號(hào). 當(dāng)不存在目標(biāo)物T1時(shí), 發(fā)夾核酸探針hpDNA1和hpDNA2可以穩(wěn)定共存, 通過5′黏性末端和較大的環(huán)部序列π-π堆積作用吸附到GO的表面, 使得嵌插于發(fā)夾核酸探針莖部雙鏈區(qū)的SGⅠ與GO靠近, 發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET), SGⅠ的熒光信號(hào)被猝滅. 而當(dāng)存在目標(biāo)物T1時(shí), T1與hpDNA1懸垂以及莖部雜交破壞發(fā)夾結(jié)構(gòu), 釋放出的長單鏈部分序列可打開hpDNA2, 形成的hpDNA1/hpDNA2雜交雙鏈DNA可有效置換出目標(biāo)物T1啟動(dòng)鏈置換反應(yīng), 最終產(chǎn)生大量的hpDNA1/hpDNA2雜交雙鏈. 剛性較強(qiáng)的雜交雙鏈完全脫離GO, 使得嵌插的SGⅠ產(chǎn)生強(qiáng)熒光信號(hào). 鏈置換循環(huán)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積放大, 基于此構(gòu)建了無標(biāo)記檢測(cè)hTR的熒光新方法.

Scheme 1　Schematic illustration of a label-free strand displacement amplification strategy for sensitive detection of hTR

2.2原理驗(yàn)證

2.2.1熒光和比色分析為了驗(yàn)證檢測(cè)原理的可行性, 首先進(jìn)行了熒光分析. 如圖1所示, SGⅠ自身熒光信號(hào)很微弱, 當(dāng)其嵌插到發(fā)夾核酸探針莖部的雙鏈區(qū)時(shí)產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光信號(hào). GO存在時(shí), 發(fā)夾核酸探針吸附到GO表面, SGⅠ熒光信號(hào)被GO猝滅. 當(dāng)目標(biāo)物T1存在時(shí), hpDNA1被打開, 雙鏈DNA從GO表面脫落, GO與SGⅠ間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率減弱, SGⅠ熒光信號(hào)部分恢復(fù). 加入hpDNA2后, 打開的hpDNA1與 hpDNA2雜交生成更長更穩(wěn)定的雙鏈DNA, 并釋放出T1進(jìn)行循環(huán)反應(yīng), 生成更多的雙鏈DNA, 能夠嵌插大量的SGⅠ, 導(dǎo)致熒光信號(hào)顯著增強(qiáng). 此結(jié)果初步證明了原理的可行性.

Fig.1　Fluorescence emission spectra of SGⅠ(A) a. SGⅠ; b. SGⅠ+hpDNA1+hpDNA2; c. SGⅠ+hpDNA1+hpDNA2+GO; d. SGⅠ+hpDNA1+hpDNA2+GO+T1. Inset of (A): photographs under UV light. a. SGⅠ+hpDNA1+hpDNA2; b. SGⅠ+htDNA1+hpDNA2+GO; c. SGⅠ+hpDNA1+T1; d. SGⅠ+hpDNA1+hpDNA2+GO+T1.

Fig.2　Gel electrophoretic analysis of strand displacement amplification strategyLane M: marker; lane 1: hpDNA1; lane 2: hpDNA2; lane 3: T1; lane 4: hpDNA1+T1; lane 5: hpDNA2+T1; lane 6: hpDNA1+hpDNA2; lane 6: hpDNA1+hpDNA2+T1.

嵌插于DNA雜交雙鏈中的(SGⅠ)經(jīng)紫外燈照射能產(chǎn)生肉眼可見的綠色熒光, 通過比較紫外燈照射下目標(biāo)物引入前后體系顏色的變化, 建立了目標(biāo)物T1檢測(cè)的比色法. 如圖1(A)插圖a與b所示, hpDNA1和hpDNA2可以吸附到GO表面, SGⅠ熒光信號(hào)被猝滅; 而c與d結(jié)果顯示, 鏈置換循環(huán)放大反應(yīng)的發(fā)生致使熒光信號(hào)明顯增強(qiáng). 比色分析結(jié)果與熒光檢測(cè)結(jié)果一致, 進(jìn)一步證明了原理的可行性. 為了排除其它因素引起的熒光信號(hào)變化, 設(shè)計(jì)了負(fù)對(duì)照實(shí)驗(yàn). 如圖1(B)所示, 在SGⅠ/hpDNA1/hpDNA2/GO混合液中, 加入任意序列的DNA(T4), SGⅠ熒光信號(hào)強(qiáng)度幾乎無變化, 說明只有在目標(biāo)物存在的情況下, 熒光信號(hào)才會(huì)得到增強(qiáng), 進(jìn)一步證明了該方法的可靠性.

2.2.2凝膠電泳分析凝膠電泳可有效驗(yàn)證DNA的構(gòu)型變化, 結(jié)果如圖2所示. 圖2泳道4中出現(xiàn)了1條新的條帶, 且T1帶消失, 說明T1能夠與hpDNA1進(jìn)行雜交. 泳道5結(jié)果表明, T1不會(huì)直接與hpDNA2雜交, 二者可以穩(wěn)定存在. 泳道6中hpDNA1與hpDNA2混合后沒有新的條帶形成, 說明在沒有目標(biāo)物存在的情況下, 2個(gè)發(fā)夾DNA可以各自穩(wěn)定存在, 不會(huì)相互打開. 當(dāng)存在目標(biāo)物時(shí), 泳道7中不僅觀察到了hpDNA1/T1雜交帶, 而且還觀察到了hpDNA1/hpDNA2的雜交帶, 說明目標(biāo)物存在下hpDNA2可以有效地與hpDNA1雜交, 并替代目標(biāo)物T1進(jìn)行循環(huán)反應(yīng), 以上電泳結(jié)果充分說明該方法的可行性與可靠性.

2.3實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

為了獲得最佳的實(shí)驗(yàn)效果, 對(duì)一些重要條件進(jìn)行了優(yōu)化, 優(yōu)化過程及結(jié)果如圖S1～圖S5(見本文支持信息)所示. 實(shí)驗(yàn)選擇氧化石墨的烯濃度為15 μg/mL, hpDNA1與hpDNA2的濃度比為1∶1.5, SGⅠ用量為6 μL 20×SGⅠ, 反應(yīng)溫度為37 ℃, 于pH=7.4的緩沖溶液中反應(yīng)20 min作為目標(biāo)物T1檢測(cè)的最佳條件.

2.4方法的選擇性

為了考察本方法對(duì)目標(biāo)物T1的識(shí)別選擇性, 分別研究了hpDNA1/hpDNA2/GO混合溶液與目標(biāo)物(T1)、單堿基錯(cuò)配的DNA(T2)、2個(gè)堿基錯(cuò)配的DNA(T3)和完全不互補(bǔ)的DNA(T4)的作用情況. 如圖3所示, 在相同的實(shí)驗(yàn)條件下, 這4種DNA序列檢測(cè)的熒光信號(hào)存在明顯的差異, 含有T1的體系熒光信號(hào)明顯強(qiáng)于其它DNA所產(chǎn)生的信號(hào). 圖3中插圖為比色分析結(jié)果, a～e與下方的柱形圖依次對(duì)應(yīng), 可見, 經(jīng)紫外燈照射后, 含有T1的溶液產(chǎn)生的光可明顯區(qū)別于其它DNA分子產(chǎn)生的光. 綜上, 熒光分析和比色分析結(jié)果均表明該方法具有較好的選擇性.

Fig.3　Investigation of the selectivity of the proposed methoda. SGⅠ+hpDNA1+hpDNA2/GO; b. SGⅠ+HPDNA1+hpDNA2+T1; c. SGⅠ+hpDNA1+hpDNA2+single-base mismatched DNA; d. SGⅠ+hpDNA1+hpDNA2+two-base mismatched DNA; e. SGⅠ+hpDNA1+hpDNA2+completely mismatch DNA. Inset: photographs under UV light.

2.5目標(biāo)物T1的檢測(cè)靈敏度

Fig.4　Fluorescence emission spectra of SGⅠ/hpDNA1/hpDNA2 in the presence of T1(A) and the 　linear relationship between the fluorescence intensity and the concentrations of T1(B)　(A) c(T1)/(nmol·L-1), a—f: 0, 10, 20, 30, 40, 50.

對(duì)最佳條件下不含有hpDNA2時(shí)的方法靈敏度進(jìn)行了考察. 由圖4(A)可見, 隨著目標(biāo)物T1濃度的增加, hpDNA1/GO/SGⅠ體系的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng). 在10～50 nmol/L范圍內(nèi), 體系的熒光強(qiáng)度與T1濃度值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系, 相關(guān)系數(shù)為0.9976[圖4(B)], 檢出限為5.50 nmol/L(n=11).

對(duì)最佳條件下含hpDNA2時(shí)方法靈敏度的考察結(jié)果如圖5所示. 由圖5(A)可見, 隨著目標(biāo)物T1濃度的增加, hpDNA1hp/hpDNA2/GO/SGⅠ體系的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng). 檢測(cè)范圍為0.2～50 nmol/L, 且在0.2～1 nmol/L 范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度與hTR濃度呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系, 相關(guān)系數(shù)為0.9957, 檢出限為90 pmol/L[圖5(B)]. 以上結(jié)果表明, hpDNA2的引入提高了目標(biāo)物檢測(cè)的靈敏度.

Fig.5　Fluorescence emission spectra of GO/SGⅠ/hpDNA1/hpDNA2 in the presence of T1(A) and the 　linear relationship between the fluorescence intensity and concentrations of T1(B)　(A) c(T1)/(nmol·L-1), a—m: 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 10, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50. 　Inset of (B) is the linear relationship in T1 concentration range of 0.2—1.0 nmol/L.

2.6GO對(duì)核酸的保護(hù)作用

Fig.6　Gel electrophoresis analysis of hpDNA1 treated with DNase 1 in the absence and presence of GO for 5, 10, 30 and 60 min

如何防止核酸降解是檢測(cè)實(shí)際樣品中核酸或者脫氧核酸面臨的最大挑戰(zhàn). GO不僅可作為熒光猝滅劑, 還可保護(hù)核酸, 防止其被酶降解. 以hpDNA1為模式DNA分子, DNase1為核酸降解酶, 它能夠消化單鏈或者雙鏈DNA產(chǎn)生單脫氧核苷酸. 如圖6所示, 在不含GO的體系中, 10 min內(nèi)hpDNA1幾乎被完全降解; 而在含有GO的體系中, hpDNA1的量幾乎無變化. 此結(jié)果說明GO對(duì)核酸起到了保護(hù)作用, 該方法可用于復(fù)雜樣品或細(xì)胞中目標(biāo)物的檢測(cè).

2.7GO對(duì)細(xì)胞的毒性

Fig.7　Cytotoxicity test of the GO in HeLa cell(A)and the color change of formazan crystals with different concentrations of GO(B)

為了利用GO將鏈置換反應(yīng)的探針?biāo)腿爰?xì)胞內(nèi), 首先利用噻唑藍(lán)(MTT)法考察了GO對(duì)HeLa細(xì)胞的毒性. MTT為黃色化合物, 是一種接受氫離子的染料, 可作用于活細(xì)胞線粒體中的呼吸鏈, 在琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素C的作用下生成藍(lán)色(或藍(lán)紫色)不溶于水的甲臜結(jié)晶, 甲臜結(jié)晶的生成量?jī)H與活細(xì)胞數(shù)目成正比(死細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶消失, 不能將MTT還原). 還原生成的甲臜結(jié)晶可用二甲基亞砜(DMSO)溶解, 利用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的光密度OD值, 即可反映活細(xì)胞數(shù)目, 從而進(jìn)行細(xì)胞毒性分析.

圖7(A)為不同濃度的GO與細(xì)胞作用 8 h 后所對(duì)應(yīng)的細(xì)胞存活率, 圖7(B)對(duì)應(yīng)圖7(A)中每個(gè)GO濃度下MTT結(jié)果的顏色變化. 可以看出, 隨著GO濃度的增大, 細(xì)胞存活率并未發(fā)生明顯降低, 處于一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài), 當(dāng)GO濃度達(dá)到 200 μg/mL時(shí), 細(xì)胞存活率仍高達(dá) 96.96%. 因此, 可以認(rèn)為GO對(duì)細(xì)胞無明顯毒性, 可作為生物載體實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè).

2.8細(xì)胞內(nèi)hTP的熒光成像分析

對(duì)hpDNA1的5′端進(jìn)行6-羧基熒光素(FAM)標(biāo)記(記作F-hpDNA1), 用于測(cè)定細(xì)胞中hTR含量. 基于活細(xì)胞對(duì)納米尺度材料進(jìn)行細(xì)胞自吞噬的機(jī)理, 將F-hpDNA1/hpDNA2/GO納米復(fù)合物與HeLa細(xì)胞共培養(yǎng), 實(shí)現(xiàn)了基于GO對(duì)鏈置換反應(yīng)探針的細(xì)胞跨膜運(yùn)輸, 結(jié)果如圖8所示. 圖8(A1)～(A3)示出了GO攜帶/F-hpDNA1進(jìn)入細(xì)胞的結(jié)果, hTR將F-hpDNA1打開, 發(fā)出微弱的熒光信號(hào). 圖8(B1)～(B3)示出了GO攜帶F-hpDNA1/hpDNA2進(jìn)入細(xì)胞的結(jié)果, 其熒光強(qiáng)度強(qiáng)于(A1)～(A3)的熒光強(qiáng)度, 說明hpDNA2的引入致使細(xì)胞中發(fā)生鏈置換循環(huán)反應(yīng), 熒光信號(hào)明顯增強(qiáng). 該結(jié)果也說明本文方法的原理是可行的, 同時(shí)進(jìn)行標(biāo)記還可用于細(xì)胞中hTR的檢測(cè).

Fig.8　Intracelluar images of HeLa cells incubated with GO/F-hpDNA1(A1—A3) and 　GO/F-hpDNA1/hpDNA2 for 8 h(B1—B3)(A1), (B1): Bright-field images; (A2), (B2): fluorescence images; (A3), (B3): merge of fluorescence and bright-field images.

綜上所述, 基于氧化石墨烯的FRET效應(yīng), 以熒光染料為信號(hào)分子, 提出了一種基于鏈置換循環(huán)放大技術(shù)的靈敏、快速無標(biāo)記檢測(cè)hTR的熒光新方法. 以2個(gè)發(fā)夾核酸探針在目標(biāo)序列存在下自組裝設(shè)計(jì)的鏈置換循環(huán)放大法無需酶輔助, 反應(yīng)時(shí)間短, 檢測(cè)效率高. 該方法采用SGⅠ作為信號(hào)分子, 降低了實(shí)驗(yàn)成本, 也可通過紫外燈照射進(jìn)行可視化分析. 以GO作為輸送載體和熒光猝滅劑, 可通過細(xì)胞內(nèi)成像實(shí)現(xiàn)細(xì)胞中hTR的檢測(cè). 對(duì)目標(biāo)物的靈敏檢測(cè)以及對(duì)單堿基錯(cuò)配序列的識(shí)別說明該方法有高的靈敏度和選擇性. 該方法為hTR的檢測(cè)提供了一種高選擇性、無需標(biāo)記且低成本的熒光新途徑.

支持信息見http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20150524.

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Label-free Fluorescence Assay of Telomerase RNA Based on

Strand Displacement Amplification?

ZHANG Xiafei, CHENG Rui, SHI Zhilu, JIN Yan*

(AnalyticalChemistryforLifeScienceofShaanxiProvince,SchoolofChemistryand

ChemicalEngineering,ShaanxiNormalUniversity,Xi’an710062,China)

AbstractA novel fluorescence method was developed for detecting telomerase RNA(hTR) based on the fluorescence resonance energy transfer(FRET) and strand displacement amplification(SDA) technique. Graphene oxide(GO) served as DNA carrier and fluorescence quencher. SYBR Green Ⅰ(SGⅠ) and hairpin DNAs(hpDNA) are fluorescence probe and molecular recognition probes, respectively. The fluorescence of SGⅠ that intercalated into the stem of hairpin DNAs was quenched when hpDNA1 and hpDNA2 were adsorbed onto the surface of GO. In the presence of T1, the hybridization reaction between hpDNA1 and T1 opened the hairpin structure of hpDNA1 to trigger the SDA reaction between hpDNA2 and T1, leading to an accumulation of hpDNA1/hpDNA2 hybrids. The rigid dsDNA desorbed from GO surface to restore the fluorescence of SGⅠ. Based on the change in fluorescence intensity, T1 can be quantitatively detected from 0.2 nmol/L to 50 nmol/L, with a detection limit of 90 pmol/L. Therefore, it offers a label-free, highly sensitive and specific fluorescence strategy for detection of hTR.

KeywordsTelomerase RNA; Strand displacement amplification; Fluorescence resonance energy transfer; Label-free

(Ed.: N, K)

? Supported by the National Natural Science Foundation of China(Nos.21075079, 21375086), the Program for Innovative Research Team in Shaanxi Province, China(No.2014KCT-28), the Fundamental Research Funds for the Central Universities, China(No.GK261001097) and the Program for Changjiang Scholars and Innovative Research Team in University, China(No.IRT-14R33).

doi:10.7503/cjcu20120521

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號(hào): 21075079, 21375086)、陜西省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)研究計(jì)劃項(xiàng)目(批準(zhǔn)號(hào): 2014KCT-28)、陜西師范大學(xué)中央高?；痦?xiàng)目(批準(zhǔn)號(hào): GK261001097)和長江學(xué)者高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(批準(zhǔn)號(hào): IRT-14R33)資助.

收稿日期:2015-07-08. 網(wǎng)絡(luò)出版日期: 2015-12-20.

中圖分類號(hào)O657.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

聯(lián)系人簡(jiǎn)介:金燕, 女, 博士, 教授, 博士生導(dǎo)師, 主要從事生物傳感及生化分析方面的研究.