腸道菌群法研究黃芪對防風(fēng)中升麻素苷、5-0-甲基維斯阿米醇苷代謝的影響

劉 玲， 趙曉莉*， 狄留慶*， 李俊松

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210046；2.江蘇省中藥高效給藥系統(tǒng)工程技術(shù)研究中心，江蘇南京210046；3.江蘇省兒童呼吸疾病［中醫(yī)藥］重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210046）

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腸道菌群法研究黃芪對防風(fēng)中升麻素苷、5-0-甲基維斯阿米醇苷代謝的影響

劉 玲1，2，3， 趙曉莉1，2，3*， 狄留慶1，2，3*， 李俊松1，2，3

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210046；2.江蘇省中藥高效給藥系統(tǒng)工程技術(shù)研究中心，江蘇南京210046；3.江蘇省兒童呼吸疾病［中醫(yī)藥］重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210046）

摘要:目的 采用腸道菌群法研究黃芪對防風(fēng)中主要活性成分升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷代謝的影響，從而探討防風(fēng)-黃芪藥對的配伍機(jī)制。方法 采用腸道菌群法，比較不同時(shí)間點(diǎn)防風(fēng)組和防風(fēng)-黃芪組以及防風(fēng)單體組和防風(fēng)單體-黃芪組中升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素的質(zhì)量濃度。結(jié)果防風(fēng)-黃芪組中升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的質(zhì)量濃度均高于防風(fēng)組，升麻素的質(zhì)量濃度均低于防風(fēng)組。單體-黃芪組中升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的質(zhì)量濃度均高于單體組，升麻素的質(zhì)量濃度均低于單體組。結(jié)論黃芪能抑制防風(fēng)中升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的水解反應(yīng)，減緩其代謝。

關(guān)鍵詞:升麻素苷；5-O-甲基維斯阿米醇苷；升麻素；腸道菌群

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.041

中藥有效成分（尤其是分子結(jié)構(gòu)中含葡糖苷類的成分）易受到腸道菌群的作用，發(fā)生結(jié)合、裂解等代謝轉(zhuǎn)化，影響藥物的體內(nèi)吸收［1］。防風(fēng)-黃芪為經(jīng)典、優(yōu)效藥對［2］，其主要活性成分色原酮類、黃酮苷類均易在腸道菌群作用下分解成苷元［3］。本課題組前期研究表明，與單用防風(fēng)組相比，防風(fēng)-黃芪配伍組中升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的AUC、Cmax、Tmax顯著性提高，而升麻素的Cmax卻顯著性降低，提示黃芪對防風(fēng)中主要活性成分的生物利用度產(chǎn)生顯著影響［4］。本實(shí)驗(yàn)采用腸道菌群法研究黃芪對防風(fēng)中主要活性成分升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷代謝的影響，從而探討防風(fēng)-黃芪藥對的配伍機(jī)制。

1 材料

1.1 藥材、對照品和試劑 黃芪、防風(fēng)經(jīng)鑒定合格；橙皮苷對照品（批號110721-201115，中國食品藥品檢定研究院）、升麻素苷對照品（批號111522-201008，中國食品藥品檢定研究院）、5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品（批號111523-201208，中國食品藥品檢定研究院）、升麻素對照品（批號111710-200501，中國食品藥品檢定研究院）供含量測定用；升麻素苷原料藥、5-O-甲基維斯阿米醇苷原料藥（南京澤郎醫(yī)藥科技有限公司，純度為98％）；乙腈（色譜純，德國Merck公司），水為超純水。

PBS溶液（PH 7.3）: 0.27g KH2PO4/L，1.42g Na2HPO4/L，8g NaC1/L，0.2g KC1/L。

緩沖鹽溶液: 0.2 g CaC12/L，0.2 g MgSO4·7H2O/L，1 g K2HPO4·3H2O/L，1 g KH2PO4/L，10 g NaHCO3/L，2 g NaC1/L。

腸道菌厭氧培養(yǎng)液（PH 7.3）: 1 000 mL蒸餾水含10 g酵母浸膏、20 g胰蛋白胨、0.5 g半胱氨酸鹽酸鹽和40 mL緩沖鹽溶液，120℃高壓滅菌15 min，冷卻后置4℃保存。1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD雄性大鼠，體質(zhì)量220～250 g，清潔級，浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號: scxk（浙）2014-0001。

1.3 儀器 Waters 2695高效液相色譜系統(tǒng)；YXJ-Z型臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；微量移液器（德國ePPendorf公司）；FA1204B型電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 原料藥的制備 取升麻素苷原料藥適量，精密稱定，加入蒸餾水超聲溶解，定容后制得1.2 mg/mL的貯備液，置于4℃冰箱保存。按相同方法制備，制得1.8 mg/mL的5-O-甲基維斯阿米醇苷貯備液。

2.2 藥液的提取 150 g防風(fēng)，2次回流提?。ǖ?次: 10倍量水，1.5 h。第2次: 8倍量水，1 h），合并濾液。將濾液減壓濃縮，得1 g/mL防風(fēng)藥液。黃芪450 g，按相同方法制備，得3 g/mL黃芪藥液。藥液置于4℃冰箱，備用。

2.3 內(nèi)標(biāo)橙皮苷溶液的配制 取橙皮苷對照品適量，精密稱定，加入甲醇超聲溶解，定容后制得391 μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，置于4℃冰箱保存。

2.4 腸道菌液的制備 取12只大鼠新鮮糞便，與4倍量的PBS溶液混合均勻，經(jīng)紗布過濾所得液體離心（500 r/min，5 min），取上清液，加入9倍量厭氧培養(yǎng)液，置于37℃厭氧環(huán)境中培養(yǎng)12 h，使腸道菌充分生長，即為腸道菌液。

2.5 腸道菌群實(shí)驗(yàn)與樣品處理方法 取腸道菌液160 μL，加入40 μL藥液，置于37℃厭氧環(huán)境中孵育，分別于0、0.25、0.5、1、2、4、8、12、24、36和48 h取出，并加入1 mL冰甲醇溶液，終止腸菌代謝反應(yīng)。渦旋3 min，離心（12 000 r/min，5 min），取上清液160 μL，加入40 μL內(nèi)標(biāo)，渦旋2 min，離心（12 000 r/min，5 min），取上清液10 μL，用液相色譜儀測定分析。

2.5.1 黃芪對防風(fēng)提取液中升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷代謝的影響 實(shí)驗(yàn)分為2組，各取腸道菌液160 μL，一組加入20 μL防風(fēng)提取液及20 μL PBS溶液；另一組加入20 μL防風(fēng)提取液及20 μL黃芪提取液。

2.5.2 黃芪對單體升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷代謝的影響 實(shí)驗(yàn)分為4組，各取腸道菌液160 μL，第1組加入20 μL升麻素苷溶液及20 μL PBS溶液，第2組加入20 μL升麻素苷溶液及20 μL黃芪提取液，第3組加入20 μL 5-O-甲基維斯阿米醇苷溶液及20 μL PBS溶液，第4組加入20 μL 5-O-甲基維斯阿米醇苷溶液及20 μL黃芪提取液。

2.6 樣品中升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素HPLC分析方法的建立

2.6.1 色譜條件 XBridgeTM C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫30°C；DAD檢測器，檢測波長254 nm；流動(dòng)相A為水，流動(dòng)相B為乙腈；梯度洗脫程序: 1～20 min，88％～65％ A；20～24 min，65％～65％ A；24～25 min，65％～88％ A；25～28 min，88％～88％ A；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

2.6.2 方法學(xué)考察

2.6.2.1 專屬性考察 取空白腸道菌孵育液、黃芪藥液、加升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素及內(nèi)標(biāo)對照品的腸道菌孵育液和防風(fēng)-黃芪組代謝2 h后的腸道菌孵育液，在“2.6.1”項(xiàng)色譜條件下，考察該方法的專屬性，由圖1可見，升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素和內(nèi)標(biāo)能較好分離，樣品中的其它成分在此條件下不干擾目標(biāo)成分的測定。

1-升麻素苷 2-升麻素 3-5-O-甲基維斯阿米醇苷 4-內(nèi)標(biāo)圖1　空白腸道菌孵育液（A），黃芪藥液（B），加升麻素苷、5-0-甲基維斯阿米醇苷、升麻素及內(nèi)標(biāo)對照品的腸道菌孵育液（C）和防風(fēng)-黃芪組代謝2 h后的腸道菌孵育液（D）的HPLC圖

2.6.2.2 線性關(guān)系考察 分別取升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素對照品適量，精密稱定，加入甲醇超聲溶解，定容后制得升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素分別為240、480、240 μg/mL的混合對照品貯備液，再逐倍稀釋成系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。按“2.5”項(xiàng)方法處理后進(jìn)樣測定。以升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行加權(quán)最小二乘回歸，結(jié)果見表1，表明升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷和升麻素分別在3.75～240、7.5～480 和3.75～240 μg/mL具有良好的線性關(guān)系。

表1　3種成分的線性回歸方程

2.6.2.3 絕對回收率和精密度考察 低、中、高質(zhì)量濃度的升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷和升麻素混合對照溶液（升麻素苷15、60、240 μg/mL；5-O-甲基維斯阿米醇苷30、120、480 μg/mL；升麻素15、60、240 μg/mL），平行5份，按“2.5”項(xiàng)方法處理后進(jìn)樣測定。結(jié)果見表2，表明升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷和升麻素絕對回收率和精密度符合要求。

表2　3種成分的絕對回收率和精密度

2.6.2.4 穩(wěn)定性考察 低、中、高質(zhì)量濃度的升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷和升麻素混合對照溶液（升麻素苷15、60、240 μg/mL；5-O-甲基維斯阿米醇苷30、120、480 μg/mL；升麻素15、60、240 μg/mL），按“2.5”項(xiàng)方法處理后進(jìn)樣測定，分別于0、12、24 h進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷和升麻素在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性符合要求。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 黃芪對防風(fēng)主要活性成分代謝的影響 以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以防風(fēng)組、防風(fēng)-黃芪組樣品中升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷和升麻素的質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，作圖，結(jié)果見圖2。用DAS 3.2.4軟件處理數(shù)據(jù)，得出防風(fēng)組、防風(fēng)-黃芪組升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷和升麻素的AUC0-t值，結(jié)果見表3。

表3　黃芪對防風(fēng)主要活性成分代謝的影響

圖2　防風(fēng)組、防風(fēng)-黃芪組的升麻素苷、5-0-甲基維斯阿米醇苷和升麻素的質(zhì)量濃度-時(shí)間曲線

結(jié)果表明，與防風(fēng)組相比，防風(fēng)-黃芪組升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的質(zhì)量濃度均提高，升麻素的質(zhì)量濃度均降低；防風(fēng)-黃芪組升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的AUC0-t值均顯著性提高，升麻素的AUC0-t值有所降低。結(jié)果表明黃芪能抑制防風(fēng)中升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的水解反應(yīng)。

3.2 黃芪對單體升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷代謝的影響 以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以單體組、單體-黃芪組樣品中升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷和升麻素的質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，作圖，結(jié)果見圖3。用DAS 3.2.4軟件處理數(shù)據(jù)，得出防風(fēng)組、防風(fēng)-黃芪組升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷和升麻素的AUC0-t值，結(jié)果見表4。

結(jié)果表明，與升麻素苷組相比，升麻素苷-黃芪組升麻素苷的質(zhì)量濃度均提高，升麻素的質(zhì)量濃度均降低，升麻素苷的AUC0-t值顯著性提高，升麻素的AUC0-t值顯著性降低。與5-O-甲基維斯阿米醇苷組相比，5-O-甲基維斯阿米醇苷-黃芪組5-O-甲基維斯阿米醇苷的質(zhì)量濃度均提高，AUC0-t值顯著性提高。進(jìn)一步證明了黃芪能抑制單體升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的水解反應(yīng)。

圖3　單體組、單體-黃芪組的升麻素苷、5-0-甲基維斯阿米醇苷和升麻素的質(zhì)量濃度-時(shí)間曲線

表4　黃芪對單體升麻素苷和5-0-甲基維斯阿米醇苷代謝的影響

4 討論

腸道菌群對含糖苷鍵的藥物進(jìn)行水解反應(yīng)，是中藥成分在腸道產(chǎn)生代謝的最主要方式之一［5］，黃芪、防風(fēng)中含有大量黃酮苷、色原酮類成分，易在腸道菌群的作用下代謝為苷元。本實(shí)驗(yàn)比較了不同時(shí)間點(diǎn)防風(fēng)組和防風(fēng)-黃芪組以及防風(fēng)單體組和防風(fēng)單體-黃芪組升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素的質(zhì)量濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，防風(fēng)-黃芪組中升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的質(zhì)量濃度均高于防風(fēng)組，升麻素的質(zhì)量濃度均低于防風(fēng)組。單體-黃芪組中升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的質(zhì)量濃度均高于單體組，升麻素的質(zhì)量濃度均低于單體組。結(jié)果表明黃芪能抑制防風(fēng)中升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的水解反應(yīng)，減緩其代謝。黃芪含有皂苷、黃酮、黃芪多糖等成分，這些成分多數(shù)具有葡糖苷鍵結(jié)構(gòu)［6］，與防風(fēng)配伍應(yīng)用時(shí)，可能對防風(fēng)中升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的代謝產(chǎn)生一定程度的競爭性抑制作用。

國內(nèi)外文獻(xiàn)研究表明［7-10］，升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷及其苷元均具有抗炎、退熱、鎮(zhèn)痛及抗血小板聚集等作用，且苷的藥理活性作用研究報(bào)導(dǎo)更多。文獻(xiàn)還報(bào)道防風(fēng)提取液在體內(nèi)的入血成分既有苷又有苷元，所以防風(fēng)發(fā)揮藥效是苷和苷元的共同作用。抑制苷類代謝為苷元，對苷而言是正向指標(biāo)，對苷元是負(fù)向指標(biāo)，對防風(fēng)整體而言，苷和苷元均對藥效的發(fā)揮產(chǎn)生貢獻(xiàn)，但各自貢獻(xiàn)率的大小則有待深入研究。中藥及其復(fù)方藥效的發(fā)揮是其所含多類化學(xué)成分綜合作用的結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)針對前期藥對配伍后主要活性成分藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的變化特征，選擇在腸道代謝環(huán)節(jié)開展系列研究，最終得出黃芪對防風(fēng)中升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的代謝產(chǎn)生一定程度的競爭性抑制作用這一實(shí)驗(yàn)結(jié)論，這較好地解釋防風(fēng)-黃芪藥對中升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷在大鼠體內(nèi)AUC、Cmax、Tmax提高，升麻素在大鼠體內(nèi)Cmax降低這一現(xiàn)象，從生物藥劑學(xué)角度揭示了防風(fēng)-黃芪藥對配伍應(yīng)用的科學(xué)內(nèi)涵。

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*通信作者:趙曉莉（1976—），女，博士，從事中藥新劑型新技術(shù)應(yīng)用與評價(jià)研究。Te1:（025）85811230，E-mai1: x1ee_ zhao@ 163.com

作者簡介:劉 玲（1990—），女，碩士生，從事中藥新劑型新技術(shù)應(yīng)用與評價(jià)研究。E-mai1: 15005177886@163.com

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（81102825）

收稿日期:2014-09-29

中圖分類號:R966

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B

文章編號:1001-1528（2016）02-0421-05