補(bǔ)腦軟膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究

李喜香， 劉效栓， 畢映燕， 包 強(qiáng)， 李季文， 李妍怡， 潘從澤， 張亞會(huì)， 錢夢(mèng)茹

（甘肅省中醫(yī)院，甘肅蘭州730050）

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補(bǔ)腦軟膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究

李喜香， 劉效栓， 畢映燕， 包 強(qiáng)， 李季文， 李妍怡， 潘從澤， 張亞會(huì)， 錢夢(mèng)茹

（甘肅省中醫(yī)院，甘肅蘭州730050）

摘要:目的 建立補(bǔ)腦軟膠囊（當(dāng)歸、川芎、黃芪、赤芍等）的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法 TLC法鑒別膠囊中的當(dāng)歸、川芎和補(bǔ)骨脂，HPLC法對(duì)芍藥苷、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含有量進(jìn)行測(cè)定。分析采用Waters C18色譜柱；流動(dòng)相為乙腈-0.1％磷酸（16∶84）；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm；柱溫室溫。結(jié)果 當(dāng)歸、川芎和補(bǔ)骨脂可以被準(zhǔn)確地鑒別。芍藥苷、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷分別在157.5～787.5 μg/mL（r=0.999 6）、10.9～54.5 μg/mL （r=0.999 6）、8.9～44.5 μg/mL（r=0.999 5）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率分別98.87％、98.56、98.91％ （RSD分別為1.7％、2.4％、2.5％，n =5）。結(jié)論 該方法操作簡(jiǎn)便，專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，能有效控制補(bǔ)腦軟膠囊的質(zhì)量.

關(guān)鍵詞:補(bǔ)腦軟膠囊；芍藥苷；阿魏酸；毛蕊異黃酮葡萄糖苷；TLC；HPLC

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.019

Quallty standard for Bunao Soft Capsules

LIXi-xiang， LIU Xiao-shuan， BIYing-yan， BAO Qiang， LIJi-wen， LIYan-yi， PAN Cong-ze，ZHANG Ya-hui， QIAN Meng-ru
（Gansu Provincial HosPital of TCM，Lanzhou 730050，China）

ABSTRACT: AIM To set uP a qua1ity standard for Bunao Soft CaPsu1es（Angelicae sinensis Radix，Liguszici Chuanxiong Radix，AstragaliMembranacei Radix，Paeoniae Rubrae Radix，etc.）.METH0DS TLC was aPP1ied to detecting the existence of Angelica sinensis，Ligusticum chuanxiong and Psoralea corylifolia in the caPsu1es，whi1e HPLC was used for the quantity determination of Paeonif1orin，feru1ic acid and ca1ycosin-7-O-β-D-g1ycoside.The ana1ysiswas conducted on Waters C18co1umn（4.6 mm×250 mm，5 μm）at room temPerature，with acetonitri1e-0.1％ PhosPhoric acid（16∶84）as themobi1e Phase at a f1ow rate of 1.0 mL/min and 230 nm for the detection wave1ength.RESULTS Angelica sinensis，Ligusticum chuanxiong and Psoralea corylifolia cou1d be sPecifica11y identified.Paeonif1orin，feru1ic acid and ca1ycosin-7-O-β-D-g1ycoside had good 1inear re1ationshiPs within the ranges of 157.5-787.5 μg/mL（r=0.999 6），10.9-54.5 μg/mL（r=0.999 6）and 8.9-44.5 μg/mL（r= 0.999 5），whose average recoveries were 98.87％，98.56％ and 98.91％ with the RSDs of 1.7％，2.4％ and 2.5％（n =5），resPective1y.C0NCLUSI0N Besides the strong sPecificity and good reProducibi1ity，thismethod is easy to oPerate in terms of effective qua1ity survei11ance of Bunao Soft CaPsu1es.

KEYW 0RDS: Bunao Soft CaPsu1es；Paeonif1orin；feru1ic acid；ca1ycosin-7-O-β-D-g1ycoside；thin-1ayer chromatograPhy（TLC）；high Performance 1iquid chromatograPhy（HPLC）

補(bǔ)腦膏是我院自制制劑（注冊(cè)號(hào)甘藥制字Z04000828），由夏勇潮醫(yī)師在古方“佛手方（當(dāng)歸、川芎）”的基礎(chǔ)上，合用黃芪、赤芍、補(bǔ)骨脂、枸杞、淫羊藿、龜板、水蛭、仙靈脾、益母草、仙茅、黃精、甘草制成（專利號(hào)ZL961222654，國(guó)際專利主分類號(hào)A61K35/78），具有益氣養(yǎng)血、填精補(bǔ)髓、化瘀通絡(luò)功效，用于腦外傷性神經(jīng)損傷及后遺癥，腦炎、腦膜炎后遺癥，動(dòng)脈硬化性腦損害，腦、脊髓變性性疾病，弱智兒童及腦性癱瘓等癥的治療［1］，臨床應(yīng)用幾十年，效果良好。在前期研究過程中，已將其劑型改進(jìn)成軟膠囊，為了更好地控制其質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)采用薄層色譜（TLC）法，對(duì)川芎、當(dāng)歸、補(bǔ)骨脂藥材進(jìn)行定性鑒別，再采用高效液相色譜（HPLC）法，對(duì)方中赤芍主要成分芍藥苷［2-5］、黃芪主要成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷［6-8］、當(dāng)歸與川芎主要成分阿魏酸［9-14］同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，為該制劑的進(jìn)一步開發(fā)研究提供技術(shù)支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters高效液相色譜儀，包括Waters 1525泵、Waters 717進(jìn)樣器、Waters 2487雙通道紫外檢測(cè)器；HS6150超聲波清洗儀（天津恒奧科技發(fā)展有限公司）；Mett1er AE240電子天平（萬(wàn)分之一，德國(guó)賽多利斯公司）；D6B/20-002A電熱干燥箱；薄層板（自制）。

1.2 試藥 當(dāng)歸、川芎、黃芪、赤芍等14味藥材購(gòu)自蘭州安泰堂中藥飲片有限公司，經(jīng)甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院宋平順主任藥師鑒定為正品。芍藥苷（批號(hào)110736-200629）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號(hào)111920-201304）、阿魏酸（批號(hào)110773-200611）對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院）。乙腈、甲醇為色譜純（天津光復(fù)精細(xì)化工研究所）；其他試劑均為分析純；水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 當(dāng)歸、川芎的鑒別［15]取軟膠囊內(nèi)容物20粒，剪碎，精密稱取4.0 g，加1％碳酸氫鈉50 mL，超聲20 min，取上清液，用鹽酸調(diào)節(jié)PH至2～3，乙醚萃取2次，每次20 mL，合并萃取液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為供試品溶液。取阿魏酸對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg原料的溶液，作為對(duì)照品溶液。取缺當(dāng)歸、川芎藥材的陰性制劑，同法制成陰性對(duì)照溶液。吸取上述溶液各10 μL，分別點(diǎn)于以CMC-Na為黏合劑的同一硅膠G薄層板上，以苯-乙酸乙酯-冰乙酸（5∶3∶0.1）為展開劑展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視，結(jié)果見圖1。由圖可知，供試品色譜在與對(duì)照藥材同一位置處顯相同熒光斑點(diǎn)，而陰性樣品不顯示。

2.2 補(bǔ)腦軟膠囊中補(bǔ)骨脂的鑒別［15]取軟膠囊內(nèi)容物20粒，剪碎，精密稱取4.0 g，加乙酸乙酯20 mL，超聲處理15 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL溶解，作為供試品溶液。取補(bǔ)骨脂0.36 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再根據(jù)處方，制備缺補(bǔ)骨脂的陰性樣品溶液。按照薄層色譜法（附錄ⅥB），吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于以CMC-Na為黏合劑的同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（5∶1）為展開劑展開，取出，晾干，噴以10％氫氧化鉀-甲醇溶液，置紫外光燈（365 nm）下檢視，結(jié)果見圖1。由圖可知，供試品色譜在與對(duì)照藥材相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，而陰性樣品不顯示。

A.3-阿魏酸 1、2、4-補(bǔ)腦軟膠囊 5-陰性制劑 B.3-補(bǔ)骨脂 1、2、4-補(bǔ)腦軟膠囊 5-陰性制劑A.3-feru1ic acid 1，2 and 4-Bunao Soft CaPsu1es 5-negative samP1e B.3-Psoralea corylifolia 1，2 and 4-Bunao Soft CaPsu1es 5-negative samP1e圖1　當(dāng)歸、川芎、補(bǔ)骨脂T L C色譜圖Flg.1 TLC chromatograms of Angelica sinensis，Ligusticum chuanxiong and Psoralea corylifolia

2.3 含有量測(cè)定

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) Waters Symmetry Shie1d-C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1％磷酸（B）（16∶84）；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm；柱溫室溫；進(jìn)樣量10 μL。在該色譜條件下，供試品中其他成分與芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸均分離良好，陰性樣品在對(duì)照品出峰處無(wú)干擾，表明專屬性良好。結(jié)果見圖2。

A.對(duì)照品 B.樣品 C.陰性制劑A.reference substances B.samP1es C.negative samP1e1.芍藥苷 2.毛蕊異黃酮葡萄糖苷 3.阿魏酸1.Paeonif1orin 2.ca1ycosin-7-O-β-D-g1ycoside 3.feru1ic acid圖2　高效液相色譜圖Flg.2 HPLC chromatogram s

2.3.2 溶液制備

2.3.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸對(duì)照品適量，加甲醇溶解，稀釋至刻度，制成每1 mL含芍藥苷1.575 mg，毛蕊異黃酮葡萄糖苷1.09 mg，阿魏酸0.89 mg的儲(chǔ)備液，即得。

2.3.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取補(bǔ)腦軟膠囊內(nèi)容物4.0 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，加石油醚30 mL，超聲（300 W、25 kHz）處理10 min，棄去石油醚液，殘?jiān)蛹状?0 mL，20℃超聲（300 W、25 kHz）處理2次，每次30 min，過濾。合并濾液，減壓回收甲醇，殘?jiān)眉状既芙猓D(zhuǎn)移至10 mL量瓶中定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2.3 陰性樣品制備 按補(bǔ)腦軟膠囊的處方比例，稱取除當(dāng)歸、川芎、黃芪、赤芍外的其余藥味，根據(jù)制備工藝制得陰性樣品，按“2.3.2.2”項(xiàng)下方法制得陰性對(duì)照液。

2.3.3 線性關(guān)系考察 取“2.3.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，甲醇稀釋后制得每1 mL含芍藥苷157.5、315.0、472.5、630.0、787.5 μg，含毛蕊異黃酮葡萄糖苷10.9、21.8、32.7、43.6、54.5 μg，含阿魏酸8.9、17.8、26.7、35.6、44.5 μg的標(biāo)樣溶液，進(jìn)樣10 μL，每個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)樣3次，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程分別為Y=9.00×105X-5.01×105，r=0.999 6；Y=2.00×107X-1.46×107，r=0.999 6；Y=2.00×107X+2.04×107，r=0.999 5，表明芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸線性關(guān)系良好。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果，芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸的RSD分別為0.9％、1.1％、0.8％，表明儀器精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一批號(hào)（140306）供試品溶液，分別在0、4、8、12、18、24 h進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積。結(jié)果，芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸的RSD分別為1.3％、0.9％、1.4％，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次（140306）樣品，按“2.3.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，精密吸取10 μL，測(cè)定峰面積。結(jié)果，芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸的RSD分別為1.6％、1.2％、1.7％，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取含有量已知的補(bǔ)腦軟膠囊內(nèi)容物2.0 g（芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸的含有量分別為1.75、0.048、0.079 mg/g），分別加入1.75、1.09、0.89 mg/mL的芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸對(duì)照品溶液1.8、0.080、0.2 mL，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備溶液，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests

2.3.8 樣品測(cè)定 精密稱取補(bǔ)腦軟膠囊內(nèi)容物（140306、140520、140617）4.0 g，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以“2.3.3”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各成分含有量。結(jié)果見表2。

表2　樣品測(cè)定結(jié)果Tab.2 Determ lnatlon results of sam p les

3 討論

在190～800 nm范圍內(nèi)，分別對(duì)芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)其最大吸收波長(zhǎng)分別為230、260、316 nm。其中在260 nm處，芍藥苷、阿魏酸的吸收度均小于230 nm；在316 nm處，芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的吸收度均小于230、260 nm；在230 nm處，毛蕊異黃酮葡萄糖苷的吸收度與260 nm處基本一致，故在230 nm下對(duì)軟膠囊中3種有效成分的含有量進(jìn)行測(cè)定。另外，選取甲醇-酸、乙腈-酸流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)阿魏酸為酸性物質(zhì)，在乙腈-0.1％磷酸等度洗脫系統(tǒng)條件下，3個(gè)有效成分與相鄰色譜峰均能完全分離，故選擇乙腈-磷酸系統(tǒng)作為流動(dòng)相［4］。

軟膠囊內(nèi)容物中含有蜂蠟、司盤-80、大豆油等脂溶性物質(zhì)，如直接用甲醇超聲處理提取后進(jìn)樣，樣品在放置過程時(shí)，容器壁有脂溶性物質(zhì)的析出，影響其測(cè)定。因此，先用石油醚將此類成分去除，再用甲醇超聲提取。由于2種方法所測(cè)得3種有效成分的峰面積無(wú)差異，故選擇先用石油醚處理，再用甲醇處理的樣品制備方式。同時(shí)，對(duì)超聲次數(shù)進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)超聲提取2次與3次相比較，峰面積差異小于5％，故選擇超聲2次作為樣品處理方式。

在當(dāng)歸、川芎薄層色譜鑒別方法中，本實(shí)驗(yàn)嘗試環(huán)己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（4∶1∶1∶0.5）、甲苯-乙酸乙酯-冰乙酸（4∶1∶0.1）等展開系統(tǒng)，但均未將阿魏酸與相鄰斑點(diǎn)分離，而在苯-乙酸乙酯-冰乙酸（5∶3∶0.1）展開系統(tǒng)下，阿魏酸薄層斑點(diǎn)清晰，而且專屬性強(qiáng)。

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作者簡(jiǎn)介:李喜香（1968—），女，主任中藥師，從事中藥制劑研發(fā)工作。Te1: 15002550389，E-mai1: Lixixiang929@163.com

基金項(xiàng)目:蘭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012-2-78）

收稿日期:2015-06-12

中圖分類號(hào):R927.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1001-1528（2016）02-0321-05