HPLC法同時(shí)測(cè)定復(fù)方天麻鉤藤口腔崩解片中3種成分

李欽青， 柴金苗， 郭 蕾

（山西中醫(yī)學(xué)院，山西晉中030619）

?

HPLC法同時(shí)測(cè)定復(fù)方天麻鉤藤口腔崩解片中3種成分

李欽青， 柴金苗， 郭 蕾*

（山西中醫(yī)學(xué)院，山西晉中030619）

摘要:目的 采用HPLC法同時(shí)測(cè)定復(fù)方天麻鉤藤口腔崩解片（天麻、鉤藤、白芍、當(dāng)歸）中天麻素、芍藥苷和阿魏酸的含有量。方法 該藥物50％甲醇提取物的分析采用C18反相色譜柱；流動(dòng)相為乙腈-0.1％磷酸水溶液，梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm（天麻素、芍藥苷）和320 nm（阿魏酸）。結(jié)果 天麻素、芍藥苷、阿魏酸分別在0.153～1.377 μg、0.298 6～2.687 4 μg、0.022 68～0.204 12 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均回收率分別為98.4％、97.9％、97.4％。結(jié)論 該方法可用于復(fù)方天麻鉤藤口腔崩解片的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞:復(fù)方天麻鉤藤口腔崩解片；天麻素；芍藥苷；阿魏酸；HPLC

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.017

KEY W 0RDS: Fufang Tianma Gouteng Ora11y Disintegrating Tab1ets；gastrodin；Paeonif1orin；feru1ic acid；high Performance 1iquid chromatogram（HPLC）

復(fù)方天麻鉤藤口腔崩解片是根據(jù)臨床有效方劑研制而來，主要由天麻、鉤藤、白芍、當(dāng)歸等藥味組成，具有通絡(luò)止顫、養(yǎng)血斂陰、平肝潛陽、息風(fēng)止痙等功效。目前，應(yīng)用HPLC法測(cè)定中藥復(fù)方中的天麻素、芍藥苷和阿魏酸的文獻(xiàn)較多［1-4］，但對(duì)三者的同時(shí)測(cè)定尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法，同時(shí)測(cè)定復(fù)方天麻鉤藤口腔崩解片中天麻素、芍藥苷、阿魏酸的含有量，可為更好地評(píng)價(jià)該藥物提供一定參考。

1 藥物、試劑與儀器

復(fù)方天麻鉤藤口腔崩解片（自制，批號(hào)20120301、20120302、20120303）。天麻素（批號(hào)110807-200205）、芍藥苷（批號(hào)110736-200833）、阿魏酸（批號(hào)110773-200611）對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院）。乙腈為色譜純；水為純化水；其他試劑均為分析純。

Agi1ent1200高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；PL6001-S、AL204、AB135-S電子天平（瑞士Mett1er To1edo公司）；KQ-500E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Kromasi1C18色譜柱（4.6 mm× 200 mm，5 μm）；0.05％磷酸溶液（A）-乙腈（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0→10 min，3％ B；10→12 min，3％→14％B；12→40 min，14％B）；檢測(cè)波長(zhǎng)為0→28 min時(shí)230 nm（天麻素、芍藥苷），28→40 min時(shí)320 nm（阿魏酸）；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；柱溫30℃。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取天麻素、芍藥苷和阿魏酸對(duì)照品適量，加50％甲醇制成對(duì)照品貯備液（天麻素質(zhì)量濃度為765 μg/mL、芍藥苷質(zhì)量濃度為1 493 μg/mL、阿魏酸質(zhì)量濃度為113.4 μg/mL）。精密量取1.0 mL，置于25 mL棕色量瓶中，加50％甲醇至刻度，搖勻，即得（天麻素質(zhì)量濃度為30.6 μg/mL、芍藥苷質(zhì)量濃度為59.72 μg/mL、阿魏酸質(zhì)量濃度為4.536 μg/mL）。2.3 供試品溶液的制備 取復(fù)方天麻鉤藤口腔崩解片（20120301）10片，研細(xì)，精密稱取1 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入50％甲醇50 mL，稱定重量，超聲（250 W、40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，50％甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性供試品溶液的制備 按復(fù)方天麻鉤藤口腔崩解片的生產(chǎn)工藝，分別制備缺天麻、白芍、當(dāng)歸的陰性制劑，缺天麻的陰性制劑，缺白芍的陰性制劑，缺當(dāng)歸的陰性制劑，并按“2.3”項(xiàng)下方法制備陰性供試品溶液，HPLC色譜圖見圖1。

1.天麻素 2.芍藥苷 3.阿魏酸1.gastrodin 2.Paeonif1orin 3.feru1ic acid圖1　HPLC色譜圖Flg.1 HPLC chromatogram s

2.5 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL，置于50 mL量瓶中，加50％甲醇至刻度，搖勻，分別進(jìn)樣10 μL，測(cè)得峰面積，計(jì)算回歸方程。結(jié)果表明，天麻素、芍藥苷和阿魏酸分別在0.153～1.377 μg、0.298 6～2.687 4 μg、0.022 68～0.204 12 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程分別為y=2 272.3 x-6.561（r=0.999 9）、y=2 782.2 x+ 5.929 5（r=0.999 95）、y=4 991.2x-0.638（r=0.999 9）。

2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果，三者RSD分別0.43％、0.62％、0.56％，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3”項(xiàng)下供試品溶液，分別于0、1、2、4、6、8 h在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定6次。結(jié)果，三者RSD分別0.59％、0.68％、0.73％，表明溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定。結(jié)果，三者RSD分別1.2％、1.1％、1.5％，表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收試驗(yàn) 取復(fù)方天麻鉤藤口腔崩解片（20120301）30片（天麻素、芍藥苷、阿魏酸的含有量分別為0.78、4.71、0.074 mg/mL），研細(xì)，精密稱取6份，每份0.5 g，置于具塞錐形瓶中，每份分別加入78.5 μg/mL天麻素對(duì)照品5 mL、465.8 μg/mL芍藥苷對(duì)照品5 mL、7.3 μg/mL阿魏酸對(duì)照品5 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算平均加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1　回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests

2.10 含有量測(cè)定 取3批樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，每批樣品平行3次，記錄峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算天麻素、芍藥苷和阿魏酸的含有量，結(jié)果見表2。

表2　3種成分含有量測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab.2 Determ lnatlon results of the contents of three constltuents（n=3）

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法的考察 參考文獻(xiàn)［5-6］，分別采用50％、70％、100％甲醇，進(jìn)行超聲以及加熱回流提取。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用50％甲醇，超聲提取30 min時(shí)效果最好。

3.2 流動(dòng)相的選擇 參考文獻(xiàn)［7-9］，采用梯度洗脫分離多個(gè)成分，以節(jié)省分析時(shí)間。另外，考察不同比例的乙腈-磷酸、甲醇-磷酸溶液系統(tǒng)，最終確定以乙腈-0.05％磷酸溶液為流動(dòng)相。在該梯度洗脫系統(tǒng)下，樣品中天麻素、芍藥苷和阿魏酸的分離度好，出峰時(shí)間較快。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 參考文獻(xiàn)［10-11］，采用紫外檢測(cè)器，在230 nm處檢測(cè)天麻素、芍藥苷，在320 nm處檢測(cè)阿魏酸，發(fā)現(xiàn)這3種成分的分離度、峰形均較好。另外，天麻素的檢測(cè)波長(zhǎng)亦可以選擇在220 nm處［12-13］，此時(shí)三者均有最大的響應(yīng)值，但雜質(zhì)峰也較大。因此，檢測(cè)波長(zhǎng)最終確定為230 nm（天麻素、芍藥苷）、320 nm（阿魏酸）。

參考文獻(xiàn):

［1］ 孔 銘，朱玲英，王佩娟，等.HPLC測(cè)定補(bǔ)腎活血顆粒中芍藥苷，阿魏酸，淫羊藿苷的含量［J］.中成藥，2010，32（4）: 600-603.

［2］ 王世祥，王曉雯，高志娟，等.HPLC法測(cè)定活血膠囊中芍藥苷、苦杏仁苷、川芎嗪和阿魏酸［J］.中成藥，2011，31（4）: 619-622.

［3］ 曹緯國，陶燕鐸，談利紅，等.HPLC法測(cè)定頸?？诜褐刑炻樗睾蜕炙庈蘸浚跩］.中藥新藥與臨床藥理，2014，25（6）: 743-746.

［4］ 趙 輝，武曉紅，蒲曉輝.HPLC法同時(shí)測(cè)定天舒膠囊中阿魏酸和天麻素［J］.中成藥，2014，36（1）: 111-114.

［5］ 劉亞蓉，宋 霞，劉海青.雙波長(zhǎng)RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定婦科十味片中芍藥苷、阿魏酸［J］.中成藥，2013，35 （6）: 1222-1224.

［6］ 張暉芬，陳曉輝，霍艷雙，等.RP-HPLC雙波長(zhǎng)切換法同時(shí)測(cè)定天舒膠囊中天麻素、阿魏酸和6，7-二羥基藁本內(nèi)酯的含量［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，29（6）: 443-447.

［7］ 劉 峰.HPLC法測(cè)定天麻眩暈寧合劑中天麻素和芍藥苷含量［J］.藥學(xué)研究，2014，33（7）: 386-388.

［8］ 季寧平，徐曉秋，傅超美，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定艾附暖宮丸中芍藥苷、阿魏酸和川續(xù)斷皂苷VI［J］.中成藥，2015，37（3）: 534-537.

［9］ 董娟妮，閆高穎，楊 洋，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定樂脈膠囊中9種成分［J］.中成藥，2013，35（12）: 2644-2649.

［10］ 李中娥，王春穎.HPLC同時(shí)測(cè)定婦康片中芍藥苷和阿魏酸的含量［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（10）: 143-145.

［11］ 梁娟娟，高慧敏，陳兩綿，等.HPLC同步測(cè)定天舒膠囊3種成分的含量［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19 （17）: 81-84.

［12］ 鄧曉鴻，茍 琰，李 萍，等.HPLC測(cè)定天舒片中的天麻素和阿魏酸含量［J］.華西藥學(xué)雜志，2014，29（4）: 474-475.

［13］ 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典: 2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010: 519-520，522，698.

Slmultaneous determ lnatlon of three constltuents ln Fufang Tlanma Gouteng 0 rally Dlslntegratlng Tablets by HPLC

LIQin-qing， CHAIJin-miao， GUO Lei*
（Shanxi College of Traditional Chinese Medicine，Jinzhong 030619，China）

ABSTRACT:AIM To deve1oP an HPLCmethod for simu1taneous1y determining the contents of gastrodin，Paeonif1orin and feru1ic acid in Fufang Tianma Gouteng Ora11y Disintegrating Tab1ets（Gastrodiae Elatae Rhizoma，Uncariae Ramulus cum Uncis，Paeoniae Lactilorae Radix and Angelicae Sinensis Radix）.METH 0DS The ana1ysis of 50％ methano1ic extract of this drugwas Performed on C18ODS co1umn，mobi1e Phasewas acetonitri1e-0.1％ PhosPhoric acid with gradient e1ution，and detection wave1engthswere set at230 nm for gastrodin and Paeonif1orin，and 320 nm for feru1ic acid.RESULTS Gastrodin，Paeonif1orin and feru1ic acid disP1ayed good 1inear re1ationshiPswithin the ranges of0.153 -1.377 μg，0.298 6 -2.687 4 μg and 0.022 68 -0.204 12 μg，and their average recoverieswere 98.4％，97.9％ and 97.4％，resPective1y.C0NCLUSI0N Thismethod can be aPP1ied to the qua1ity contro1of Fufang Tianma Gouteng Ora11y Disintegrating Tab1ets.

*通信作者:郭 蕾（1968—），女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，從事中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究。Te1:（0351）3179842，E-mai1: g1qz1123@ 163.com

作者簡(jiǎn)介:李欽青（1978—），男，碩士，講師，從事中藥藥效物質(zhì)及新藥研究。Te1:（0351）3179903，E-mai1: 1qq1qq@126.com

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81173165）；太原市科學(xué)技術(shù)局資助項(xiàng)目（11014918）

收稿日期:2015-09-25

中圖分類號(hào):R927.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1001-1528（2016）02-0315-04