胡楊根際可培養(yǎng)細菌的分離及抑制瓜列當種子萌發(fā)研究

王寧 包慧芳 崔華星 侯敏 龍宣杞 詹發(fā)強 楊蓉 艾尼江·爾斯?jié)M 史應(yīng)武

摘要 從胡楊生存的干旱強光照逆境中獲得新的細菌資源，從中篩選新的可抑制瓜列當種子萌發(fā)的生防菌。采用3種分離培養(yǎng)基，以稀釋涂布法對塔里木河流域3處胡楊根系樣品進行可培養(yǎng)細菌分離，通過分析分離菌株16S rRNA基因序列確定其種屬分類。采用皿內(nèi)培養(yǎng)法測定其對瓜列當種子萌發(fā)的抑制活性，利用盆栽試驗檢測分離菌株M2-3對瓜列當寄生的防治效果。結(jié)果分離獲得98株細菌，分屬于28個屬，馬賽菌屬Massilia、Pontibacter、玫瑰單胞菌屬Roseomonas為優(yōu)勢菌屬。其中，菌株M2-3與Pontibacter salisaro? HMC5104T的相似度最高，為9792%，其菌體發(fā)酵液10倍稀釋液對瓜列當種子萌發(fā)抑制率為87.8%，盆栽試驗表明該菌株對瓜列當防效可達369%，具備進一步開發(fā)可能性。

關(guān)鍵詞 胡楊; 根系微生物; 瓜列當; 種子萌發(fā)

中圖分類號： S 476

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020493

Isolation of culturable bacteria from the rhizosphere of Populus euphratica? and inhibition activity on the seed germination of Orobanche aegyptiaca

WANG Ning， BAO Huifang， CUI Huaxing， HOU Min， LONG Xuanqi， ZHAN Faqiang，

YANG Rong， AINJIANG Osman*， SHI Yingwu*

（Institute of Applied Microbiology， Xinjiang Academy of Agricultural Sciences， Xinjiang Key Laboratory of Special

Environmental Microbiology， Urumqi 830091， China）

Abstract

New bacterial resources were obtained from the drought and high light environment where Populus euphratica grows and new biocontrol resources for inhibiting the seed germination of Orobanche aegyptiaca were screened. Culturable bacteria were isolated from three P.euphratica root samples in Tarim River basin by dilution plating method and identified by 16S rRNA gene sequence analysis. In vitro culture method was used to determine the inhibition activity on the seed germination of O.aegyptiaca. Pot experiment was used to detect the control effect of M2-3 against the parasitism of O.aegyptiaca. Results showed that 98 bacteria strains were isolated， belonging to 28 genera， among which Massilia， Pontibacter and Roseomonas? were the dominant bacteria.The similarity between strain M2-3 and Pontibacter salisaro strain HMC5104T was 97.92%.The inhibiting rate of 10-fold diluted fermentation filtrate on seed germination of O.aegyptiaca was 87.8%， and the control efficacy was up to 36.9%. The strain M2-3 had the potential for further development.

Key words

Populus euphratica; root microorganism; Orobanche aegyptiaca; seed germination

瓜列當Orobanche aegyptiaca Pers.又稱分枝列當，是列當科Orobanchaceae列當屬Orobanche一年生全寄生性植物，由于沒有葉綠素，不能進行光合作用，其真根退化為吸盤，與寄主植物的根系相連，利用寄主的營養(yǎng)物質(zhì)與水分進行異養(yǎng)生長[1]。作為一種惡性雜草，瓜列當不僅直接影響作物的長勢和產(chǎn)量，由于其對寄主光合作用與激素平衡等生理的負面影響，還易導(dǎo)致其他病害的發(fā)生。瓜列當在世界各地普遍發(fā)生，主要寄生番茄、哈密瓜、西瓜、甜瓜，其次是向日葵、葫蘆、胡蘿卜、白菜以及一些雜草，已成為農(nóng)業(yè)種植體系中的嚴重公害[2-3]。

由于列當?shù)募纳Ｊ綖榈叵录纳⑶彝闹髦参锔抵苯酉噙B，因此常規(guī)除草劑很難直接與其地下部接觸。目前，尚無針對列當專一性強且適用于大規(guī)模推廣應(yīng)用的防除措施[4]。由于綠色環(huán)保越來越引起關(guān)注和重視，利用微生物進行列當雜草防除的研究日益增多。已經(jīng)報道的具有防除列當潛能的微生物主要分離自列當病原菌、寄主植物共生菌和其他微生物，包括鐮刀菌Fusarium spp.、根瘤菌Rhizobium spp.、洋蔥曲霉Aspergillus alliaceus、叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi）、假單胞菌Pseudomonas spp.、芽胞桿菌Bacillus spp.等[5]。由于目前開發(fā)的生防菌有些引起寄主植物產(chǎn)生病害，有些防效不穩(wěn)定，利用特定生境開展新型抗瓜列當生防資源收集迫在眉睫[6]。

胡楊是位于新疆塔里木河流域的珍貴森林資源，是唯一一種能夠生長于干旱、半干旱地區(qū)的喬木植物，具有很高的耐旱耐鹽性[7]。胡楊根際土壤作為一種特殊環(huán)境，其微生物群落結(jié)構(gòu)研究逐漸成為熱點[8]，胡楊與列當屬一些野生種生存環(huán)境相似，且其根際生防菌資源及活性物質(zhì)尚未被充分挖掘與研究，本研究從新疆塔里木河胡楊林地根圍土收集寡營養(yǎng)、抗逆性強的細菌資源用于抗瓜列當種子萌發(fā)試驗，初步研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 根圍土樣品采集

菌株分離用根圍土（深度5～20 cm），

采集自塔里木河天然胡楊林，3份樣品均存于無菌紙袋內(nèi)存放于4℃。采樣信息見表1。

1.1.2 培養(yǎng)基

R2A培養(yǎng)基：酵母浸出粉0.5 g/L，蛋白胨0.5 g/L，酪蛋白水解物0.5 g/L，葡萄糖0.5 g/L，可溶性淀粉0.5 g/L，K2HPO4 0.3 g/L，MgSO4 0.024 g/L，丙酮酸鈉0.3 g/L，瓊脂15.0 g/L，pH（7.2±02）。TSA培養(yǎng)基：胰蛋白胨15 g/L，大豆胨5 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂15 g/L，pH（7.3±0.2）。MA培養(yǎng)基： MgCl2 5.9 g/L，Na2HPO4 8.0 mg/L，CaCl2 18 g/L，MgSO4 3.2 g/L，Na2O·mSiO2 4.0 mg/L，H3BO3 22 mg/L，SrCl2 34 mg/L，NH4NO3 1.6 mg/L，NaF 2.4 mg/L，F(xiàn)eC6H5O7 0.1 g/L，NaHCO3? 0.16 mg/L，KBr 0.55 g/L，NaCl 19.45 g/L，酵母提取物 1.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，pH（7.2±02）。 上述3種培養(yǎng)基用于可培養(yǎng)細菌的分離純化及后續(xù)繼代培養(yǎng)。

1.1.3 主要試劑和儀器

引物 27F/1492R、PCR mix kit 購自生工生物工程（上海）股份有限公司;細菌基因組 DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司;獨腳金內(nèi)酯人工合成類似物（GR24），購自北京酷來搏科技有限公司。

儀器：超凈工作臺SW-CJ-2F，上海博迅實業(yè)有限公司;恒溫培養(yǎng)箱 BI-250A，施都凱儀器設(shè)備有限公司;振蕩式搖床 ZWY-2102C，上海智城分析儀器制造有限公司;高速離心機 H1650，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;PCR 擴增儀 T100、凝膠成像儀Gel DocTMXR+，Bio-Rad;顯微鏡SZ61，奧林巴斯（深圳）工業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離

將1 g新鮮土壤樣品加入裝有9 mL滅菌生理鹽水的試管中，150 r/min振蕩20 min，吸取1 mL土壤懸液進行10倍梯度稀釋，取10-2、10-3、10-4、10-5稀釋液0.1 mL分別涂布于3種分離培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)30 d，從第7天開始，每日挑取新出現(xiàn)的菌落用相同的分離培養(yǎng)基進行純化，純化后的菌株置于甘油中保藏，存放于-80℃冰箱。

1.2.2 菌株的分類鑒定及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

利用細菌基因組DNA提取試劑盒提取分離菌株的基因組DNA，采用16S rRNA特異性引物進行PCR擴增。引物序列為27F： 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′， 1429R： 5′-AAGGATGGTGATGCCGCA-3′。PCR擴增體系（50 μL）：PCR mix 25 μL，ddH2O 17 μL，DNA模板4 μL，10 μmol/L引物各2 μL。擴增程序為：95℃ 5 min;94℃ 45 s，56℃ 45 s，72℃ 2 min，30個循環(huán)。利用0.8% 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，將1 600 bp處可觀察到條帶的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。利用Eztaxon 數(shù)據(jù)庫（https：∥www.ezbiocloud.net）對測序結(jié)果進行同源比對。挑選與之同源性高的模式菌株16S rRNA序列，比較其與參試菌株的序列相似性。利用 MEGA 6.0軟件，采用鄰接法（neighbor-joining）進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建及多樣性分析，自展值（bootstrap）為1 000。

1.2.3 瓜列當種子的預(yù)培養(yǎng)

將瓜列當種子依次在1.0%（m/V）次氯酸鈉溶液和75%乙醇中超聲清洗5 min和1 min進行表面消毒。用無菌生理鹽水沖洗3遍后置于超凈工作臺內(nèi)自然晾干。將直徑為80 mm的玻璃纖維濾紙片擺放于事先鋪有2層普通定性濾紙的培養(yǎng)皿（直徑9.0 cm）中，隨后將晾干的瓜列當種子均勻置于玻璃纖維濾紙片中央，每張濾紙片上約30～60粒。將上述培養(yǎng)皿封口，保持一定濕度，置于25℃的黑暗環(huán)境培養(yǎng)5 d待用。

1.2.4 菌株無細胞發(fā)酵液制備

將待測菌株分別接種于R2A、MA和TSA培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h。挑取已活化菌株轉(zhuǎn)接于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，于37℃，150 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)，同時以空白培養(yǎng)基為對照。振蕩培養(yǎng)18 h后，每瓶取30 mL培養(yǎng)液5 500 r/min，離心7 min。離心后的上清液經(jīng)045 μm的微孔濾膜過濾，過濾后的上清液即為無細胞發(fā)酵濾液。

1.2.5 菌株發(fā)酵液對瓜列當種子萌發(fā)抑制試驗

將預(yù)培養(yǎng)的鋪有瓜列當種子的玻璃纖維濾紙片轉(zhuǎn)移至新滅菌培養(yǎng)皿中，依次添加30 μL 10倍稀釋的發(fā)酵濾液和30 μL0.1 mg/L獨角金內(nèi)酯類似物GR24（上海源葉生物科技有限公司）。培養(yǎng)皿中間放1張對折3次的濕潤定性濾紙保濕，然后用封口膜將培養(yǎng)皿封口。分別以添加無菌水和只加0.1 mg/L GR24 為陰性和陽性對照，各處理重復(fù)6次。隨后將培養(yǎng)皿放入25℃黑暗環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)。7 d后，用體視顯微鏡觀察并記錄瓜列當種子萌發(fā)數(shù)量和種子總數(shù)，利用公式（1）和（2）計算萌發(fā)率和萌發(fā)抑制率。

GR=[（GN-GH）/（GT-GH）]×100%（1）

式中GR為萌發(fā)率，GN為處理列當種子萌發(fā)數(shù)量，GT為列當種子總數(shù)， GH為無菌水處理列當種子萌發(fā)數(shù)量。

IR=（GRT-GRN）/GRT×100%（2）

式中IR為萌發(fā)抑制率，GRN為處理列當種子萌發(fā)率，GRT為對照中列當種子萌發(fā)率。

1.2.6 菌株M2-3對瓜列當?shù)呐柙苑佬?/p>

培養(yǎng)土配制：將本地農(nóng)田土壤過孔徑0.5 cm篩網(wǎng)，將過篩土壤、草炭和蛭石按照2∶1∶1的體積比配制。接種土配制：每千克培養(yǎng)土添加0.20 g瓜列當種子，邊加種子邊翻動土壤，確保混勻。取100 g接種土放于7 cm×7 cm×11 cm的營養(yǎng)缽中，將長勢一致的4～6葉番茄苗移入營養(yǎng)缽中，每個營養(yǎng)缽移栽2株苗。采用灌根方式于移栽當日、移栽后15、30 d將濃度為1×107? cfu/mL M2-3菌液5 mL澆入營養(yǎng)缽內(nèi)，對照組加入等量清水，每處理設(shè)10個重復(fù)，按需澆水、施肥，并于移栽后35 d統(tǒng)計瓜列當寄生數(shù)量，依據(jù)公式（3）計算寄生強度，公式（4）計算防除效果。

PF=NO/NT（3）

式中PF為寄生強度，NO為瓜列當寄生數(shù)量，NT為番茄株數(shù)。

CE=（CPF-DPF）/CPF×100%（4）

式中CE為防除效果，CPF為對照寄生強度，DPF為處理寄生強度。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離

土壤樣品采自塔里木河流域天然胡楊林，3份樣品均為胡楊根系5～20 cm地下淺層土。利用3種分離培養(yǎng)基進行可培養(yǎng)細菌的純化。所分離細菌以白色、紅色、黃色居多，根據(jù)顏色、形狀、大小、光滑度等特征進行初步去重整理。結(jié)果共分離到98株細菌，其中分離自樣點3的菌株數(shù)最多，共35株，占比 35.7%，分離自樣點1的菌株數(shù)最少，為30株，占比30.6%。

2.2 菌株鑒定及細菌多樣性分析

對所分離的菌株進行16S rRNA擴增、測序及序列比對，利用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。 結(jié)果表明，98株細菌分屬于20個科28個屬，以草酸桿菌科Oxalobacteraceae為主，其次為Hymeno-bacteraceae、醋酸桿菌科Acetobacteraceae，3個科總占比高達48.0%。

為從樣品中獲得更多的細菌種屬，本試驗采用MA、R2A、TSA 3種培養(yǎng)基進行分離，此類培養(yǎng)基多用于鹽堿環(huán)境及寡營養(yǎng)環(huán)境細菌的分離，純化菌株分別以3類培養(yǎng)基首字母命名。結(jié)果表明，馬賽菌屬Massilia、Pontibacter和玫瑰單胞菌屬Roseomonas為優(yōu)勢菌屬。鞘氨醇盒菌屬Sphingopyxis、馬賽菌屬和芽胞桿菌屬Bacillus是3種培養(yǎng)基均能分離到的菌屬，馬賽菌屬也是本次分離菌種數(shù)量最多的屬。MA、TSA培養(yǎng)基均分離到新鞘脂菌屬Novosphingobium，R2A、TSA培養(yǎng)基均分離到假黃單胞菌屬Pseudoxanthomonas、Chitinophaga、玫瑰單胞菌屬、假單胞菌屬Pseudomonas 4個屬的細菌。3種培養(yǎng)基中，TSA分離到的細菌屬最多，有21個屬，R2A分離到9個屬，MA上分離的最少，有8個屬，但菌株M1-1（與Hymenobacteraceae的Pontibacter saemangeumensis 菌株 GCM0142T相似性為95.05%），菌株M2-3（與Pontibacter salisaro 菌株 HMC5104T相似性為97.92%），均從MA培養(yǎng)基上分離得到。

不同樣點分離到的可培養(yǎng)細菌多樣性也存在差異。在門水平，3個采樣點分離的細菌主要分布在變形菌門Proteobacteria，HY1樣點還分離到放線菌門Actinomycetes（133%）、擬桿菌門Bacteroidetes（133%）和厚壁菌門Firmicutes（6.7%）;HY2樣點分離到擬桿菌門（18.2%）、放線菌門（30%）;HY3樣點分離到厚壁菌門（14.3%）、擬桿菌門（14.3%）和放線菌門（5.7%）。在屬水平上，HY1、HY3單獨分離到6個屬，占比分別為20%和17.1%，HY2單獨分離到4個屬，占比12.1%。

2.3 Pontibacter屬菌株抑制瓜列當種子萌發(fā)分析

3個樣點共分離得到10株P(guān)ontibacter屬細菌，將菌株發(fā)酵液稀釋10倍后用于瓜列當種子萌發(fā)抑制試驗，統(tǒng)計結(jié)果見表2。M1-1、M1-2、M2-1、M2-2、M2-5、M3-1的發(fā)酵液可使列當種子萌發(fā)的芽管變黃，但對芽管長度抑制效果不明顯。M2-4、M3-2、M3-3的發(fā)酵液對列當芽管有一定致畸效果，可見芽管長勢不壯。M2-3的發(fā)酵液對列當種子的萌發(fā)抑制率效果最顯著，可達878%，菌株發(fā)酵液作用后部分列當種子仍處于休眠狀態(tài)。部分菌株的萌發(fā)抑制效果見圖2。

2.4 菌株M2-3對瓜列當?shù)呐柙苑佬?/p>

如表3所示，用M2-3菌液對營養(yǎng)缽進行灌根處理，每個營養(yǎng)缽瓜列當寄生數(shù)平均為22.6株，寄生強度較對照下降6.6，防除效果達369%。盆栽試驗結(jié)果表明，M2-3對瓜列當有明顯防除作用（圖3）。

3 討論

本研究對新疆塔里木河流域天然胡楊林的根系土壤樣品進行細菌分離培養(yǎng)，采樣時間為2018年7月，此時氣溫高，光照輻射時間長，蒸騰作用強，利于抗逆微生物的獲得。從3份土壤樣品中分離鑒定出98株細菌，經(jīng)16S rRNA序列比對分析，它們分屬于變形菌門、擬桿菌門、放線菌門和厚壁菌門，此結(jié)果與先前的研究結(jié)果基本一致。程冬梅等[9]對該區(qū)域根際微生物多樣性分析發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、放線菌門和疣微菌門Verrucomicrobiae是主要的微生物門類。許孟博[10]對該區(qū)域的地表層和地表下層土壤微生物多樣性分別進行了研究，結(jié)果表明，二者樣品中微生物種群組成有較大的差別，地表層樣品中的微生物主要包括棲熱-奇球菌門Deinococcus-Thermus、放線菌門和變形菌門，地表下層樣品中的優(yōu)勢種群為厚壁菌門、放線菌門、變形菌門和擬桿菌門。

本次分離到的可培養(yǎng)細菌中，許多屬具有生態(tài)效應(yīng)及應(yīng)用潛能。如3個樣點的主要分離屬馬賽菌屬多與植物有關(guān)，可在土壤和水體中找到，目前有其用于污染物治理和植物促生的報道[11-12]。假黃單胞菌屬在自然界中與氮素轉(zhuǎn)化有關(guān)，是影響NH-N轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵重氮營養(yǎng)群落[13]。HY1、HY3樣點中分離到的Chitinophaga也在植物根系環(huán)境中起到促生作用，近期也有關(guān)于其特有幾丁質(zhì)酶的用途研究[14-15]。Pontibacter屬菌株廣泛存在于海洋、沙漠、農(nóng)田等自然界，隨著微生物分類學(xué)的發(fā)展，該屬中多個種被發(fā)現(xiàn)，Pontibacter aydingkolensis就是本實驗室從艾丁湖沉積層發(fā)現(xiàn)并命名的，但該屬菌株的應(yīng)用潛能尚未充分發(fā)掘[16]。

瓜列當是惡性入侵性根寄生雜草，已報道的可用于瓜列當生物防治的細菌有銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa、熒光假單胞菌P.fluorescens、萎縮芽胞桿菌Bacillus atrophaeus和枯草芽胞桿菌B.subtilis，這些細菌主要在種子萌發(fā)及胚根生長過程起作用[17]。篩選出的Pontibacter屬部分菌株對瓜列當種子萌發(fā)有明顯抑制作用，尤其是M2-3菌株，發(fā)酵液稀釋10倍后對瓜列當種子萌發(fā)抑制率接近90%，盆栽試驗也證明該菌株可減輕瓜列當對寄主番茄的寄生，因此，在該菌株的次生代謝產(chǎn)物中可能有可作為生物農(nóng)藥的先導(dǎo)化合物。

本試驗對胡楊林根際可培養(yǎng)細菌種類進行初步探索，未來可繼續(xù)優(yōu)化培養(yǎng)方案，以期獲

得更多的可培養(yǎng)微生物資源，由于首次發(fā)現(xiàn)Pontibacter屬菌株的除草生防潛能，同屬不同種菌株對瓜列當種子萌發(fā)抑制能力不同，具體田間防效還需后續(xù)試驗驗證。

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（責任編輯：楊明麗）