丹紅注射液預處理對大鼠缺血再灌注心肌細胞損傷的影響

鄭亞萍 韓 坤

漯河醫(yī)學高等?？茖W校生理教研室，河南 漯河 462002

心肌缺血再灌注損傷 （isehemia-reperfusioninjury，I/R）是心臟缺血性疾病及心外術后心肌損害的主要原因，其導致的心肌細胞凋亡被認為是再灌注損傷的重要環(huán)節(jié)。丹紅注射液是由丹參與紅花萃取制備而成，具有保護心血管的作用，已有動物實驗提示丹紅注射液對大鼠離體心臟缺血再灌有保護作用[1]，但其對缺血再灌心肌細胞的直接作用的報道較少。本研究采用心肌細胞缺血再灌注細胞模型，觀察丹紅注射液預處理對其的影響，初步研究其作用的可能機制。

1 儀器與試藥

1.1 實驗動物

出生2～3 d的SD大鼠。

1.2 試劑

丹紅注射液 （濟南步長制藥有限公司，批號：Z20026866），胰蛋白酶、DMEM 培養(yǎng)基（均為 Sigma公司）；胎牛血清（杭州四季青公司），鼠抗橫紋肌肌動蛋白單克隆抗體、抗Bcl-2、抗Bas（均為博士德公司），其余試劑均為市售分析純。

1.3 心肌細胞培養(yǎng)、鑒定

取2～3 d的SD大鼠，在無菌條件下取出心室，剪碎，0.1%胰酶消化，收集細胞，離心，重懸，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育。根據心肌細胞和成纖維細胞貼壁時間不同，采用差速貼壁1.5 h，獲得心肌細胞。免疫組化染色觀察α-橫紋肌肌動蛋白反應。

1.4 缺血再灌注體外模型的建立

將培養(yǎng)的心肌細胞更換無血清培養(yǎng)基，缺氧培養(yǎng)箱（95%N2、5%CO2）中培養(yǎng)3 h后，置10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)9 h。

1.5 實驗分組

將心肌細胞按照2×105/mL均勻的接種于24孔板中，丹紅組分別以2%、4%、8%、16%的給藥濃度[1]，實驗共分6組，每組5個孔，即：①正常對照組（用無胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液）；②缺血再灌注（I/R）組；③I/R+丹紅注射液（2%）組；④I/R+丹紅注射液（4%）組；⑤I/R+丹紅注射液（8%）組；⑥I/R+丹紅注射液（16%）組。

1.6 流式細胞儀檢測凋亡率

0.25 %胰蛋白酶消化各組心肌細胞，用4℃預冷的PBS洗滌2次，離心5 min，重懸細胞，于70%冷乙醇（4℃）過夜。檢測時離心10 min（1 000 r/min），PBS洗去乙醇。細胞沉淀用碘化丙啶（PI）4℃避光染色30 min，上機檢測。G期前的亞二倍體峰即代表凋亡峰，反映凋亡細胞的百分比。

1.7 Bas、Bcl-2基因蛋白表達

各組心肌細胞爬片，固定，在室溫下用3%H2O2處理30 min以滅活過氧化物酶，后加入Bcl-2、Bax抗體4℃過夜，加入沖洗后依次加入1∶100生物素化山羊抗兔IgG和1∶100抗生物素-生物素-過氧化物酶復合物液，DAB染色，復染，脫水，透明后封片。細胞漿顯示棕黃色顆粒細胞為陽性細胞，將玻片于光學顯微鏡下放大200倍，根據陽性細胞分布情況，每片選擇10個視野，每視野計算Bcl-2、Bax蛋白陽性表達的細胞數，以平均計算陽性細胞數所占百分比作為Bcl-2、Bax蛋白蛋白陽性表達指數。

1.8 統計學方法

采用SPSS 11.5軟件包進行統計分析，計量資料數據以均數±標準差（）表示，多組比較采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 光鏡下心肌細胞鑒定結果

心肌細胞鑒定光鏡下觀察，心肌細胞接種72 h可見細胞形態(tài)不規(guī)則，呈梭形，三角形或多邊形，單核，有多個偽足伸出，形成細胞簇；免疫組化染色顯示，α-橫紋肌肌動蛋白呈陽性反應，陽性率達90%以上。

2.2 流式細胞儀檢測結果

結果顯示，缺血再灌組細胞凋亡率表達明顯高于對照組，差異均有高度統計學意義（P＜0.01）；與I/R組比較，用丹紅注射液預處理后呈濃度依賴性地下調凋亡率 （P＜0.05或P＜ 0.01）。 見表 1。

表1 丹紅注射液對心肌細胞凋亡率的影響（，%）

表1 丹紅注射液對心肌細胞凋亡率的影響（，%）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與I/R組比較，#P＜0.05，##P ＜ 0.01

組別 心肌細胞凋亡率正常對照組（n=5）I/R 組（n=5）I/R+丹紅注射液（2%）組（n=5）I/R+丹紅注射液（4%）組（n=5）I/R+丹紅注射液（8%）組（n=5）I/R+丹紅注射液（16%）組（n=5）6.12±1.25 54.18±9.26**42.23±3.57**#36.19±3.82**#29.33±2.85**##19.45±2.53*##

2.3 Bas、Bcl-2 蛋白的表達

結果顯示，缺血再灌組細胞Bas表達明顯高于對照組，Bcl-2表達則顯著低于對照組，差異均有高度統計學意義（均P＜0.01）；而與I/R組相比，用丹紅注射液預處理后呈濃度依賴性的下調凋亡率及Bas表達，上調Bcl-2表達（P＜0.05或P＜0.01）。見表2。

3 討論

缺血心肌的早期再灌注治療能減輕缺血損傷，使細胞凋亡下降，減小梗死面積，缺血較長時間后再灌注反而會引起再灌注損傷，造成細胞凋亡明顯增加，因而心肌細胞凋亡被認為是再灌注損傷的重要環(huán)節(jié)[2]。丹紅注射液目前已用于臨床治療冠心病，且對離體大鼠缺血再灌注損傷的心肌具有保護作用，此作用可能與抑制心肌脂質過氧化、增強抗氧化能力及調控凋亡基因有關[3]。

表2 丹紅注射液對心肌細胞Fas、Bcl-2蛋白表達的影響（，%）

表2 丹紅注射液對心肌細胞Fas、Bcl-2蛋白表達的影響（，%）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與I/R組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 Bas蛋白 Bcl-2蛋白正常對照組（n=5）I/R 組（n=5）I/R+丹紅注射液（2%）組（n=5）I/R+丹紅注射液（4%）組（n=5）I/R+丹紅注射液（8%）組（n=5）I/R+丹紅注射液（16%）組（n=5）5.85±0.94 31.12±5.39**25.46±4.25**#22.14±3.98**#18.45±3.13**##9.45±2.44*##46.45±6.87 13.08±4.26**19.52±5.12**#24.35±4.89**#30.34±3.73*#36.14±3.97*##

Bcl-2、Bas基因家族是目前較為公認與凋亡密切相關的基因，Bcl-2基因可抑制許多因素引起的細胞凋亡，被稱為細胞凋亡抑制基因，Bas單克隆抗體在體內與Bas結合后均能導致表達Bas的細胞發(fā)生凋亡，從而證明Bas是一種識別Bas配體，并將凋亡信息傳遞給細胞的細胞表面受體[4-5]。本實驗結果顯示，心肌缺血再灌能促進心肌細胞凋亡，且伴隨著Bcl-2基因表達蛋白的明顯降低和Bas基因表達蛋白的明顯升高；而丹紅注射液則能呈濃度依賴性地下調心肌細胞的凋亡率，并伴有Bcl-2基因表達蛋白的上調和Bas基因表達蛋白的下調。

大鼠心肌缺血再灌注過程中，Bcl-2蛋白表達減少而Bas蛋白表達增加，表明心肌細胞凋亡可能是一方面Bcl-2蛋白表達降低，抗凋亡能力減弱，而另一方面Bas蛋白表達增加，發(fā)揮了促凋亡能力的緣故[6]。丹紅注射液則可通過上調Bcl-2蛋白表達的和下調Bas蛋白表達，發(fā)揮保護缺血再灌心肌細胞的作用，這也為臨床上應用丹紅治療心肌缺血再灌注損傷提供分子調控依據。

[1]郄素會，郝哲，劉增娟，等.丹紅注射液對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用[J].現代中西醫(yī)結合雜志，2008，35（17）：5428-5430．

[2]Wang TD，Chen WJ，Su SS，et al．Increased cardiomyocyte apoptosis following ischemia and reperfusion in diet-induced hypercholesterolemia：relation to Bcl-2 and Bax proteins and Caspase-3 activity[J]．Lipids，2002，37（4）：385-394．

[3]周曉楓．丹紅注射液與硝酸甘油聯用治療不穩(wěn)定心絞痛療效觀察[J]．中國醫(yī)藥導報，2007，4（14）：65．

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[5]鄭勇萍，王焱林，陳鋒，等．大鼠心肌缺血預處理對細胞凋亡的影響[J]．中華中醫(yī)學雜志，2002，26（5）：265-266．

[6]Mukherjee S，Lekli I，Das M，et al．Cardioprotection with Alpha-tocopheryl phosphate：Amelioration of myocardial ischemia reperfusion injury is linked with its ability to generate a survival signal through Akt activation[J]．Biochim Biophys Acta，2008，1782（9）：498-503．