重組卡介苗的應用研究及進展

羅文武劉 姣朱元東劉貴軍于高水（魯抗舍里了藥業(yè)有限公司 山東 濟寧 272000 陜西中醫(yī)藥大學 陜西 咸陽）

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重組卡介苗的應用研究及進展

羅文武①劉 姣②朱元東①劉貴軍①于高水①
（①魯抗舍里了藥業(yè)有限公司 山東 濟寧 272000 ②陜西中醫(yī)藥大學 陜西 咸陽）

卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin Vaccine，BCG）是牛結核分枝桿菌的突變株。上世紀二十年代卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin Vaccine，BCG）被用于接種新生兒來預防結核病。在其安全性被確定后，卡介苗被在全世界范圍內推廣應用，是目前官方承認的預防結核病最安全有效的疫苗［2］，是WHO推薦的，出生時預防接種的疫苗之一。到目前為止，卡介苗已經在全球近200個國家和地區(qū)對將近40億的兒童進行了免疫接種。隨著分子生物學技術水平的提高和基因工程技術的進步，人們發(fā)現(xiàn)BCG不僅是是一種活疫苗，還易于接受外源基因的導入表達外源蛋白，這個重要發(fā)現(xiàn)為BCG的應用開辟了新的機遇。隨后卡介苗做為疫苗活載體被人們逐漸重視?？ń槊缱鳛橐环N細胞內寄生菌，接種到機體后，既可以刺激機體產生體液免疫，也能刺激機體產生細胞免疫，是一類有廣泛前景的新疫苗。

1 重組卡介苗簡介

1.1 重組卡介苗的優(yōu)點

rBCG是將外源基因導入BCG內，并利用BCG的活疫苗的特性，制成免疫機體后可產生針對不同抗原免疫應答的疫苗。經過近一個世紀的臨床應用以來卡介苗的安全性和優(yōu)點逐漸顯現(xiàn)：（1）不受到母源抗體的干擾，免疫接種時間無限制；（2）免疫保護期長，單次免疫產生的免疫應答可達5～50年；（3）卡介苗本身是一種免疫佐劑（4）生成成本低，生產技術簡單，便于保存和運輸；（5）免疫方式多樣可以口服靜脈注射和肌肉注射；（6）是一種免疫增強劑和免疫佐劑，能夠刺激機體產生持久的體液免疫和特異的細胞免疫［2］；（7）卡介苗還易于接受外源基因的導入，可以通過改變啟動子糾正表達不均衡的外源基因，進而使得外源蛋白得以穩(wěn)定表達。因此卡介苗也是一種非常理想的疫苗活載體［3］。

1.2 卡介苗刺激機體產生的免疫應答

機體產生的免疫應答可大體分為兩種，特異性免疫和非特異性免疫。特異性免疫又有獲得性免疫和自然免疫。非特異性免疫又稱天然免疫?？ń槊缱鳛橐环N兼性細胞內寄生菌，既能引起特異性和記憶性的獲得免疫，又能刺激機體產生非特異免疫應答，這是很多外源微生物所無法比擬的?？ń槊缢碳C體產生的細胞免疫主要是由T細胞介導的。體內巨噬細胞是卡介苗的主要宿主細胞。在抵抗卡介苗感染發(fā)揮主要作用的是CD4+和CD8+T細胞?？ń槊缒軌虮籑HCII類分子進行抗原加工遞呈給CD4+T細胞，進而促使其分泌在抗卡介苗感染中起到重要作用的細胞因子IFN-γ。同時也能被MHCI識別，并提呈給CD8+T細胞然后直接識別溶解殺傷靶細胞［4］。構成天然免疫的成份很多，主要包括吞噬細胞和體液殺菌成分如抗微生物肽、溶菌酶、補體等?？ń槊缒芤鸱翘禺愋悦庖叩脑蚱渚哂忻庖咦魟┗钚?。補體和抗原遞呈細胞表面的受體能夠識別BCG，從而使得卡介苗進入吞噬細胞內進行自我復制［5］。胞壁酰二肽是BCG細胞壁的刺激體熱激蛋白（HSP）表達特殊成分。熱激蛋白（HSP）含量升高可以使得機體天然免疫系統(tǒng)活化。MHCI類分子可以識別機體巨噬細胞攝取的HSP-肽復合物，激活CD8+T細胞的免疫應答［6，7］。BCG可以間接刺激DC細胞發(fā)育成熟，從而加強抗原遞呈的能力。

2 重組卡介苗在疾病預防中的應用

2.1 細菌rBCG疫苗

肺炎球菌蛋白A（PspA）是一種細胞表面蛋白，在所有的肺炎球菌菌株表面都能穩(wěn)定的表達，具有較好免疫原性。Langermann等［8］將PspA部分部分基因片段，構建多個不同的載體，轉入到卡介苗內，結果發(fā)現(xiàn)該基因分別以包漿蛋白、分泌蛋白以及嵌合輸出膜結合脂蛋白形式存在，所有的重組卡介苗均能誘導小鼠產生較高的抗體水平。血清學研究表明PspA血清有交叉免疫保護作用。Hess等［9］將李斯特菌融合核蛋白基因構建重組質粒載體，轉入卡介苗中，動物實驗表明，該重組卡介苗可以明顯的增強MHCI對可溶性蛋白的抗原提呈作用，同時發(fā)現(xiàn)該融合蛋白的表達可促進誘導刺激機體產生CD8+T細胞。Baumgart等［10］構建能夠表達麻風分枝桿菌18kD蛋白的重組卡介苗，實驗表明，該疫苗可以刺激誘導抗體的產生以及淋巴細胞曾生應答。Ohara等［11］將麻風桿菌的Ag85A蛋白基因重組到卡介苗中來表達蛋白，免疫小鼠發(fā)現(xiàn)小鼠足墊中的麻風桿菌繁殖率降低，抑菌效果比親本BCG更顯著。Nasoimento 等［12］［13］將百日咳毒素S1亞基基因轉入到卡介苗中，該重組卡介苗能表達S1PT蛋白。用rBCGS1PT免疫小鼠，結果發(fā)現(xiàn)其能刺激機體產生Th1 型免疫反應，可以保護小鼠抵抗腦內百日咳桿菌的攻擊。

2.2 病毒rBCG疫苗

據(jù)報道，引起新生嬰兒死亡的主要原因之一是麻疹病毒感染。Zhu等［14］將麻疹病毒核蛋白（NP）基因全長片段克隆，并導入卡介苗內構建rBCG（BCG-N），表達病毒蛋白。用麻疹病毒感染免疫接種過rBCG（BCG-N）的新生猴，結果發(fā)現(xiàn)，免疫該重組卡介苗不能阻止全身性的麻疹病毒感染，但是在新生猴體內仍能檢測到NP蛋白的特異的淋巴細胞應答，減輕了人工感染后的肺部炎癥。同時一些臨床癥狀例如鼻咽部分泌病毒排泄物的時間顯著縮短。實驗結果表明，接種rBCG（BCG-N）疫苗可以刺激機體產生針對麻疹病毒的T細胞免疫應答，進而減輕了病毒對肺部的傷害。目前認為，HIV-1的主要抗原有在其他細菌系統(tǒng)很難表達的Gag、逆轉錄酶、聚合酶、Env蛋白gp 120和gp 41等。

2.3 寄生蟲rBCG疫苗

2.3.1 瘧原蟲 瘧疾是由瘧原蟲引起的急性、傳染性寄生蟲病，該病呈全球分布。Matsumoto等［15］于1998年將瘧原蟲（Plasmodium yoelii）的孢子蛋白（CSP）中的一段B細胞表位的基因片段和質粒載體重組后轉入到BCG，該基因片段成功在BCG中表達出融合蛋白。用該重組卡介苗免疫小鼠，結果顯示能刺激機體產生較高的體液免疫應答和細胞免疫，進而抵抗瘧疾紅內期的感染，而且免疫保護期可長達半年以上。以后的研究中發(fā)現(xiàn)了瘧疾重組卡介苗的免疫保護機制，即rBCG能刺激機體產生IFN-γ，繼而誘導機體產生在后期清除瘧疾起到重要作用的免疫球蛋白抗體IgG2a。以后將編碼P1yoeliiMSP-1羧基端月15000bp的基因片段重組到BCG中進行蛋白表達，免疫小鼠后也能產生免疫應答［16］。

2.3.2 利什曼原蟲 目前研究表明，LCR1基因和GP63基因是利什曼原蟲的重要保護性抗原。用重組LCR1蛋白免疫小鼠，可刺激機體T 細胞因子IFN-γ的分泌量上升，使得小鼠可以獲得部分免疫保護。Streit 等［19］將LCR1基因的一端編碼序列和pMV261穿梭載體進行重組，重組的rBCG-LCR1卡介苗能表達與預期相符的融合蛋白，免疫印跡驗證該目的蛋白具有良好的免疫原性。用該重組卡介苗皮下和腹腔注射免疫接種小鼠，然后進行攻蟲實驗，4周后解剖小鼠發(fā)現(xiàn)，皮下注射組小鼠的肝臟損傷明顯減輕，且能刺激小鼠產生Th1免疫應答，但是腹腔注射免疫組未能產生理想的保護效果。

2.3.3 血吸蟲 Kremer等［20］構建一種曼氏血吸蟲（Schistosoma mansoni）的重組卡介苗，這種疫苗是將谷胱甘肽轉移酶（Sm28GST）基因片段克隆轉進BCG中，結果這種重組卡介苗可以表達出具有酶活性的Sm28GST蛋白。這種重組蛋白可以被谷胱甘肽特異的識別。隨后將這株重組卡介苗免疫小鼠后，結果可以在小鼠體內檢測到IgG1、IgG2a、IgG2b抗體亞型和中和抗體反應。這些抗體的產生對血吸蟲的感染的保護性良好。通過靜脈注射、腹腔注射、皮下注射和鼻內等免疫方式將重組卡介苗免疫小鼠，均能刺激機體產生體液免疫反應。并且免疫效果隨免疫次數(shù)的增加而增強。后來又將重組卡介苗構建成表達Sh28GST的重組體，并且發(fā)現(xiàn)該蛋白具有酶活性，免疫小鼠表現(xiàn)較強的免疫應答［21］。

2.3.4 肝片吸蟲 肝片吸蟲是一種寄生在動物機體肝臟膽管內能引起急性或慢性肝炎的寄生蟲。肝片吸蟲病呈世界性分布，對機體危害較大。目前研究表明FH3基因是肝片吸蟲主要的保護性抗原基因之一。周宇［22］在2003年篩選到肝片吸蟲的FH3抗原基因，并對其進行研究，首先構建pMV261-FH3重組穿梭質粒，然后用電轉化的方式構建重組卡介苗，經過熱激誘導后檢測能表達與預期相符的相對分子質量約為22000的融合蛋白。為今后的肝片吸蟲重組卡介苗的研究提供重要的理論依據(jù)。

2.3.5 雞球蟲 王秋悅［23］將篩選到的柔嫩艾美耳球蟲（E.tenella）膜內絲氨酸蛋白酶Rhomboid基因重組到梭表達載體pMV261和整合表達載體pMV361中，構建了重組質粒，用電轉化的方法將其導入卡介苗中，然后熱激誘導蛋白表達，發(fā)現(xiàn)成功表達了具有抗原活性的Rhomboid。后期實驗中，將兩種重組卡介苗經多種方式免疫雛雞后用一定數(shù)量E.tenella卵囊進行感染，結果發(fā)現(xiàn)重組卡介苗有一定的免疫保護作用，抗球蟲指數(shù)高達174.6。同時，她用熒光蛋白（EGFP）對重組卡介苗pMV361-Rho株進行標記，免疫雛雞一周后，結果發(fā)現(xiàn)Rhomboid基因在雞體內各組織器官均有表達，表達量大約在免疫后14d達到最多，隨后逐漸下降，28d以后基本消失。在后續(xù)實驗中，為了增強免疫效果，將雞的白介素2基因和Rhomboid基因串聯(lián)，并構建了聯(lián)合基因重組卡介苗，動物實驗表明，以滴鼻的免疫的pMV261-Rho-IL-2重組卡介苗效果最好，抗球蟲指數(shù)超過180。

2.3.6 弓形蟲 王洪法［24］［25］首先將弓形蟲ROP2 基因在大腸桿菌中進行原核表達及免疫原性分析，發(fā)現(xiàn)該基因有較好的免疫原性。然后將ROP2基因和卡介苗穿梭表達載體pMV262以及整合表達載體 pOIP23H進行重組，電轉化到卡介苗中，結果發(fā)現(xiàn)可誘導蛋白表達。經靜脈注射和口服兩種方式將重組卡介苗免疫小鼠，檢測結果發(fā)現(xiàn)免疫組血清細胞因子IFN-γ、IL-2及CD4+、CD8+T 細胞與對照組比較差異顯著。靜脈注射免疫pMV262-ROP2重組卡介苗組小鼠的存活時間顯著延長。

3 重組卡介苗的前景

走過80多年歷程的卡介苗是唯一用于預防結核病的疫苗。在預防人類結核病的中發(fā)揮著非常重要的作用。近十幾年以來國內外研究者已經證實，BCG作為活載體表達系統(tǒng)以成功誘導包括病毒、細菌、寄生蟲抗原基因以及細胞因子在內的多種蛋白。如今，rBCG的研制引起了廣泛的關注，人們希望對rBCG的載體和選擇系統(tǒng)的穩(wěn)定方面進行改進，進而使其在預防更多疾病方面發(fā)揮更出色的表現(xiàn)。但是目前，針對重組卡介苗需要解決的問題還很多。首先外源基因的導入能否改變其弱毒疫苗的性質［26］。其二，BCG表達的蛋白缺少真核生物所具有的翻譯后的加工修飾以及糖基化、裝配等問題。再者，如何保證同時將多種外源基因導入BCG時，各基因能協(xié)同高效的表達。相信伴隨著基因工程手段的不斷提高和分子生物學的發(fā)展，加上研究者們堅持不懈的努力，rBCG疫苗在疾病的治療和預防方面有更出色的表現(xiàn)。

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中圖分類號：S852.4

文獻標識碼：A

文章編號：1007-1733（2016）04-0047-03

收稿日期：（2016–01–12）