藥食兩用植物對(duì)幽門(mén)螺桿菌的抑菌活性測(cè)定

太原師范學(xué)院（030012）喬宏萍 武曉英 燕平梅 郝雪峰 陳燕飛

上海交大昂立股份有限公司生物醫(yī)藥研究院（200233）沙大年

幽門(mén)螺旋菌（Helicobacter pylori Hp）是一種寄居在人體胃黏膜里呈S形或弧形彎曲的革蘭氏陰性桿菌。Hp具有很強(qiáng)的活性與繁殖能力，是一種嚴(yán)重影響公眾健康的細(xì)菌。在發(fā)展中國(guó)家成人感染率可以達(dá)到90%，現(xiàn)已報(bào)道，Hp與各種慢性胃炎都有關(guān)系，可以損害胃黏膜屏障，甚至破壞胃的正常結(jié)構(gòu)及功能；導(dǎo)致胃酸減少或缺乏；減少人體對(duì)鐵質(zhì)及維生素B12的吸收；增加腸道感染的機(jī)會(huì)；通過(guò)人與人的直接或間接接觸，感染其他健康人群[1][2][3]。目前臨床上對(duì)Hp感染的治療主要采用以抗生素為主的治療方案，盡管在一定程度上可以治愈Hp感染，卻不能預(yù)防其再感染。在沒(méi)有經(jīng)過(guò)充分地根除治療，黏膜層中的Hp仍能存活，細(xì)菌可再次粘附并移生于胃上皮細(xì)胞，繼續(xù)感染。Hp對(duì)胃黏膜很強(qiáng)的粘附作用，經(jīng)血液循環(huán)的藥物到達(dá)黏膜時(shí)也很難接近Hp，故徹底消除HP實(shí)屬不易。攜帶或感染Hp的人群中，其中大部分人一開(kāi)始并不表現(xiàn)出不適癥狀，但是這些人無(wú)疑是攜帶了一個(gè)“定時(shí)炸彈”，時(shí)時(shí)刻刻會(huì)危害人們的健康[4-9]。隨著當(dāng)今預(yù)防科學(xué)的發(fā)展，人們更提倡防病于未然，即以養(yǎng)生保健為主動(dòng)方法，通過(guò)日常飲食達(dá)到預(yù)防疾病，調(diào)節(jié)人體生理狀態(tài)的目的。因此，本研究選用藥食兩用的植物篩選對(duì)幽門(mén)螺桿菌具有抑菌效果的組分，為將開(kāi)發(fā)中藥制劑和保健食品提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 藥食兩用植物蒲公英、甘草、菊花、薄荷、烏梅、生山楂購(gòu)自藥店。

1.1.2 供試菌種 幽門(mén)螺桿菌（Helicobacter pylori ATCC43504）由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 培養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基為改良的Skirrow選擇性培養(yǎng)基（蛋白胨15g、胰蛋白胨2.5g、酵母浸膏5.0g、氯化鈉5.0g、瓊脂15.0g、蒸餾水1000ml），即在1000ml改良的Skirrow瓊脂基礎(chǔ)中加入抗生素混合液，使其濃度為甲氧芐氨嘧啶TMP5mg/L，萬(wàn)古霉素10mg/L，多粘菌素B2500IU/L，并加入50ml脫纖維凍融兔血。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Hp菌懸液制備 先將保存的菌株活化，培養(yǎng)條件為改良Skirrow選擇性固體培養(yǎng)基，微需氧37℃孵育72h。平板上長(zhǎng)出Hp菌落，直徑約1mm，透明、濕潤(rùn)、稍隆起圓形，呈針尖樣。菌體革蘭染色陰性，呈彎曲“S”形。將典型菌落傳代，同樣條件下培養(yǎng)72h。用布氏肉湯洗下菌落，收集菌液，再以布氏肉湯校正菌懸液濃度。測(cè)量抑菌圈實(shí)驗(yàn)時(shí)，菌懸液濃度約為108CFU/ml。

1.2.2 藥液的制備 將植物烘干、剪碎后置于燒杯中，加蒸餾水沒(méi)過(guò)植物1cm左右，浸泡30min，然后加2倍植物量的水，加熱煮沸，30min后用紗布過(guò)濾，再加入同樣量的水沒(méi)過(guò)濾渣，煮沸30min后過(guò)濾，兩次濾液合并濃縮至1g/mL，高壓滅菌20min，4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 抑菌圈的測(cè)定方法 采用打孔瓊脂擴(kuò)散法。取直徑9cm，培養(yǎng)基厚度約4mm的改良Skirrrow選擇性培養(yǎng)基的平板，每塊平板加入100μlHp菌懸液，立即用涂布棒涂布均勻。之后，每個(gè)培養(yǎng)皿打直徑5mm的小孔5個(gè)，呈均勻分布。往每孔中加入15μl不同品種的中藥液，微需氧37℃培養(yǎng)72h，觀察抑菌圈，測(cè)量直徑。每味中藥重復(fù)3次。

1.2.4 最小抑菌濃度（the Minimum Inhibitory Concentrations MIC）的測(cè)定：以藥液與改良Skirrow培養(yǎng)基混合的方式將藥液稀釋成不同濃度（0.8g/ml、0.6g/ml...逐次稀釋到0.02g/ml、0.01g/ml），倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中。待培養(yǎng)基凝固后，用移液槍取50μL幽門(mén)螺桿菌的菌懸液滴于固體培養(yǎng)基表面，涂布器涂布均勻，微需氧37℃培養(yǎng)72 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況，以一般小于5個(gè)菌落的最低濃度為最小抑菌濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌作用：對(duì)蒲公英、甘草、薄荷、烏梅、山楂和菊花六種藥食兩用的植物進(jìn)行了浸泡、煎熬、離心和濃縮，最后濃縮為1g/ml的藥液，滅菌后，測(cè)定了其對(duì)Hp的抑制能力，結(jié)果除了山楂沒(méi)有抑菌效果外，其它的5種植物都出現(xiàn)了不同的抑菌圈，抑菌圈最大的為烏梅3.2cm，其次為菊花2.83cm，薄荷2.81cm，蒲公英2.1cm，抑菌圈最小的為甘草1.2cm。

2.2 最小抑菌濃度的測(cè)定：對(duì)具有抑菌作用的甘草、薄荷、烏梅和山楂水提液進(jìn)行最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定結(jié)果為，烏梅對(duì)幽門(mén)螺桿菌的最小抑菌濃度為10mg/ml，菊花為15mg/ml，薄荷為20mg/ml，蒲公英為30 mg/ml，甘草的MIC最大為50mg/ml。

3 討論

本研究結(jié)果看出蒲公英，甘草，薄荷，烏梅和菊花對(duì)幽門(mén)螺桿菌都有不同程度的抑制作用，并且在很小濃度的范圍內(nèi)就可以安全抑制其生長(zhǎng)。因此，本研究不僅可以為研究開(kāi)發(fā)抑制幽門(mén)螺桿菌的中藥提供原料，也可以為Hp常年攜帶者提供一個(gè)通過(guò)飲食來(lái)預(yù)防疾病發(fā)生的思路。