基于不同激素組合的紫丁香成熟種子組培誘導(dǎo)研究

王愛芝 王清君 劉運(yùn)偉 沈海龍

摘要：? 以紫丁香成熟種子為外植體，采用不同激素組合培養(yǎng)基進(jìn)行組培誘導(dǎo)試驗(yàn)的結(jié)果表明：采用中間切割方式的種子萌發(fā)率較高，最高可達(dá)59.72%;NAA與BA組合誘導(dǎo)丁香種子效果較好，NAA0.1 mg/L+BA1.0 mg/L的誘導(dǎo)率可達(dá)88.89%，MS+BA3.0 mg/L為頂芽和帶芽莖段的最適增殖繼代培養(yǎng)基;莖芽在試管內(nèi)、外生根時(shí)間分別為20天和4～? ? 6周，生根率均為100%，紫丁香成熟種子組織培養(yǎng)試驗(yàn)取得成功。

關(guān)鍵詞：? 紫丁香;? 成熟種子;? 生長(zhǎng)激素;? 組織培養(yǎng)

中圖分類號(hào)：? ?S 685. 26， S 723. 1 + 32. 6? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：? ?A? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號(hào)：1001 - 9499（2020）01 - 0001 - 05

紫丁香（Syringa oblata），木犀科丁香屬，落葉灌木或小喬木，樹高可達(dá)4～5 m，花期為4～5月，花冠紫色，蒴果扁形[ 1 - 2 ]。紫丁香具有花繁、葉茂、香濃、適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)，特別耐寒、耐旱，亦稍耐蔭，是一種優(yōu)良的觀花樹種，也是一種良好的蜜源植物[ 3 - 5 ]，具有很高的景觀價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值。紫丁香有多種繁殖方法，包括播種、扦插、嫁接、分株、壓條、組培等，其中，組織培養(yǎng)技術(shù)在丁香繁殖中廣泛采用[ 6 - 22 ]。當(dāng)前，丁香屬植物組培研究的外植體材料主要采用根尖、莖段、莖尖、休眠芽、幼葉、葉柄、幼花序軸等，但以種子作為外植體的研究尚未見報(bào)道。本研究利用紫丁香成熟種子為外植體，利用離體擴(kuò)繁的手段，實(shí)現(xiàn)了紫丁香樹木改良，為進(jìn)一步優(yōu)化丁香屬育苗方式、完善丁香屬良種快繁技術(shù)體系提供理論依據(jù)，進(jìn)而推動(dòng)丁香屬良種快繁產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

1 試驗(yàn)材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料采用紫丁香成熟種子，采自位于哈爾濱市的東北林業(yè)大學(xué)（地理坐標(biāo)：126°63′E，45°72′N）校園逸夫?qū)嶒?yàn)樓對(duì)面，文管樓東側(cè)1株20年生紫丁香樹。該樹生長(zhǎng)狀況良好，其花色與校園內(nèi)其它紫丁香樹相比，花色更為純正。2018年10月種子成熟時(shí)，從樹冠上部、中部、下部隨機(jī)采集成熟紫丁香蒴果，搓掉果皮，去掉干秕粒，將600粒干凈種子裝入塑料夾鏈袋，封口存放于實(shí)驗(yàn)室4 ℃冰箱中，供試驗(yàn)使用。試驗(yàn)試劑為H2O2溶液、吐溫20、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）、細(xì)胞分裂素BA、蔗糖、瓊脂等。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 種子質(zhì)量檢驗(yàn)

發(fā)芽率是檢驗(yàn)種子播種品質(zhì)重要指標(biāo)，為保證試驗(yàn)所用的紫丁香成熟種子質(zhì)量，首先對(duì)種子進(jìn)行發(fā)芽率檢驗(yàn)。2019年3月，隨機(jī)取90粒種子，用清水浸泡3天，取3個(gè)培養(yǎng)皿，皿中均勻平鋪薄層脫脂棉，剪與培養(yǎng)皿等大的圓形吸水紙，平鋪在脫脂棉上。將泡好的種子均勻擺放在吸水紙上，每個(gè)培養(yǎng)皿隨機(jī)放30粒種子，3次重復(fù)。種子用蒸餾水潤(rùn)濕后，將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱內(nèi)。培養(yǎng)條件為：光照16 h/黑暗8 h，光強(qiáng)2 000～3 000 lx，溫度25±2 ℃，濕度70%～80%。每天觀察發(fā)芽情況，計(jì)算種子發(fā)芽率。

1. 2. 2 種子初代誘導(dǎo)培養(yǎng)

初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用MS基本培養(yǎng)基，激素采用生長(zhǎng)素NAA，IBA和細(xì)胞分裂素BA。NAA，IBA均采用0，0.1，0.5，1.0 mg/L 4個(gè)濃度水平，BA采用0，1.0，3.0，5.0 mg/L 4個(gè)濃度水平，添加蔗糖20 g/L、瓊脂6 g/L，使pH=5.8。從冰箱中取出紫丁香種子，清水浸泡3天后接種。接種前，用75 %酒精表面滅菌30～60 s，然后在10 %的H2O2溶液中滴加2～? 3滴吐溫20，攪拌消毒10 min，然后在超凈工作臺(tái)下用無菌水沖洗干凈。接種采用完整種子、兩端切和中間切3種切割方式，每種方式接種100粒，水平接種于成熟種子的初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，調(diào)查不同切割方式下的種子萌發(fā)時(shí)間、萌發(fā)率及生長(zhǎng)情況，選擇最優(yōu)切割方式，做初代誘導(dǎo)培養(yǎng)試驗(yàn)，確定最適激素組合。

1. 2. 3 種子繼代增殖培養(yǎng)

繼代增殖培養(yǎng)基采用MS基本培養(yǎng)基，激素采用NAA和BA。NAA采用0和0.1 mg/L 2個(gè)濃度水平，BA采用1.0和3.0 mg/L 2個(gè)濃度水平，添加蔗糖20 g/L，瓊脂7 g/L，使pH=5.8。取初代培養(yǎng)誘導(dǎo)得到的無根莖芽，剪取其頂芽和1 cm長(zhǎng)的莖段，分別以垂直和水平的方式，接種于繼代增殖培養(yǎng)基上，每個(gè)處理接種20個(gè)外植體。調(diào)查不同激素組合下成熟種子不定芽誘導(dǎo)率、增殖系數(shù)和生長(zhǎng)情況，以及頂芽和帶芽莖段的培養(yǎng)生長(zhǎng)情況，選擇繼代增殖培養(yǎng)最適激素組合。

1. 2. 4 莖芽生根調(diào)查

生根率試驗(yàn)分為試管內(nèi)、外生根2項(xiàng)試驗(yàn)，每項(xiàng)試驗(yàn)分別處理200個(gè)無根莖芽。（1）試管內(nèi)生根。本試驗(yàn)的生根培養(yǎng)基采用1/2MS+IBA 1.0 mg/L +2%蔗糖+0.6 %瓊脂，使pH=5.8。將增殖培養(yǎng)得到的紫丁香莖芽（高2 cm以上）切下，垂直轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)。（2）試管外生根。將紫丁香組培莖芽（高2～5 cm）扦插到純草炭：珍珠巖=1：1的基質(zhì)中，葉面噴水，在組培苗馴化室內(nèi)培養(yǎng)。分別調(diào)查試管內(nèi)、外生根時(shí)間和生根率。

2 結(jié)果與分析

2. 1 種子質(zhì)量檢驗(yàn)

按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行發(fā)芽率試驗(yàn)，觀測(cè)1周后，發(fā)現(xiàn)種子表面有發(fā)霉現(xiàn)象，用75 %的酒精擦洗種皮，換床培養(yǎng)。經(jīng)觀察，發(fā)芽試驗(yàn)開始后的第5天，第1粒種子發(fā)芽，之后每天均有種子發(fā)芽。通過整理發(fā)芽試驗(yàn)記錄表，得到種子發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)果。3組重復(fù)的種子發(fā)芽率分別為90.00%，93.33%和86.67%，平均發(fā)芽率達(dá)到90%，可見試驗(yàn)所用種子質(zhì)量較好，可以進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2. 2 不同切割方式對(duì)種子萌發(fā)的影響

本試驗(yàn)采用完整種子、兩端切和中間切3種切割方式進(jìn)行水平接種，由不同切割方式下的種子萌發(fā)及生長(zhǎng)情況（表1）可以看出，切割方式對(duì)種子萌發(fā)影響較大。完整種子自接種后3周內(nèi)，除了種皮膨脹外無其它變化，3周后才開始發(fā)芽;兩端切割的種子2周后就可萌發(fā)，中間切割的種子也是2周開始萌發(fā)，但萌發(fā)率更高，且長(zhǎng)出了綠色子葉，長(zhǎng)勢(shì)良好。從種子最終萌發(fā)率可以看出，中間切割的種子萌發(fā)率最高，達(dá)到59.72%;兩端切割的種子萌發(fā)率最低，只有43.94%;完整種子介于兩者之間，但更接近于兩端切割的種子。

表1 不同切割方式下的種子萌發(fā)及生長(zhǎng)情況

2. 3 不同激素組合對(duì)種子初代誘導(dǎo)的影響

2. 3. 1 不同激素組合對(duì)不定芽誘導(dǎo)率的影響

由NAA和BA組合對(duì)紫丁香成熟種子不定芽誘導(dǎo)率的影響（表2）可以看出，當(dāng)培養(yǎng)基中不添加NAA時(shí)，BA濃度在0～3.0 mg/L，二者組合僅有50 %的種子誘導(dǎo)出不定芽;當(dāng)BA濃度達(dá)到5.0 mg/L時(shí)，不定芽誘導(dǎo)率達(dá)83.33 %。NAA濃度為0.1 mg/L時(shí)，紫丁香種子不定芽的平均誘導(dǎo)率最高，為71.43 %。當(dāng)NAA濃度為1 mg/L時(shí)，BA濃度為0時(shí)，不定芽的誘導(dǎo)率最高，出芽率達(dá)到了100 %。

由IBA和BA組合下的種子不定芽誘導(dǎo)率（表3）可以看出，IBA0.5 mg/L+BA3.0 g/L時(shí)，種子不定芽誘導(dǎo)率最高，為66.67 %。與NAA和BA組合相比，IBA和BA組合的初代培養(yǎng)基對(duì)紫丁香種子不定芽的誘導(dǎo)率效果較差。

表2? ?NAA和BA組合下的種子不定芽誘導(dǎo)率%

表3 IBA和BA組合下的種子不定芽誘導(dǎo)率%

2. 3. 2 不同激素組合對(duì)種子初代增殖及生長(zhǎng)情況的影響

培養(yǎng)基內(nèi)激素組合對(duì)紫丁香不定芽誘導(dǎo)的影響不僅表現(xiàn)在種子誘導(dǎo)率上，而且還表現(xiàn)在增殖系數(shù)及誘導(dǎo)出的不定芽本身的生長(zhǎng)狀態(tài)上。由NAA，IBA和BA組合下的種子初代增殖及生長(zhǎng)情況（表4，表5）可以看出，添加了NAA與BA組合的初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)不定芽的效果優(yōu)于IBA與BA組合，NAA與BA組合誘導(dǎo)紫丁香種子不定芽的增殖系數(shù)則不如IBA與BA組合，甚至當(dāng)IBA0.1 mg/L +BA5.0 mg/L時(shí)，一個(gè)種子最多可增殖7個(gè)芽。但從整體情況來看，添加了IBA和BA組合的培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的不定芽生長(zhǎng)情況不良，部分葉片卷曲，子葉枯黃。綜上可知，紫丁香種子不定芽誘導(dǎo)最適激素組合為NAA0.1 mg/L+BA1.0 mg/L，平均增殖系數(shù)為2.5。

2. 4 不同激素組合對(duì)繼代增殖培養(yǎng)的影響

2. 4. 1 頂芽外植體繼代增殖培養(yǎng)

在繼代增殖培養(yǎng)階段，將初代誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽的頂芽垂直接種在繼代培養(yǎng)基上。由頂芽繼代增殖培養(yǎng)生長(zhǎng)情況（表6）可以看出，在繼代培養(yǎng)基上的紫丁香頂芽基部均可產(chǎn)生塊狀愈傷組織，甚至包圍整個(gè)外植體，愈傷組織主要表現(xiàn)為綠色、疏松，當(dāng)激素濃度高時(shí)，變得致密。誘導(dǎo)出的不定芽的高度可達(dá)2～4 cm，經(jīng)過繼代增殖培養(yǎng)，一個(gè)芽最多可增殖5個(gè)芽。

2. 4. 2 莖段外植體繼代增殖培養(yǎng)

在繼代增殖培養(yǎng)階段，將初代誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽的帶芽莖段（長(zhǎng)1 cm）水平接種在繼代培養(yǎng)基上。由莖段繼代增殖培養(yǎng)生長(zhǎng)情況（表7）可以看出，在繼代培養(yǎng)基上的紫丁香莖段基部均產(chǎn)生塊狀愈傷組織，甚至包圍外植體，誘導(dǎo)的愈傷組織多數(shù)出現(xiàn)黃化，當(dāng)激素濃度高時(shí)，葉片與培養(yǎng)基接觸部位也誘導(dǎo)出愈傷組織，且愈傷組織變得更加致密;誘導(dǎo)出的不定芽最高為2 cm，經(jīng)過繼代增殖培養(yǎng)，一個(gè)芽最多可增殖3個(gè)芽，隨著激素濃度的增加誘導(dǎo)出的不定芽出現(xiàn)輕微的玻璃化現(xiàn)象。綜合不定芽的生長(zhǎng)狀態(tài)和增殖系數(shù)可知，對(duì)于頂芽和莖段繼代培養(yǎng)而言，最佳的增殖培養(yǎng)基均為MS+BA3.0 mg/L，增值系數(shù)可達(dá)到5。

表7 莖段繼代增殖培養(yǎng)生長(zhǎng)情況

2. 5 紫丁香組培莖芽生根

丁香屬樹種在試管內(nèi)生根相對(duì)容易，生根率很高。在本試驗(yàn)中，組培10 天后莖芽開始生根;20 天后，每個(gè)莖芽長(zhǎng)出3～6條具有須根的發(fā)達(dá)根系，生根率達(dá)100 %，最長(zhǎng)根長(zhǎng)約2 cm，平均根長(zhǎng)1 cm。由于試管苗通常在無菌、恒溫、弱光的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)發(fā)育，幼苗移栽后由異養(yǎng)轉(zhuǎn)入自養(yǎng)，對(duì)外界環(huán)境條件需要經(jīng)過一段逐漸馴化的適應(yīng)過程。所以，一般來說組培莖芽試管外生根前要進(jìn)行煉苗。但是紫丁香經(jīng)增殖培養(yǎng)或壯苗培養(yǎng)后的小苗長(zhǎng)得較為健壯，木質(zhì)化程度較高，因此，一直以來有關(guān)壯苗培養(yǎng)基和移栽前的預(yù)處理還沒有建立系統(tǒng)技術(shù)。在試管外生根方面，扦插4～6周后100%生根，紫丁香在增殖過程中部分莖芽基部會(huì)生根，數(shù)量不多，但較為粗壯發(fā)達(dá)。扦插時(shí)可不用去根，扦插時(shí)是否去根對(duì)其成活沒有顯著影響。由于紫丁香莖芽本身木質(zhì)化程度高，葉片較厚，不易腐爛，所以紫丁香試管外生根對(duì)水分要求不嚴(yán)格，只需保持基質(zhì)濕潤(rùn)即可（含水率50%～70%）。扦插期間，根據(jù)基質(zhì)情況，每天進(jìn)行葉面噴水或澆水以保持基質(zhì)濕潤(rùn)，逐漸通風(fēng)透光即可成苗。

3 結(jié)論與討論

本研究篩選質(zhì)量較好的紫丁香成熟種子作為外植體，以不同切割方式和不同激素組合進(jìn)行了組培試驗(yàn)，研究結(jié)果表明，與完整種子和兩端切相比，中間切割的種子萌發(fā)率更高，達(dá)到了59.72%。NAA與BA組合誘導(dǎo)紫丁香種子不定芽效果優(yōu)于IBA與BA組合，最佳激素組合為NAA0.1 mg/L+? BA1.0 mg/L，最高誘導(dǎo)率達(dá)88.89 %。平均增殖系數(shù)達(dá)2.5。經(jīng)過初代誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽，以頂芽和莖段為外植體接種在繼代培養(yǎng)基上，在不同激素組合下，生長(zhǎng)狀態(tài)和增殖系數(shù)均有所不同，而最佳增殖繼代培養(yǎng)激素為BA3.0 mg/L。培養(yǎng)出的莖芽經(jīng)過試管內(nèi)、外生根試驗(yàn)，其生根率均可達(dá)到100%，紫丁香成熟種子組培快繁試驗(yàn)取得成功，該項(xiàng)技術(shù)可作為丁香屬良種快繁技術(shù)進(jìn)行熟化和推廣。

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第1作者簡(jiǎn)介：? 王愛芝（1975-），? 女，? 博士，? 助理研究員，? 主要從事種苗培育原理與技術(shù)的研究工作。

通訊作者：? 沈海龍（1962-），? 男，? 博士，? 教授，? 博士生導(dǎo)師，? 主要從事森林培育學(xué)的教學(xué)和科研工作。

收稿日期： 2019 - 11 - 28

（責(zé)任編輯：? ?王 巖）

Study on Tissue Culture Induction of Syringa oblata Mature

Seeds Base on Different Hormone Treatments

WANG Aizhi

（Yichun Academy of Forestry Science，? Heilongjiang Yichun 153000）

Abstract Using Syringa oblata mature seeds as explants， different hormone combination media were used for tissue culture induction experiments.The results showed that the germination rate of seeds was highest with intermediate cutting method （up to 59.72%）. The highest induction rate was 88.89% with the combination of 0.1 mg/L NAA and 1.0 mg/L BA. The optimum culture medium for terminal bud and stem with buds was MS + BA 3.0 mg/L. The rooting time of shoot was 20 days in vitro and 4-6 weeks ex vitro， respectively， with 100% of the rooting rate. Our results suggested that the tissue culture of S. oblata was successful using mature seed as explants.

Key words Syringa oblata;? Mature seed;? Growth hormone;? Tissue culture