興安落葉松SSR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

冷海楠 張玉 徐明儀 王麗媛 付曉玲 崔福星 楊立賓 朱道光

摘要：? 采用L16（45）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)影響興安落葉松SSR-PCR 反應(yīng)體系的主要因素（模板DNA、dNTPs、Mg2+、Taq聚合酶濃度及引物濃度）進(jìn)行了試驗(yàn)分析，其結(jié)果表明：興安落葉松SSR-PCR體積為20 μL的最佳反應(yīng)體系是模板DNA用量50 ng、正反向引物濃度均為5μmol·L-1、dNTPs濃度為2.5 mmol·L-1、Mg2+的濃度為2.5 mmol·L-1、Taq聚合酶用量為1.0 U、最佳退火溫度為60 ℃。試驗(yàn)所建立的反應(yīng)體系可進(jìn)一步用于興安落葉松SSR遺傳圖譜構(gòu)建、多樣性分析、良種選育等方面的研究中。

關(guān)鍵詞：? 興安落葉松;? SSR-PCR;? 正交優(yōu)化試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：? ?S 791. 222? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：? ?A? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號(hào)：1001 - 9499（2020）01 - 0012 - 03

興安落葉松（Larix gmelinii）是松科落葉松屬植物，主要分布在我國(guó)的大、小興安嶺地區(qū)，是大興安嶺地區(qū)寒溫帶針葉林的主要建群種[ 1 ]。興安落葉松具有成材快、適應(yīng)能力強(qiáng)、耐寒耐濕等特點(diǎn)，因此對(duì)興安落葉松開(kāi)展研究具有很強(qiáng)的經(jīng)濟(jì)及生態(tài)意義。

SSR（Simple sequence repeats）分子標(biāo)記是一種高效的分子生物學(xué)研究手段，憑借其共顯性、多態(tài)性高、檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確率高等特點(diǎn)廣泛應(yīng)用于林木遺傳育種、植物遺傳圖譜建立等研究中[ 2 - 6 ]。本研究利用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)興安落葉松SSR-PCR反應(yīng)體系的各個(gè)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得出一套高效、可靠、穩(wěn)定的反應(yīng)體系，為興安落葉松遺傳多樣性、良種選育等相關(guān)應(yīng)用性研究奠定基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料選用大興安嶺地區(qū)呼中國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)（122°42'14″? ?～? 123°18'05″E，51°17'42″? ?～

51°56'31″N）內(nèi)的興安落葉松。將采集的興安落葉松鮮嫩針葉迅速保存于液氮罐中，實(shí)驗(yàn)室保存于-20 ℃冰箱中。

2 試驗(yàn)方法

2. 1 DNA的提取和檢測(cè)

使用天根（TIANGEN）公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒（DP350）進(jìn)行DNA提取，提取10組DNA作為樣本;提取完成后，利用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)、核酸蛋白檢測(cè)儀進(jìn)行含量測(cè)定。

2. 2 SSR-PCR反應(yīng)體系及程序

以提取得到的興安落葉松DNA為模板，對(duì)模板DNA用量、正反向引物濃度、dNTPs濃度、Mg2+的濃度、Taq聚合酶用量5個(gè)因素進(jìn)行正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，每個(gè)因素4個(gè)水平（表1），2個(gè)重復(fù)，共32個(gè)處理。反應(yīng)程序設(shè)置為：94 ℃預(yù)變性，5 min;94 ℃變性，35 s;60 ℃退火35 s;72 ℃延伸 1 min;35個(gè)循環(huán);72 ℃再延伸7 min;瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

2. 3 反應(yīng)體系驗(yàn)證

以不同樣本提取的DNA為模板DNA進(jìn)行PCR試驗(yàn)，使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，以檢驗(yàn)反應(yīng)體系的穩(wěn)定性。

表1 興安落葉松反應(yīng)體系的正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)L16（45）

3 結(jié)果與分析

3. 1 核酸檢測(cè)

由總DNA提取電泳（圖1）可知：電泳條帶清晰明亮，無(wú)異物滯留在點(diǎn)樣孔。核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定DNA的OD260/OD280值為2.0～2.5，濃度為150～? 240 ng/μL。由此可見(jiàn)，獲得的DNA樣本純度高，幾乎不含雜質(zhì)，適合試驗(yàn)使用。

圖1 總DNA提取電泳

3. 2 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

從SSR-PCR正交試驗(yàn)結(jié)果（圖2）可以看出：不同因素、不同濃度組合所產(chǎn)生的擴(kuò)增結(jié)果有明顯差異。試驗(yàn)1、5、6、15的擴(kuò)增條帶顯示不明顯，其余12組都能擴(kuò)增出清晰的條帶，其中第14組在兩次重復(fù)試驗(yàn)中都表現(xiàn)出主帶明顯、條帶清晰的特征，可以確定為最優(yōu)體系。

興安落葉松SSR-PCR體積為20 μL的最佳反應(yīng)體系是：模板DNA用量50 ng、正反向引物濃度均為5μmol·L-1、dNTPs濃度為2.5 mmol·L-1、Mg2+的濃度為2.5 mmol·L-1、Taq聚合酶用量為1.0 U。

3. 3 反應(yīng)體系驗(yàn)證結(jié)果

以提取10組興安落葉松樣本DNA作為模板，利用優(yōu)化獲得的反應(yīng)體系進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增（圖3）得到了清晰的擴(kuò)增條帶。說(shuō)明獲得的反應(yīng)體系穩(wěn)定性高，可以用于日后的遺傳多樣性及分子育種研究。

圖3 10個(gè)興安落葉松樣本的SSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果

4 結(jié)論與討論

4. 1 在植物遺傳多樣性及林木遺傳育種研究中，建立和優(yōu)化出一套高效、穩(wěn)定、可靠的SSR-PCR反應(yīng)體系是SSR分子標(biāo)記應(yīng)用的基礎(chǔ)[ 8 - 9 ]。近年來(lái)，分子生物學(xué)手段被廣泛用于生態(tài)學(xué)的研究中，因此興安落葉松SSR-PCR反應(yīng)體系的建立不僅是研究興安落葉松遺傳多樣性的研究基礎(chǔ)，也將為分子生態(tài)學(xué)的研究奠定基礎(chǔ)。

4. 2 本研究獲得的最佳反應(yīng)體系與其余松科植物相比，在DNA模板用量、dNTPs、Mg2+的濃度上雖然有差異，但差異并不大，而在引物濃度、Taq酶用量上卻有比較大的差異[ 10 - 15 ]。這說(shuō)明在整個(gè)SSR-PCR反應(yīng)體系中，影響最終擴(kuò)增結(jié)果的是多因素共同作用的結(jié)果。同科屬樹(shù)種由于是多個(gè)因子影響最佳反應(yīng)體系，因此同科屬樹(shù)種的最佳反應(yīng)體系多是不同的。

4. 3 本研究利用正交試驗(yàn)獲得了興安落葉松的最佳反應(yīng)體系，為興安落葉松遺傳結(jié)構(gòu)的分析、林木遺傳育種研究以及分子生態(tài)學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 劉世榮，? 柴一新，? 蔡體久，? 等.? 興安落葉松人工群落生量物與凈初級(jí)生產(chǎn)力的研究[J].? 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，? 1990，? 18（2） ：40 - 46.

[2] Li Y，Wang D W，Li Z Q，et al. A molecular genetic linkage map of Eucommia ulmoides and quantitative trait loci（QTL） analysis for growth traits[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2014， 15（2） ： 2 053 - 2 074.

[3] Sanchez M， Ingrouille M J，Cowan R S， et al. Spatial structure and genetic diversity of natural populations of the Caribbean pine， Pinus caribaea var.bahamensis（Pinaceae）， in the Bahaman archipelago[J].? Botanical Journal of the Linnean Society，2014，17（3） ： 359-383.

[4] 謝文剛，? 張新全，? 彭燕，? 等.? 鴨茅SSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選[J].分子植物育種，? 2008，6（2） ： 381 - 386.

[5] 王志勇，? 郭海林，? 劉建秀.? 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化狗牙根SSR-PCR反應(yīng)體系[J].? 分子植物育種，? 2007，? 5（S1） ：? 201 - 206.

[6] Thao D V，Yamashita M，Watanabe A，et al.Development of tetranucleotide microsatellite markers in Pinus kesiya Royle ex Gordon[J].Conservation Genetics Resources，2012， 5（2） ： 405 - 407.

[7] 張振.? 興安落葉松基本群體遺傳多樣性分析[J].? 東北林業(yè)大學(xué)，? 2012

[8] 周靜，? 陳書(shū)霞，? 程智慧，? 等.? 大蒜SSR體系的建立與優(yōu)化[J].? 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，? 20（11） ：? ?117 - 122.

[9] 郭鑫，? 倪州獻(xiàn)，? 羅建中，? 等.桉樹(shù)SSR-PCR體系優(yōu)化及引物篩選應(yīng)用[J].? 分子植物育種，? 2017，15（2） ：? ?626 - 632.

[10] 蔡娟娟，? 季孔庶.? 馬尾松大配子體的SSR多樣性及其遺傳作圖策略研究[J].? 分子植物育種，? 2009，? 7（5）：? 934 - 940.

[11] 楊婭.? 利用微衛(wèi)星（SSR）分子標(biāo)記進(jìn)行油松無(wú)性系種子園及其子代群體結(jié)構(gòu)的研究[D].? ?河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，? 2006.

[12] 張冬梅，? 楊婭，? 沈熙環(huán)，? 等. 油松SSR-PCR 引物篩選及反應(yīng)體系的建立[J].? 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，? 2007， 29（2）： 13 - 17.

[13] 張瑞麗，? 許玉蘭，? 王大瑋，? 等.? 云南松SSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J].? 生物技術(shù)通報(bào)，? 2012（4） ：? 93 - 97.

[14] 郭鑫，? 倪州獻(xiàn)，? 羅建中，? 等.? 桉樹(shù)SSR-PCR 體系優(yōu)化及引物篩選應(yīng)用[J].? 分子植物育種，? 2017，? 15（2） ：? 626 - 632.

[15] 方攀，? 張運(yùn)成.? 樟子松SSR反應(yīng)體系優(yōu)化[J].? 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué).? 2013，? 32（3）：? 413 - 419.

第1作者簡(jiǎn)介：? 冷海楠（1983-），? 男，? 助理研究員，? 在讀博士，? 從事分子生態(tài)學(xué)研究。

收稿日期： 2019 - 11 - 01

（責(zé)任編輯：? ?李 丹）

Optimization of SSR-PCR Reaction System for Larix gmelinii

LENG Hainan

（ Institute of Natural Resources and Ecology， HAS. National and Provincial Joint Engineering Laboratory of Wetlands and Ecological Conservation，? Heilongjiang Harbin 150040）

Abstract The important basis of the researches on SSR marker assisting selective breeding of Larix gmelinii is to establish an SSR-PCR reaction system and get some polymorphism primers. In order to lay a foundation for the researches on applying SSR marker technology to establishment of genetic diversity and molecular breeding， some main impact factors in the Larix gmelinii SSR-PCR reaction system were analyzed by using combination method of L16（45） orthogonal test and single factor tests， including DNA templates，primer， dNTPs， Mg2+， Taq polymerase， and annealing temperature. The results showed that the optimized PCR reaction mixture was 20 μL total volume including 50ng template DNA， 5 μmol/L forward and reverse primers， 2.5 mmol/L dNTPs， 2.5 mmol/L Mg2+ and 1.0 U Taq DNA polymerase， and the optimum annealing temperature was 60℃. This result indicated that the optimized SSR-PCR reaction system could provide a vital theoretic and technical support for genetic maps establishment and molecular marker assisted breeding in Larix gmelinii.

Key words Larix gmelinii;? SSR-PCR;? Orthogonal optimization test