IL-4、IL-6和IL-13基因多態(tài)性與慢性牙周炎的相關(guān)性研究

胡杉林，秦飛，鄭江海，代梅

(長(zhǎng)江大學(xué)附屬仙桃市第一人民醫(yī)院口腔科1、檢驗(yàn)科2，湖北仙桃433000)

IL-4、IL-6和IL-13基因多態(tài)性與慢性牙周炎的相關(guān)性研究

胡杉林1，秦飛1，鄭江海1，代梅2

(長(zhǎng)江大學(xué)附屬仙桃市第一人民醫(yī)院口腔科1、檢驗(yàn)科2，湖北仙桃433000)

目的研究白細(xì)胞介素-4(-34C/T和-590C/T)、6(-174G/C和-572C/G)、13(-1112C/T和+1923C/T)的基因多態(tài)性與慢性牙周炎的相關(guān)性。方法收集2013年10月至2015年10月我院口腔科收治的慢性牙周炎患者120例為CP組，另選取健康受試者120名作為對(duì)照組，選用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性?xún)?nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析比較兩組的基因型和等位基因分布特點(diǎn)。結(jié)果兩組受檢者IL-4-34位點(diǎn)、IL-4-590位點(diǎn)、IL-6-572位點(diǎn)、IL-13+1923位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分布比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；而IL-6-572位點(diǎn)、IL-13-1112位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分布比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論IL-4-34位點(diǎn)/-590位點(diǎn)、IL-6-572位點(diǎn)、IL-13+1923位點(diǎn)的基因多態(tài)性與慢性牙周炎無(wú)關(guān)；IL-6-572位點(diǎn)、IL-13-1112位點(diǎn)的基因多態(tài)性與慢性牙周炎相關(guān)。

慢性牙周炎；白介素-4；白介素-6；白介素-13；基因多態(tài)性

慢性牙周炎(chronic periodontitis，CP)是常見(jiàn)的口腔炎癥之一，是致病菌引起的牙周支持組織慢性感染。其臨床特征表現(xiàn)為免疫細(xì)胞和炎癥因子在牙周組織中聚集以及牙周支持組織喪失[1]。該病的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但可以肯定的是與致病菌、環(huán)境因素以及宿主自身免疫能力有關(guān)。研究人員普遍認(rèn)為，促炎癥因子和抗炎癥因子的平衡失調(diào)在其病變過(guò)程中扮演重要作用[2]。白細(xì)胞介素-4(IL-4)是由活化的Th2細(xì)胞產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子，可促進(jìn)Th2細(xì)胞擴(kuò)增，抑制Th1細(xì)胞增殖，下調(diào)Th1介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[3]。IL-13是一種多效細(xì)胞因子，可以直接促進(jìn)IgE的合成，還可以抑制單核細(xì)胞抗體依賴(lài)的細(xì)胞毒作用，同時(shí)上調(diào)抗炎因子，這些都表明IL-13可以作為抗炎因子用于治療炎癥[4]。IL-6是具有多種生物學(xué)活性的促炎因子，在牙周炎患者齦溝液中IL-6的濃度明顯升高[5]。本實(shí)驗(yàn)采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性?xún)?nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性基因分析方法(PCR-RFLP)，研究IL-4、IL-6和IL-13的基因多態(tài)性的分布特點(diǎn)，探討這些細(xì)胞因子不同位點(diǎn)的多態(tài)性與慢性牙周炎的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2013年10月至2015年10月來(lái)我院就診的慢性牙周炎患者120例作為CP組，其中男性56例，女性64例；年齡34～82歲，平均(48.17±8.06)歲；另選取健康受試者120名作為對(duì)照組，其中男性48例，女性72例；年齡32～75歲，平均(50.03±7.92)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：至少有4顆磨牙和14顆可以進(jìn)行牙周評(píng)價(jià)的牙齒；受試者為無(wú)血緣關(guān)系的漢族人；無(wú)妊娠、哺乳，未感染HIV，無(wú)遺傳或系統(tǒng)性疾病，3個(gè)月內(nèi)沒(méi)有使用抗生素或免疫抑制劑，不抽煙，未經(jīng)過(guò)口腔治療。兩組患者的基本資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

1.2 試劑與儀器BS97MyCycler型PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，DEPC(焦炭酸乙二酯，Sigma公司)，dNTP、TaqDNA聚合酶(上海生工生物工程有限公司)，Trizal試劑、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen公司)。

1.3 DNA的提取收集受試者雙側(cè)頰脫落細(xì)胞，離心收集后，加Trizal試劑裂解細(xì)胞，加入氯仿分離顛倒；吸取上清液，加入等量異丙醇沉淀RNA。用M-MLV試劑盒逆轉(zhuǎn)錄得到總DNA。

1.4 聚合酶鏈反應(yīng)-限制性?xún)?nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性基因分析法(PCR-RELP)測(cè)定基因型PCR引物根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)[3-5]，見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系包括：上下游引物各0.25 μL，DNA模板5 μL，10×PBS 2.5 μL，無(wú)菌水補(bǔ)至25 μL。95℃3 min，95℃30 s，61℃30 s，72℃30 s，重復(fù)35個(gè)循環(huán)；72℃10 min根據(jù)表2所示的程序擴(kuò)增。產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，紫外燈下觀察結(jié)果。

表1 各基因引物及相應(yīng)限制性?xún)?nèi)切酶

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受檢者的IL-4基因多態(tài)性分布特點(diǎn)比較CP患者的IL-4-34位點(diǎn)CC型、CT型和TT型及C等位和T等位基因頻率分別與對(duì)照組比較，其分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；CP患者的IL-4-590位點(diǎn)CC型、CT型和TT型以及C等位和T等位基因頻率分別與對(duì)照組比較，其分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表2。

2.2 兩組受檢者的IL-6基因多態(tài)性分布特點(diǎn)比較CP組患者的IL-6-174位點(diǎn)基因型GG和GC型及G和C等位基因頻率分布分別與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而兩組均未檢測(cè)到CC型；CP組患者的IL-6-572位點(diǎn)GG型、GC型、CC型和G、C等位基因頻率分別與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表3。

2.3 兩組受檢者的IL-13基因多態(tài)性分布特點(diǎn)比較CP組患者的IL-13-1112位點(diǎn)基因型TT型、CT型、CC型和T、C等位基因頻率分布分別與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；CP組患者的IL-13+1923位點(diǎn)CC型、CT型、TT型和C、T等位基因頻率分別與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表4。

表2 兩組受檢者的IL-4-34位點(diǎn)和IL-4-590位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布比較[例(%)]

表3 兩組受檢者的IL-6-174位點(diǎn)和IL-6-572位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布比較[例(%)]

表4 兩組受檢者的IL-13-1112位點(diǎn)和IL-13+1923位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布比較[例(%)]

3 討論

牙周炎是一種慢性感染性口腔疾病，致病菌和人體的相互作用決定了疾病的發(fā)生和發(fā)展。牙周病的大多數(shù)組織損傷是由于機(jī)體對(duì)感染微生物后的應(yīng)答反應(yīng)引起的，并不是微生物直接引起[3]。牙周炎的發(fā)病過(guò)程與Th1/Th2免疫應(yīng)答平衡的失調(diào)有密切關(guān)系，Th1型細(xì)胞因子可加重牙周組織的炎癥和增加牙槽骨的破壞程度，Th2型細(xì)胞因子可有效減輕牙周組織的病變程度，對(duì)牙周組織具有保護(hù)作用[6]。

IL-4是由Th2細(xì)胞產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)Th2型免疫反應(yīng)、抑制Th1型免疫反應(yīng)；另外，IL-4能強(qiáng)烈抑制生理性骨吸收，抑制病理情況下TNF-誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成，抑制成熟骨細(xì)胞的骨吸收活性，從而抑制牙周炎的發(fā)展[7]。在牙周炎患者的血清中IL-4濃度明顯升高，并且在牙周炎病變部位的濃度也高于健康人群，說(shuō)明IL-4可能在牙周炎的發(fā)展過(guò)程中起重要作用[8]。關(guān)于IL-4基因多態(tài)性與牙周炎相關(guān)性的研究，多集中在IL-4-590或-34位點(diǎn)，國(guó)外已有報(bào)道。伊朗、韓國(guó)等亞洲國(guó)家的研究結(jié)果顯示，伊朗人和韓國(guó)人慢性牙周炎組和對(duì)照組的基因型、等位基因頻率及單倍體分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[4]。國(guó)內(nèi)近年來(lái)也有學(xué)者開(kāi)始研究漢族慢性牙周炎患者的IL-4基因多態(tài)性是否影響病情的發(fā)生和發(fā)展，但尚未發(fā)現(xiàn)IL-4-590或-34位點(diǎn)與慢性牙周炎存在相關(guān)性[4，7-9]。該研究的結(jié)果和報(bào)道一致，IL-4-590和-34位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布在慢性牙周炎患者和健康對(duì)照組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

IL-13也是一種由Th2細(xì)胞分泌的多效細(xì)胞因子，和IL-4的氨基酸序列有30%的同源性，兩種細(xì)胞因子的受體共用IL-4Rα鏈，所以IL-13與IL-4的生物學(xué)作用有部分重疊。IL-13還可以促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖，促進(jìn)IgE的合成[10]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，IL-13基因多態(tài)性與哮喘、青霉素類(lèi)過(guò)敏等免疫性疾病相關(guān)[11-13]，所以有必要研究IL-13基因多態(tài)性與慢性牙周炎的關(guān)聯(lián)。本研究得到的結(jié)果為IL-13+1923位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率在慢性牙周炎患者和對(duì)照組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而IL-13-1112位點(diǎn)的基因型分布和等位基因頻率在兩組間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，和已有報(bào)道不一致[4]?？赡苁菢颖具x擇時(shí)存在差異，而且基因型分布的P值為0.049 8，與0.05僅差0.000 2；另外諸如吸煙、心情等因素也會(huì)影響機(jī)體免疫功能，所以IL-13的基因多態(tài)性與慢性牙周炎的相關(guān)性還有待進(jìn)一步研究。

IL-6是一種多細(xì)胞效應(yīng)的促炎因子，誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞分化并分泌免疫球蛋白，促進(jìn)多種細(xì)胞的增值，抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，參與骨吸收[14]。在牙周炎患者的齦溝液中檢測(cè)到IL-6的濃度明顯高于健康受試者；治療后，患者癥狀減輕，IL-6的濃度也隨之降低，提示IL-6與慢性牙周炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[15-16]。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-6基因的啟動(dòng)子區(qū)域的多態(tài)性及其受體基因IL-6R的多態(tài)性與牙周炎的易感性相關(guān)[8]。但國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，IL-6-572G/C位點(diǎn)的基因多態(tài)性與慢性牙周炎之間不存在有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的關(guān)聯(lián)[5，8]。本研究結(jié)果顯示，慢性牙周炎患者和對(duì)照組比較，IL-6-572G/C位點(diǎn)的基因型分布和等位基因頻率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；而IL-6-174G/C位點(diǎn)的位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.669，P=0.030 7；χ2= 4.559，P=0.032 7)，提示IL-6-174G/C可能成為治療牙周炎的作用靶點(diǎn)。但I(xiàn)L-6-174G/C的突變率較低，CC型在亞洲人群中檢測(cè)不到，GC型比例也較?。涣硗饴匝乐苎椎挠绊懸蛩剌^多，因此IL-6或IL-4、IL-13基因多態(tài)性是否能作為影響牙周炎的單獨(dú)因素或多種因素相互作用關(guān)系還有待進(jìn)一步深入研究。

[1]黃滿(mǎn)英,付云,劉瑜.唾液β-葡糖糖醛酸苷酶與慢性牙周炎相關(guān)性研究[J].安徽醫(yī)藥,2015,19(2):337-340.

[2]潘先文,陶學(xué)育.米諾環(huán)素軟膏治療慢性牙周炎的療效及對(duì)患者齦溝液中超敏C反應(yīng)蛋白和白介素-10水平影響[J].中國(guó)藥師,2015, 18(1):89-91.

[3]劉溦,肖立民,章錦才,等.白細(xì)胞介素-4基因多態(tài)性與慢性牙周炎的相關(guān)性研究[J].現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志,2015,29(5):265-269.

[4]張宇婕.白細(xì)胞介素-13基因多態(tài)性與慢性牙周炎的相關(guān)性研究[D].廣州:南方醫(yī)科大學(xué),2012.

[5]范衛(wèi)華,柳大烈,章錦才,等.白細(xì)胞介素-6基因-174G/C、-572C/G多態(tài)性與冠心病和慢性牙周炎的相關(guān)性的研究[J].現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志,2009,23(4):415-418.

[6]符起亞,張黎,段莉,等.慢性牙周炎患者治療前后牙齦溝液中T細(xì)胞亞群表達(dá)水平的研究[J].海南醫(yī)學(xué),2014,25(21):3138-3140.

[7]肖玥,孔祥波,陳絳媛,等.慢性牙周炎患者血液及齦溝液中干擾素γ、白介素4水平與復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)的關(guān)系[J].中華口腔醫(yī)學(xué), 2013,48(3):150-156.

[8]陳棟,魏寧,鮑曉妮,等.IL-6、IL-6R和IL-4多態(tài)性與上海地區(qū)漢族人群慢性牙周炎的關(guān)聯(lián)研究[J].口腔醫(yī)學(xué),2012,32(9):518-521.

[9]陳棟,汪黎明,張潔,等.漢族人群慢性牙周炎患者IL-13和IL-4基因多態(tài)性及連鎖不平衡研究[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào),2013,33(6): 796-800.

[10]張宇婕,劉溦,黃雁紅,等.白細(xì)胞介素13基因-1112C/T多態(tài)性與慢性牙周炎的相關(guān)性研究[J].廣東牙病預(yù)防,2012,20(5):232-236.

[11]魏婷婷,張衛(wèi)平.IL-4和IL-13基因多態(tài)性與維吾爾族兒童哮喘的關(guān)聯(lián)研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2015,21(7):1180-1182.

[12]曹銀利,崔勤濤,唐成和,等.IL-4及其受體和IL-13基因多態(tài)性與兒童哮喘的相關(guān)性研究[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2012,22(24): 31-35.

[13]董曉慧,劉欣躍,李婧,等.IL-13-1112C/T和CYP3A4A*1G基因多態(tài)性與青霉素過(guò)敏反應(yīng)的遺傳相關(guān)性分析[J].臨床檢驗(yàn)雜志, 2015,33(5):381-384.

[14]張芳,路東升,蔡哲,等.扶脾溫腎湯對(duì)8例慢性牙周炎患者齦溝液中IL-1和IL-6的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志,2012,27(10): 2699-2703.

[15]孫旦江,呂小萍.替硝唑口腔貼片對(duì)慢性牙周炎患者齦溝液中白介素-6、8、10水平的影響及療效觀察[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2013,10 (25):71-73.

[16]李浪,馬錦華,吳亞菲.鹽酸米諾環(huán)素軟膏治療慢性牙周炎的臨床研究[J].現(xiàn)代藥物與臨床,2015,30(5):531-534.

Association between IL-4,IL-6 or IL-13 gene polymorphism and chronic periodontitis.

HU Shan-lin1,QIN Fei1,ZHENG Jiang-hai1,DAI Mei2.Department of Stomatology1,Department of Clinical Laboratory2,Xiantao First People's Hospital,Yangtae University,Xiantao 433000,Hubei,CHINA

ObjectiveTo investigate the correlation between IL-4(-34C/Tor-590C/T),IL-6(-174G/C or-572C/G)and IL-13(-1112C/Tor+1923C/T)polymorphism and chronic periodontitis.MethodsPolymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphisms(PCR-RFLP)was used to calculate the distributions of single alleles and genotypes in 120 patients with chronic periodontitis(CP group)and 120 healthy controls(control group) which came to our hospital from Oct.2013 to Oct.2015.ResultsNo significant difference was found in the alleles and genotypes of IL-4-34,IL-4-590,IL-6-572 and IL-13+1923 locus between CP group and control group(P＞0.05).But there were significant difference in the alleles and genotypes of IL-6-572 and IL-13-1112 locus between the two groups.ConclusionIL-4-34/-590,IL-6-572 and IL-13+1923 gene polymorphisms have nothing to do with chronic periodontitis,while IL-6-572 and IL-13-1112 are related to the occurrence and development of chronic periodontitis.

Chronic periodontitis;IL-4;IL-6;IL-13;Gene polymorphisms

R781.4+2

A

1003—6350（2016）21—3455—03

2016-04-11)

胡杉林。E-mail：husl2518@163.com

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.21.005