正交試驗(yàn)優(yōu)化檳榔免煎顆粒提取工藝

倫志彩　　隋　瑩　　徐　剛　　胡朝奇　　徐會(huì)丹　　陳　新.山東省莒縣中醫(yī)院藥劑科，山東日照　76800；.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林長(zhǎng)春07；.蕪湖先聲中人藥業(yè)有限公司質(zhì)量管理部，安徽蕪湖　080；.蕪湖綠葉制藥有限公司生產(chǎn)技術(shù)部，安徽蕪湖　000

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正交試驗(yàn)優(yōu)化檳榔免煎顆粒提取工藝

倫志彩1隋瑩2徐剛3胡朝奇3徐會(huì)丹4陳新2
1.山東省莒縣中醫(yī)院藥劑科，山東日照276800；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130117；
3.蕪湖先聲中人藥業(yè)有限公司質(zhì)量管理部，安徽蕪湖241080；4.蕪湖綠葉制藥有限公司生產(chǎn)技術(shù)部，安徽蕪湖241000

[摘要]目的優(yōu)選檳榔免煎顆粒提取工藝。方法以出膏率和檳榔堿含量為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)和單因素試驗(yàn)考察檳榔藥材浸泡時(shí)間、固液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)檳榔提取工藝的影響，通過高效液相色譜法測(cè)定檳榔堿的含量，SCX-強(qiáng)陽離子交換樹脂柱（4.6mm×250mm，5μm）；乙腈-磷酸溶液（2→1000）（70∶30），檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm，流速1mL/min，進(jìn)樣量10μL。結(jié)果檳榔免煎顆粒的最優(yōu)提取工藝為藥材浸泡2 h，加6倍量水，1 h/次，煎煮2次；平均出膏率為22.69%（RSD為1.67%），檳榔堿平均含量為4.63mg/g（RSD為1.82%）。結(jié)論優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定、可行，為檳榔免煎顆粒的開發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]檳榔曰免煎顆粒曰正交試驗(yàn)曰提取工藝曰單因素分析

檳榔為棕櫚科（Palmaceae）檳榔屬常綠喬木的干燥成熟種子，收載于《名醫(yī)別錄》，檳榔具有行氣利水、驅(qū)蟲消積的功效[1]，臨床應(yīng)用較為廣泛，傳統(tǒng)檳榔臨床應(yīng)用多入湯劑，但是中藥湯劑由于攜帶不便、不易儲(chǔ)存等弊端已無法滿足現(xiàn)代人們的需要，因此中藥丸劑、片劑等新劑型逐步應(yīng)用于臨床，雖然這些新劑型改善了傳統(tǒng)湯劑攜帶不便、不易儲(chǔ)存的弊端，但是臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，新劑型的臨床療效較傳統(tǒng)湯劑較差，基于此，部分藥學(xué)工作者提出了中藥免煎顆粒，即以傳統(tǒng)中藥飲片作為原料，經(jīng)過現(xiàn)代提取、干燥、制粒、包裝所制成的顆粒劑。中藥免煎顆粒具有傳統(tǒng)中藥成分、性味、歸經(jīng)、功能主治的全部特點(diǎn)[2]，且方便攜帶、易于保存，同時(shí)也可將不同的免煎顆粒組方隨證加減，體現(xiàn)中藥“多組分、整體治療”的特點(diǎn)?；诖?，本次研究采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行檳榔免煎顆粒提取工藝研究，以為檳榔免煎顆粒的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下：

1　儀器與材料

LC-15C型高效液相色譜儀（日本島津公司），HX-400A高速中藥粉碎機(jī)（浙江省永康市溪岸五金藥具廠），PB303-SMETTLER TOLEDO天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]，DZF-6050真空干燥箱（上海一恒科技有限公司），氫溴酸檳榔堿對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所；批號(hào)：120541-201304），乙腈為色譜純，其他試劑為分析純，檳榔果購(gòu)于海南霖甘源食品有限公司，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室姜大成教授鑒定為棕櫚科（Palmae）植物檳榔（Areca catechu L.）的干燥果皮及干燥成熟種子。

2　方法與結(jié)果

2.1方法學(xué)考案

2.1.1色譜條件SCX-強(qiáng)陽離子交換樹脂柱（4.6mm× 250 mm，5μm）；流動(dòng)相乙腈-磷酸溶液（2→1000）（70∶30）（濃氨試液調(diào)節(jié)pH值至3.8）；檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10μL，理論板數(shù)按檳榔堿峰計(jì)算應(yīng)不低于3000[3]。檳榔供試品、對(duì)照品溶液HPLC色譜圖見圖1。

圖1　各溶液的高效液相色譜圖

2.1.2供試品溶液的制備精密稱定過5號(hào)篩檳榔細(xì)粉0.3 g，置具塞錐形瓶中，先加入50 mL乙醚，再加入3mL碳酸鹽緩沖液（1.91 g碳酸鈉+0.56 g碳酸氫鈉→100mL），室溫放置30min，振搖；加熱回流30min，取乙醚液，置于盛有1mL磷酸溶液（5→1000）的蒸發(fā)皿中，蒸干，殘?jiān)右颐鸭訜峄亓魈崛?次（30mL和20 mL），15 min/次，合并提取液，揮散溶劑，殘?jiān)?0%乙腈溶液溶解，并轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加50%乙腈稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.1.3對(duì)照品溶液的制備精密稱定氫溴酸檳榔堿對(duì)照品5mg，置于10 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液儲(chǔ)備液，精密量取對(duì)照品溶液儲(chǔ)備液1 mL，置于5 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（檳榔堿重量=氫溴酸檳榔堿重量/1.5214）。

2.1.4線性關(guān)系考察精密量取對(duì)照品溶液儲(chǔ)備液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL置于10mL量瓶中，加50%乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得不同濃度對(duì)照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得線性方程Y=18969 X+1283（r=0.9998），說明氫溴酸檳榔堿在0.025～1.250 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5精密度試驗(yàn)精密量取對(duì)照品溶液10μL，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，峰面積的RSD為1.13%，說明儀器精密度良好。

2.1.6溶液穩(wěn)定性考察精密量取對(duì)照品溶液10μL，分別于對(duì)照品溶液制備后的0、1、2、3、6、12 h，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果峰面積RSD為1.69%，說明氫溴酸檳榔堿對(duì)照品溶液在制備后12 h內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定。

2.1.7重復(fù)性試驗(yàn)按照“2.1.2”項(xiàng)下供試品制備方法分別制備6份供試品，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別注入供試品溶液和對(duì)照品溶液各10μL，計(jì)算供試品中檳榔堿含量，結(jié)果6份供試品溶液中檳榔堿含量的RSD為1.82%，檳榔堿的平均含量為4.52mg/g，說明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8回收率試驗(yàn)依次精密稱定0.12、0.15、0.18 g檳榔細(xì)粉各3份，分別置于具塞錐形瓶中，分別向裝有0.12 g檳榔細(xì)粉的3個(gè)錐形瓶中各加入4.12mg氫溴酸檳榔堿對(duì)照品，向裝有0.15 g檳榔細(xì)粉的3個(gè)錐形瓶中各加入3.43 mg氫溴酸檳榔堿對(duì)照品，向裝有0.18 g檳榔細(xì)粉的3個(gè)錐形瓶中各加入2.74mg氫溴酸檳榔堿對(duì)照品，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法分別制備9份供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定檳榔堿含量，結(jié)果平均回收率為98.94%，RSD為1.95%，說明方法準(zhǔn)確性良好。

2.2檳榔免煎顆粒提取方法考察

2.2.1藥材浸泡時(shí)間及藥材吸水率的單因素考察取檳榔飲片100 g，加5倍量水浸泡，分別于浸泡后30、60、90、120、150、180min觀察一次藥材浸透的情況，直至全部浸透，濾出全部未被吸收的水液，稱取藥材濕重，計(jì)算平均吸水率，其公式為：吸水率（%）=[（藥材濕重-藥材量）/藥材量]×100%，試驗(yàn)結(jié)果表明，檳榔飲片在浸泡120min以后，吸水率不會(huì)顯著升高，吸水率為93%左右，由此確定，提取檳榔飲片的第1次加水量追加1倍，并在首次加熱提取之前先浸泡2 h。見表1。

表1　浸泡時(shí)間與藥材吸水率單因素考察結(jié)果（%）

2.2.2檳榔提取工藝考察選取固液比、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)為考察因素，以出膏率、檳榔堿含量作為考察指標(biāo)，采用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)[4]，綜合評(píng)分（%）=（出膏率i/出膏率max）×30%+（檳榔堿i/檳榔堿max）×70%。方差分析結(jié)果顯示，各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響的重要性依次為A＞C＞B，即加水量A和煎煮次數(shù)C是主要影響因素，煎煮時(shí)間B對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無顯著性影響，結(jié)合直觀分析結(jié)果和從實(shí)際實(shí)驗(yàn)效率角度進(jìn)行考慮，A2B1C2為最佳提取工藝，即，藥材浸泡2 h，加6倍量水（含之前浸泡藥材時(shí)加1倍量水），煎煮1 h，趁熱濾過；第2次加水5倍量，煎煮1 h，趁熱濾過，合并濾液。因素水平見表2，試驗(yàn)安排及結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表2　因素水平表

2.3驗(yàn)證試驗(yàn)

按照最優(yōu)提取工藝分別提取3份檳榔提取液，結(jié)果平均出膏率為22.69%（RSD為1.67%），檳榔堿平均含量為4.63mg/g（RSD為1.82%），說明優(yōu)選的工藝穩(wěn)定、可靠。

表3　正交試驗(yàn)L 9（3 4）試驗(yàn)安排及直觀結(jié)果

表4　方差分析結(jié)果

3　討論

檳榔為檳榔成熟的干燥種子，研究發(fā)現(xiàn)，檳榔具有胃腸道促進(jìn)、解熱、鎮(zhèn)痛、消炎和抗腫瘤的作用，在臨床多種疾病的治療上應(yīng)用較為廣泛[6-9]，因此如何有效地提高檳榔中藥效物質(zhì)的提取率，對(duì)于檳榔相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)具有重要意義。由于檳榔藥材質(zhì)地較為堅(jiān)硬，為了提高檳榔中有效成分的提取效果，提取前應(yīng)對(duì)原藥材進(jìn)行充分地浸泡，從而有效地減低藥材細(xì)胞中有效成分的濃度、降低細(xì)胞內(nèi)的滲透壓[10-12]，從而有利于提取有效成分。本次研究通過對(duì)考察不同時(shí)間原藥材吸水率發(fā)現(xiàn)，120min時(shí)原藥材的吸水率達(dá)到最高（93.43%），提示檳榔藥材適宜的浸泡條件為加1倍量水，浸泡2 h，此時(shí)檳榔藥材細(xì)胞中水分吸收充分，滲透壓最低，有利于提取。生物堿是檳榔中的重要藥效物質(zhì)，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)[13-15]，中藥中的檳榔堿具有顯著的驅(qū)蟲效果，尤其對(duì)于絳蟲，驅(qū)蟲效果最為顯著，同時(shí)還具有一定的擬膽堿作用，本次進(jìn)行工藝優(yōu)選的過程中，使用檳榔堿和出膏率作為指標(biāo)，一方面是對(duì)提取物的藥效進(jìn)行評(píng)價(jià)，另一方面是對(duì)制粒的產(chǎn)率進(jìn)行初步評(píng)價(jià)[16]，通過使用L9（34）正交試驗(yàn)，得出最優(yōu)工藝為“藥材浸泡2 h，加6倍量水（含之前浸泡藥材加1倍量水），煎煮1 h，趁熱濾過；第二次加水5倍量，煎煮1 h，趁熱濾過，合并濾液”，此工藝條件下提取物中檳榔堿的含量最高，且出膏率最大，是檳榔免煎顆粒的理想提取工藝，可為檳榔免煎顆粒大生產(chǎn)提供一定參考。

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Optim ization of extraction process for boil-free granule of areca catechu

LUN Zhicai1SUIYing2XU Gang3HU Chaoqi3XU Huidan4CHEN Xin2
1.Departmentof Pharmacy,Juxian Hospital of Traditional Chinese Medicine,Shandong Province,Rizhao 276800,China;2.School of Pharmaceutical Sciences,Changchun University of Chinese Medicine,Jilin Province,Changchun 130117,China;3.Quality Management Department,Wuhu Simcere Sino-implant Pharmaceutical Co.Ltd.,Anhui Province,Wuhu 241080,China;4.Production Technology Department,Wuhu LUYE Pharmaceutical Co.Ltd.,Anhui Province,Wuhu 241000,China

[Abstract]Objective To optimize extraction process for boil-free granule of areca catechu.M ethods With the extraction amount and content of arecoline as indexes,single factor analysismethod was used to develop soak time of areca catechu,and effects of ratio of solid-liquid,extraction times,extraction quantity on extraction technology were investigated by orthogonal test.The content of arecoline was determined by HPLC,SCX-strong cation chromatographic column(4.6mm×250mm,5μm),acetonitrile-phosphoric acid(2→1000)(70∶30),λ=215 nm,v=1mL/min,sample quantity was 10μL.Results The best extraction process for boil-free granule of areca catechu was as following,soak time was 2 h,ratio of solid-liquid was 6∶1,extraction time was 1 h,extraction quantity was 1.Average extraction rate was 22.69%(RSD=1.67%),average content of arecoline was 4.63mg/g(RSD=1.82%).Conclusion This optimized extraction process is stable and feasible,which can provide experimental basis for development of areca catechu boilfree granule.

[Key words]Areca catechu;Boil-free granule;Orthogonal test;Extraction process;Single factor analysis

收稿日期：（2015-10-03本文編輯：趙魯楓）

[通訊作者]陳新（1965.5-），女，教授，長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)教研室主任；研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)開發(fā)與利用。

[基金項(xiàng)目]吉林省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目（2010-pt011）；安徽省蕪湖市科技惠民計(jì)劃項(xiàng)目（2013hm43）。

[中圖分類號(hào)]R927.1

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1673-7210（2016）01（a）-0043-04