肝硬克顆粒中丹酚酸B的含量測(cè)定

王如意　　黃百祺　　林素蘭.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心，廣東廣州　5050；.廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院生物技術(shù)系，廣東廣州　50430

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肝硬克顆粒中丹酚酸B的含量測(cè)定

王如意1黃百祺2林素蘭1
1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心，廣東廣州510520；2.廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院生物技術(shù)系，廣東廣州510430

[摘要]目的探討用高效液相色譜法測(cè)定肝硬克顆粒中丹酚酸B的含量。方法采用島津C18色譜柱（Diamonsil（鉆石）C18，250mm×4.6mm，5μm），柱溫：30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：286 nm；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59）。結(jié)果丹酚酸B的線性范圍為19.8～99.0μg/mL，回歸方程為Y=14328C-6710.3（r=0.9998）；平均回收率為96.85%，RSD為0.77%。結(jié)論本法結(jié)果準(zhǔn)確，專屬性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便，成本低，適合于肝硬克顆粒中丹酚酸B含量的測(cè)定。[關(guān)鍵詞]丹酚酸B曰肝硬克顆粒曰高效液相色譜法曰含量測(cè)定

肝硬克顆粒是由丹參、黃芪等多味中藥經(jīng)不同溶劑提取成浸膏，加以輔料混合而制成的復(fù)方制劑，具有清熱解毒、活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)之功效，用于慢性乙型肝炎，防治肝炎后肝纖維化及早期肝硬化。丹參為本方中的君藥，生產(chǎn)時(shí)以水作為溶媒，低溫下超聲提取2次，濾液減壓濃縮得到濕浸膏，主要含脂溶性的二萜醌類和水溶性的酚酸類，這兩類成分均為丹參的有效成分[1]。酚酸類成分包括丹酚酸A，丹酚酸B，丹酚酸C等。其中丹酚酸B是含量最高的活性成分。文獻(xiàn)記載表明[2-8]，丹酚酸B具有抗凝、抗氧化等活性，具有抗肝纖維化、抗動(dòng)脈粥樣硬化和改善記憶功能障礙等作用。

丹酚酸B（salvianolic acid B），也叫丹參酚酸B、丹參酸乙等。藥理研究和文獻(xiàn)記載表明[17-22]，丹酚酸B具有抗凝、抗氧化的活性，具有抗肝纖維化、抗動(dòng)脈粥樣硬化和改善記憶功能障礙等作用。丹酚酸B可能通過下調(diào)肝組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）表達(dá)抑制膠原的合成，同時(shí)下調(diào)TIMP-2表達(dá)而使膠原分解加強(qiáng)，從而減輕肝纖維化的程度，對(duì)肝纖維化的形成有明顯的抑制作用，并推測(cè)丹酚酸B抗肝纖維化的部分機(jī)制在于抑制了活化貯脂細(xì)胞的增殖，并通過抑制貯脂細(xì)胞生成細(xì)胞外基質(zhì)而減少了膠原纖維在肝內(nèi)的沉積，以及干擾了狄氏間隙基底膜的形成而減輕了肝竇毛細(xì)胞血管化等，改善纖維化肝臟的脂質(zhì)過氧化損傷并降低肝組織MMP-2活性是丹酚酸B鹽預(yù)防肝纖維化的重要作用機(jī)制。

肝硬克顆粒在申報(bào)時(shí)，君藥丹參只驗(yàn)證了其脂溶性主要活性成分丹參酮ⅡA的含量測(cè)定方法，而丹酚酸B的含量檢測(cè)對(duì)于藥物質(zhì)量控制非常重要。鑒于丹酚酸B的重要性，以及各個(gè)藥物制劑中的生產(chǎn)工藝、制劑處方均不一樣，各藥劑的分析方法需經(jīng)過驗(yàn)證，證明采用的方法適合于相應(yīng)的檢測(cè)要求是必要的。

1　儀器與試藥

1.1儀器設(shè)備

UV-240型紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司），LC10AT高效液相色譜儀（日本島津公司），SPDIOAVP紫外可見檢測(cè)器（浙大N2000色譜工作站），AUY220電子天平（日本島津公司）等。

1.2試藥與藥品

丹酚酸B對(duì)照品（購自中國食品藥品檢定研究院；批號(hào)：111562-201212），肝硬克顆粒（深圳同安藥業(yè)公司生產(chǎn)；批號(hào)：131101、131102、131103、小試1.131201、小試2.131202、小試3.131203）。乙腈、甲醇、甲酸為色譜純，其他試劑均為分析純，

2　色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

2.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

以水為空白溶液，取丹酚酸B對(duì)照品溶液（50μg/mL），在200～400 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，丹酚酸B在204 nm和286 nm處有最大吸收，考慮204 nm處于近紫外區(qū)的末端，末端干擾較大，故選擇286 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2系統(tǒng)使用性試驗(yàn)

色譜柱以十八烷基鍵合硅膠為填充劑；甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59）為流動(dòng)相；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為286 nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量20μL。在此色譜條件下丹酚酸B的分離度為1.85。

3　方法與結(jié)果

3.1對(duì)照品溶液的制備

取丹酚酸B對(duì)照品適量，精密稱定，加水制成每毫升含60μg的溶液，即得。

3.2供試品提取方法的選擇

文獻(xiàn)表明，丹參生藥中丹酚酸B的提取以70%甲醇的提取率最高，其次是70%乙醇，水的提取率相對(duì)較低。但是3種提取溶劑差異并不是特別顯著，水的提取率也為70%甲醇的95.06%，加上水的成本低，又不造成環(huán)境污染[9]。且考慮到丹酚酸B對(duì)熱不穩(wěn)定，其丹參水提液在長(zhǎng)時(shí)間受熱中，丹酚酸B的含量大大降低[10]。故采用冰浴超聲法對(duì)樣品進(jìn)行前處理。

取同批供試品0.6 g，精密稱定，置50mL量瓶中，加30mL溶劑，超聲處理，放冷，加溶劑至刻度，搖勻，離心，取上清液，用0.45μm微孔濾膜過濾，即得。（溶劑分別為70%甲醇和水，超聲時(shí)間分別為15、30、45 min，冰浴保溫），結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，用70%甲醇和純水超聲提取30 min后測(cè)得的含量相等，故樣品處理采用純水超聲提取30min。

3.3專屬性試驗(yàn)

按處方中藥味比例組成，取除丹參外的其余藥材，按制備工藝要求制成不含丹參的陰性樣品，再按”3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果在供試品的色譜圖（圖1C）中，在與對(duì)照品色譜峰（圖1A）相應(yīng)位置上，有相同保留時(shí)間的色譜峰，而陰性對(duì)照溶液的色譜圖在此保留時(shí)間處未見明顯的色譜峰（圖1B），故認(rèn)為無干擾。見圖1。

溶劑種類　　超聲時(shí)間（min）　　丹酚酸B含量Cx（mg/g）70%甲醇純水15 30 45 15 30 45 5.04 5.33 5.31 5.13 5.33 5.24

3.4線性關(guān)系考察

精密稱取丹酚酸B對(duì)照品4.95mg，加水制成濃度為99.0μg/mL的丹酚酸B對(duì)照溶液。精密量取上述對(duì)照品溶液加水制成濃度分別為19.8、39.6、59.4、79.2、99.0μg/mL的丹酚酸B對(duì)照溶液，分別精密吸取上述系列溶液各20μL進(jìn)樣測(cè)量，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，丹酚酸B量（μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=14328X-6710.3，r=0.9998，表明丹酚酸B在19.8～99μg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積值有良好的線性關(guān)系。

3.5精密度試驗(yàn)

取同一批樣品，按“3.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，精密吸取同一供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)下的色譜條件下進(jìn)樣20μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖的峰面積，計(jì)算RSD為0.32%（n=6），表明儀器精密度良好。

3.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，室溫下放置，分別在0、2、4、8、12、24 h吸取20μL進(jìn)樣考察，按“2.2”項(xiàng)下色譜法測(cè)定丹酚酸B的峰面積，計(jì)算RSD為1.21%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.7重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取供試品3份，按“3.2”項(xiàng)下方法操作，在“2.2”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)行分析測(cè)定，計(jì)算丹酚酸B 的RSD為1.65%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

3.8加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品（批號(hào)：131102）適量，精密稱取0.3 g，共6份，置50 mL量瓶中，分別精密加入丹酚酸B對(duì)照品溶液25mL，超聲處理30min，放冷，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，離心，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，采用外標(biāo)法求出丹酚酸B的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)確定的丹酚酸B含量測(cè)定方法的準(zhǔn)確度較好。見表2。

圖1　丹酚酸B對(duì)照品、陰性樣品、樣品色譜圖

表2　丹酚酸B回收率測(cè)定結(jié)果

3.9樣品含量測(cè)定

按“3.2”項(xiàng)下方法制備供試液，測(cè)定3批成品和3批小試樣品中丹酚酸B的含量，每樣平行測(cè)定3次，實(shí)驗(yàn)表明，與肝硬克顆粒成品相比，小試樣品的丹酚酸B的含量較高，但丹酚酸B混合較不均勻。見表3。

4　討論

考慮樣品中的丹酚酸B是丹參的水溶性活性成分，故在提取時(shí)比較了不同溶劑、不同時(shí)間的冰浴超聲、水煮加熱回流的對(duì)比試驗(yàn)。結(jié)果表明用70%甲醇比水的提取率要高，但低于用超聲法處理的提取率，且隨著加熱回流處理時(shí)間的增加，含量逐漸降低。由此可見，用水作為溶劑，冰浴超聲法提取肝硬克顆粒中丹酚酸B，操作簡(jiǎn)單且避免了因丹酚酸B的熱不穩(wěn)定性而造成的損失，超聲時(shí)間定在30min為宜。

測(cè)定肝硬克顆粒樣品中丹酚酸B的含量時(shí)，小試的含量較高，但是混合較不均勻；成品的含量比小試的含量低，但是混合較均勻?？赡苁堑し铀酈的對(duì)熱不穩(wěn)定性，所以在成品混合過程中，丹酚酸B分解。因此在以后生產(chǎn)中，要注意成品混合時(shí)溫度的控制，保證成品中丹酚酸B的含量。

綜上所述，本試驗(yàn)用水作為溶劑、冰浴超聲提取肝硬克顆粒中的丹酚酸B，并用高效液相色譜法測(cè)定其含量，結(jié)果準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、成本低，適合于肝硬克顆粒中丹酚酸B含量的測(cè)定。

表3　樣品的含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

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Content determ ination of salvianolic acid B in Ganyingke Granules

WANG Ruyi1HUANG Baiqi2LIN Sulan1
1.Experimental and Training Centre,Guangdong Food and Drug Vacational College,Guangdong Province,Guangzhou 510520,China;2.Department of Biotechnology,Guangdong Vacational College of Science and Trade,Guangdong Province,Guangzhou 510430,China

[Abstract]Objective To evaluate amethod for the determination of salvianolic acid B in Ganyingke Granules by high performance liquid chromatography(HPLC)method.M ethods Determination was conducted at 30°C and at 286 nm with a C18column(SHIMADZU,Diamonsil,250 mm×4.6 mm,5μm),and methanol-acetonitrile-formic acid-water (30∶10∶1∶59)was used asmobile phase.Results The regression equation was Y=14328C-6710.3(r=0.9998)with a linear range from 19.8 to 99.0μg/mL,average recovery was 96.85%,and RSD was 0.77%(n=6).Conclusion This method is accurate and easy to operate with good specificity,which is suitable for the content determination of salvianolic acid B in Ganyingke Granules.

[Key words]Salvianolic acid B;Ganyingke Granules;High performance liquid chromatography;Content determination

收稿日期：（2015-09-28本文編輯：趙魯楓）

[通訊作者]黃百祺（1983-），男，碩士，從事生物技術(shù)研究。

[作者簡(jiǎn)介]王如意（1983-），男，碩士，從事天然藥產(chǎn)物研究。

[基金項(xiàng)目]廣東省中醫(yī)藥局科研課題項(xiàng)目（20141199）。

[中圖分類號(hào)]R927.2

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1673-7210（2016）01（a）-0039-04