他克莫司處理的未成熟樹突狀細(xì)胞對(duì)小鼠炎癥性腸病的作用及其機(jī)制研究

魏丹蕓　　張　洪　　彭　銳　　張　英武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖北武漢　430060

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他克莫司處理的未成熟樹突狀細(xì)胞對(duì)小鼠炎癥性腸病的作用及其機(jī)制研究

魏丹蕓張洪彭銳張英
武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖北武漢430060

[摘要]目的探討他克莫司（Tac）處理的未成熟樹突狀細(xì)胞（imDC）對(duì)小鼠克羅恩病模型中炎性腸病的作用及其具體的機(jī)制。方法體外培養(yǎng)小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞（DC），加入Tac處理抑制其成熟，以2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）灌腸法制作克羅恩病模型。將48只小鼠隨機(jī)分為4組，分別為對(duì)照組、模型組、imDC組、Tac-imDC組，每組各12只。對(duì)照組給予50%乙醇溶液灌腸，其余三組分別給予TNBS灌腸造模，各組在灌腸前24 h和灌腸后24 h分別經(jīng)尾靜脈輸注相應(yīng)的PBS或者imDC，對(duì)照組和模型組經(jīng)尾靜脈輸注PBS，imDC組輸注1×106個(gè)未經(jīng)Tac處理過的imDC，Tac-imDC組輸注1×106個(gè)經(jīng)過Tac處理過的imDC。每天記錄小鼠一般情況，7 d后分別行疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）、結(jié)腸大體形態(tài)損傷指數(shù)（CMDI）和結(jié)腸病理組織學(xué)（TDI）評(píng)分，取小鼠結(jié)腸組織行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)白介素-10（IL-10）、轉(zhuǎn)化生子因子-β（TGF-β）和白介素-17（IL-17）的水平變化。結(jié)果相比于對(duì)照組，模型組的DAI、CMDI和TDI評(píng)分明顯升高[DAI：（0.75±0.10）比（5.12±1.05）分；CMDI：（0.70± 0.12）比（6.52±1.18）分；TDI：（0.34±0.03）比（5.53±1.12）分；均P＜0.01]，TGF-β、IL-10水平明顯下降[TGF-β：（20.421±2.091）比（14.356±1.756）pg/mL；IL-10：（6.162±0.512）比（4.012±0.469）pg/m；均P＜0.01]，IL-17水平明顯升高[（19.232±2.187）比（25.754±3.621）pg/mL，P＜0.01]。相對(duì)于模型組，imDC組和Tac-imDC組的DAI、CMDI和TDI評(píng)分均顯著下降[DAI：（5.12±1.05）比（4.01±0.92）、（3.12±0.81）分；CMDI：（6.52±1.18）比（5.04±1.05）、（3.54± 0.98）分；TDI（5.53±1.12）比（4.00±0.88）、（3.22±0.92）分；P＜0.05或P＜0.01]，而TGF-β、IL-10水平上升[TGF-β：（14.356±1.756）比（16.012±2.012）、（19.002±2.756）pg/mL；IL-10：（4.012±0.469）比（4.956±0.534）、（5.618±0.595）pg/mL；P＜0.05或P＜0.01]，IL-17水平明顯下降[（25.754±3.621）比（22.741±3.051）、（20.319±2.654）pg/mL，P＜0.05或P＜0.01]。相對(duì)于imDC組，Tac-imDC組的變化更為顯著[DAI：（4.01±0.92）比（3.12±0.81）分；CMDI：（5.04±1.05）比（3.54±0.98）分；TDI：（4.00±0.88）比（3.22±0.92）分；TGF-β：（22.741±3.051）比（20.319±2.654）pg/mL；IL-17：（16.012± 2.012）比（19.002±2.756）pg/mL；IL-10：（4.956±0.534）比（5.618±0.595）pg/mL；P＜0.05或P＜0.01]。結(jié)論未成熟的樹突狀細(xì)胞能明顯緩解小鼠克羅恩病模型中小鼠炎癥性腸病，而經(jīng)過Tac處理的未成熟樹突狀細(xì)胞更能加強(qiáng)其抑制炎癥的作用，其機(jī)制可能是介導(dǎo)了Th17/Treg軸的偏倚。

[關(guān)鍵詞]他克莫司；樹突狀細(xì)胞；小鼠炎癥性腸病；克羅恩病模型

樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）作為體內(nèi)最重要的抗原提呈細(xì)胞，不僅直接參與機(jī)體對(duì)外來抗原的免疫反應(yīng)，而且在誘導(dǎo)免疫耐受中也起著十分重要的作用，其誘導(dǎo)免疫耐受的機(jī)制可能是在未成熟的DC （immaturate dendritic cell，imDC）表面低表達(dá)主要組織相容性抗原-Ⅱ（MHC-Ⅱ）和共同刺激因子CD80、CD86，缺失這些表面因子后其抗原提呈能力減弱，無法提供幼稚T細(xì)胞向效應(yīng)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化的第二信號(hào)[1]。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為小鼠克羅恩病模型主要是以輔助性T細(xì)胞1（T helper 1 cell，Th1）過度活化為主的免疫失調(diào)引起的疾病[2]，但是近來發(fā)現(xiàn)輔助性T細(xì)胞17（T helper 17 cel，Th17）/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）軸的失衡在疾病發(fā)生和發(fā)展方面也起著重要的作用[3]。Tac作為新一代的新型免疫抑制劑，能全面抑制T淋巴細(xì)胞的的作用，較環(huán)孢素強(qiáng)100倍，在潰瘍性結(jié)腸炎的治療中已經(jīng)初見其效[4]。本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)小鼠骨髓來源的imDC，在培養(yǎng)過程中經(jīng)過Tac

處理，檢測(cè)其成熟程度，研究其在緩解小鼠炎癥性腸病模型中的作用及其機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

1.1.1動(dòng)物6～8周齡SPF級(jí)雌性bal/c小鼠48只，體重18～22 g，購于武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[許可證號(hào)：SCXK（鄂）2014-0004]，飼養(yǎng)于武漢市三醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.2試劑胎牛血清購于浙江天杭生物科技股份公司；重組小鼠白細(xì)胞介素4（rm IL-4）和重組粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rmGM-CSF）購于Peprotech公司；2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）購于Sigma公司；三氫-吲哚菁型染料（PE-Cy7）標(biāo)記的抗鼠CD11c抗體，藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的抗小鼠CD80、CD86、MHC-Ⅱ以及同型對(duì)照抗體均購于美國BD公司；白介素-10 （IL-10）、白介素-17（IL-17）、TGF-β酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)試劑盒均購于R&D公司。

1.2小鼠imDC的體外培養(yǎng)和鑒定

1.2.1小鼠骨髓源imDC的獲取和培養(yǎng)參考O'Flynn 等[5]的方法，取小鼠完整的股骨和脛骨，離斷干骺端后，用1mL注射器針頭抽吸PMRI 1640培養(yǎng)基沖洗骨髓，經(jīng)過濾后加入紅細(xì)胞裂解液后離心以含10%的胎牛血清PMRI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整密度為1×106個(gè)/mL，分布于六孔板中，培養(yǎng)于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，培養(yǎng)4 h后去除含淋巴細(xì)胞的懸液，重新加入新鮮的10%胎牛血清PMRI 1640完全培養(yǎng)基，并添加細(xì)胞因子rm IL-4（5 ng/mL）和rmGM-CSF（10 ng/mL）。隔天半量換液，重新加入含細(xì)胞因子的新鮮培養(yǎng)基，第6天收獲未成熟的DC，而Tac處理的DC則在開始培養(yǎng)DC時(shí)加入，濃度為10 ng/mL，換液時(shí)加入同樣劑量的Tac。

1.2.2imDC的鑒定分別收集兩組不同培養(yǎng)方法的DC，離心重懸，在細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL 100μL的反應(yīng)體系中分別加入抗小鼠的PE-Cy7-CD11c，PECD80，PE-CD86，PE-MHC-Ⅱ5μL，同時(shí)設(shè)同型對(duì)照，避光孵育半小時(shí)后以PBS洗滌兩遍，后加入4%多聚甲醛固定后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組、模型建立及細(xì)胞輸注

1.3.1分組將48只小鼠隨機(jī)分為4組，每組12只，第1組為對(duì)照組，以50%乙醇灌腸前后1 d各經(jīng)尾靜脈輸注PBS，第2組為模型組，以TNBS灌腸前后24 h各經(jīng)尾靜脈輸注PBS，第3組為imDC組，在TNBS灌腸前后24 h各經(jīng)尾靜脈輸注1×106個(gè)未經(jīng)Tac處理的imDC。第4組為Tac-imDC組，在TNBS灌腸前后24 h各經(jīng)尾靜脈輸注1×106個(gè)經(jīng)過Tac處理過的imDC。

1.3.2小鼠克羅恩病模型的建立按照Eeckhaut等[6]方法，小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后給予禁食不禁水24 h，模型組、imDC組、Tac-imDC組經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉（30mg/kg）麻醉后，倒懸位，將直徑為0.2mm的聚乙烯管插入肛門約5 cm，緩慢灌入TNBS/50%乙醇混合溶液0.1 mL（1體積TNBS水溶液與1體積無水乙醇混勻），而對(duì)照組給予灌入等劑量50%乙醇，拔管后繼續(xù)保持倒立約1min，放回籠中正常飼養(yǎng)。

1.3.3經(jīng)尾靜脈輸注藥物在灌腸前24 h和灌腸后24 h經(jīng)尾靜脈輸注相應(yīng)的藥物，對(duì)照組和模型組輸注PBS，imDC組輸注未經(jīng)Tac處理過的imDC，Tac-imDC組輸注經(jīng)Tac處理過的imDC。

1.4觀察指標(biāo)與評(píng)價(jià)方法

1.4.1小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）觀察及評(píng)分根據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[7]行小鼠DAI評(píng)分，觀察小鼠的精神狀態(tài)，大便的性質(zhì)，有無血便，每天記錄小鼠的的體重變化情況。0分：大便性質(zhì)正常，無血便及隱血便，體重?zé)o下降；1分：大便松散，隱血便陽性弱陽性，體重下降＞0～5%；2分：大便松散，隱血陽性，體重下降＞5%～10%；3分：呈稀便，肉眼血便，體重下降＞10%～15%；4分：呈稀便，大量肉眼血便，體重下降＞15%。DAI評(píng)分=大便性質(zhì)評(píng)分+血便評(píng)分+體重變化評(píng)分。

1.4.2小鼠結(jié)腸大體形態(tài)損傷指數(shù)（CMDI）觀察及評(píng)分造模后第7天處死小鼠后，取全段結(jié)腸組織在解剖顯微鏡下觀察潰瘍及炎癥情況，根據(jù)Wallace等[8]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分：0分：基本正常；1分：無潰瘍，局部可見充血；2分：可見潰瘍，但無充血；3分：僅1處潰瘍和炎癥；4分：2處或更多處的潰瘍和炎癥；5分：潰瘍長于2 cm；6～10分：大于2 cm的潰瘍，每增加1 cm 加1分，有輕度粘連時(shí)（結(jié)腸較易與周圍組織剝離）加1分，粘連較嚴(yán)重時(shí)加2分，

1.4.3小鼠結(jié)腸病理組織學(xué)指數(shù)（TDI）觀察及評(píng)分在解剖顯微鏡下取病變較嚴(yán)重處，用4%多聚甲醛固定后行石蠟包埋，切片和HE染色，根據(jù)Dieleman等[9]標(biāo)準(zhǔn)如下：炎癥細(xì)胞浸潤：無為0分，輕度為1分，中度為2分，重度為3分；浸潤深度無為0分，黏膜層為1分，黏膜下層及肌層為2分，結(jié)腸全層為3分；潰瘍深度：無為0分，上皮層為1分，黏膜層為2分，黏膜肌層為3分。DAI評(píng)分=炎癥細(xì)胞浸潤程度+浸潤深度+潰瘍深度評(píng)分。

1.4.4ELISA法測(cè)定小鼠結(jié)腸組織TH17/Treg相關(guān)細(xì)胞因子IL-17和TGF-β、IL-10的水平變化將結(jié)腸組織放在冰的PBS上沖洗，濾紙拭干后稱取約10 mg結(jié)腸組織，加入1 mL PBS（pH：6.0，內(nèi)含1μg抑肽酶和亮肽素胃酶抑素A），用眼科剪剪碎后放入勻漿器進(jìn)行勻漿，4℃，12 000 r/min離心20min，取上清液，按ELISA試劑盒說明書檢測(cè)IL-17和TGF-β、IL-10的濃度。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1imDC的鑒定

2.1.1形態(tài)學(xué)觀察培養(yǎng)4 h可見大量的圓形貼壁細(xì)胞，均勻分布，見圖1；2 d后有大量的集落形成，開始有微小發(fā)絲樣突起產(chǎn)生，見圖2；5 d后細(xì)胞逐漸從集落脫離，呈典型的樹突狀形態(tài)，見圖3；第7天imDC呈毛刺樣突起，見圖4。

圖1　倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)4 h的樹突狀細(xì)胞形態(tài)（2 0 0×）

圖2　倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)2 d的樹突狀細(xì)胞形態(tài)（2 0 0×）

圖3　倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)5 d的樹突狀細(xì)胞形態(tài)（4 0 0×）

圖4　倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)第7天樹突狀細(xì)胞的形態(tài)（4 0 0×）

2.1.2細(xì)胞表面標(biāo)志物的流式細(xì)胞儀檢查測(cè)得細(xì)胞表面表達(dá)DC的特異性表面標(biāo)志物CD11c的表達(dá)率為85%，未經(jīng)Tac處理過的DC表達(dá)共同刺激因子CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表達(dá)率分別為31.6%、25.4%和51.0%，而經(jīng)過Tac處理過的DC表達(dá)共同刺激因子CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表達(dá)率分別為15.5%、10.3%和31、7%，符合imDC的表型，與Gao等[10]結(jié)果一致。見圖5。

2.2實(shí)驗(yàn)小鼠指標(biāo)的評(píng)價(jià)

根據(jù)上述“1.4”項(xiàng)下所描述的方法和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)每組小鼠進(jìn)行評(píng)分并記錄，相比于對(duì)照組，模型組的DAI、CMDI、TDI評(píng)分明顯升高，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。相比于模型組，imDC組和Tac-imDC組的DAI、CMDI、TDI評(píng)分明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。相比于imDC組，Tac-imDC組上訴評(píng)分降低更加明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）。見表1。

2.3小鼠結(jié)腸組織相關(guān)因子的檢測(cè)

相比于對(duì)照組，模型組的小鼠結(jié)腸組織細(xì)胞因子IL-17水平明顯升高，而細(xì)胞因子TGF-β和IL-10水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。相比于模型組，imDC組和Tac-imDC組的IL-17水平明顯降低，而TGF-β和IL-10水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。相比于imDC組，Tac-imDC組的IL-17、TGF-β、IL-10水平降低的更為顯著，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。見表2。

imDC：未成熟樹突狀細(xì)胞；Tac-imDC：經(jīng)過他克莫司處理過的imDC圖5　未經(jīng)T a c處理后和經(jīng)過T a c處理后的i m DC的表型

3　討論

DC作為機(jī)體內(nèi)最重要的專職抗原提呈細(xì)胞，決定著機(jī)體是產(chǎn)生免疫耐受還是免疫反應(yīng)，其表面的共同刺激分子CD80和CD86能夠與T細(xì)胞表面的共同刺激分子細(xì)胞毒性T細(xì)胞相關(guān)蛋白-4（CTL-4）特異性結(jié)合來激活下游信號(hào)，從而使幼稚T細(xì)胞向效應(yīng)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致免疫的激活[11]。DC表面的另外的表面分子MHC-Ⅱ起著識(shí)別抗原的作用，與抗原結(jié)合后將抗原信息提供給T細(xì)胞，誘導(dǎo)免疫反應(yīng)[12]，目前達(dá)成共識(shí)的是未成熟的DC缺乏共同刺激分子CD80、CD86和MHC-Ⅱ，從而誘導(dǎo)T細(xì)胞的失能，導(dǎo)致免疫耐受，而成熟的DC高表達(dá)上述分子，提供T細(xì)胞活化的信號(hào)，從而導(dǎo)致免疫的激活[13]。

表1　各實(shí)驗(yàn)組考察指標(biāo)項(xiàng)評(píng)分（分，±s）

表1　各實(shí)驗(yàn)組考察指標(biāo)項(xiàng)評(píng)分（分，±s）

注：對(duì)照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05；##P＜0.01；與imDC組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；DAI：疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分；CMDI：結(jié)腸大體形態(tài)損傷指數(shù)評(píng)分；TDI：結(jié)腸病理組織學(xué)評(píng)分；imDC：未成熟樹突狀細(xì)胞；Tac-imDC：經(jīng)過他克莫司處理過的imDC

組別　　例數(shù)　DAI　CMDI　TDI對(duì)照組模型組imDC組Tac-imDC組12 12 12 12 0.75±0.10 5.12±1.05*4.01±0.92#3.12±0.81##▲0.70±0.12 6.52±1.18*5.04±1.05##3.54±0.98##▲▲0.34±0.03 5.53±1.12*4.00±0.88##3.22±0.92##▲

表2　各組小鼠結(jié)腸組織I L-1 7和I L-1 0、TGF-β細(xì)胞因子含量（pg/mL，±s）

表2　各組小鼠結(jié)腸組織I L-1 7和I L-1 0、TGF-β細(xì)胞因子含量（pg/mL，±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與imDC組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；IL-17：白介素-17；TGF-β：轉(zhuǎn)化生子因子β；IL-10：白介素-10；imDC：未成熟樹突狀細(xì)胞；Tac-imDC：經(jīng)過他克莫司處理過的imDC

組別　　例數(shù)　IL-17　TGF-β　IL-10對(duì)照組模型組imDC組Tac-imDC組12 12 12 12 19.232±2.187 25.754±3.621*22.741±3.051#20.319±2.654##▲20.421±2.091 14.356±1.756*16.012±2.012#19.002±2.756##▲▲6.162±0.512 4.012±0.469*4.956±0.534##5.618±0.595##▲▲

幼稚T細(xì)胞在激活后分化為不同的效應(yīng)T細(xì)胞，分為Th1、Th2、Th17、Treg細(xì)胞[14]，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，克羅恩病的主要致病機(jī)制為Th1細(xì)胞的過度活化和數(shù)量增多，分泌炎癥因子γ干擾素，導(dǎo)致免疫紊亂。但后來一系列實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Th17和Treg細(xì)胞軸的偏倚也是導(dǎo)致克羅恩病的重要發(fā)病機(jī)制[15-17]。Th17以分泌IL-17而命名，IL-17具有強(qiáng)大的募集和激活中性粒細(xì)胞的能力，能誘導(dǎo)激活T細(xì)胞和刺激成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞產(chǎn)生多種促炎物質(zhì)，引起局部炎癥細(xì)胞的浸潤，組織的破壞[18]，而Treg分泌的細(xì)胞因子IL-10 和TGF-β，IL-10不僅僅能抑制T細(xì)胞的增值，而且還能抑制其他免疫細(xì)胞，如自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的活化，而TGF-β對(duì)于T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和其他免疫性細(xì)胞也起著抑制其增值、分化的作用[19]。在以往的實(shí)驗(yàn)中，通過尾靜脈輸注未成熟的DC，雖然在一定程度上減輕了炎性反應(yīng)，但還是無法完全消除炎性反應(yīng)，原因可能是在體外未成熟的DC在輸入小鼠體內(nèi)后，在復(fù)雜的微環(huán)境中特別是在炎癥緩解下會(huì)轉(zhuǎn)化為成熟的DC，甚至有可能加重炎性反應(yīng)[20]。

筆者發(fā)現(xiàn)，通過Tac處理過的imDC，其表面共同刺激分子CD80、CD86和MHC-Ⅱ表達(dá)的量較未經(jīng)Tac處理過的imDC更低，將經(jīng)Tac處理過的imDC輸入小鼠體內(nèi)后發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于未成熟組，其克羅恩病的疾病指數(shù)較未經(jīng)Tac處理組明顯降低，說明在未成熟的DC經(jīng)Tac處理后在小鼠體內(nèi)更能保持未成熟的狀態(tài)。為了進(jìn)一步探討其imDC誘導(dǎo)耐受機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用ELISA法檢測(cè)了結(jié)腸組織Th17/Treg相關(guān)細(xì)胞因子，發(fā)現(xiàn)Tac處理組其Th17相關(guān)因子IL-17明顯低于未經(jīng)Tac處理組和模型組，而經(jīng)Tac處理組其Treg相關(guān)因子IL-10和TGF-β明顯高于未經(jīng)Tac處理組和模型組，說明經(jīng)Tac處理的imDC能使體內(nèi)Th17相關(guān)因子IL-17處于較低水平，使Treg相關(guān)因子IL-10 和TGF-β處于較高水平，可能imDC介導(dǎo)了體內(nèi)Th17/ Treg免疫偏倚，并且經(jīng)過Tac處理過的imDC加強(qiáng)了這種偏倚，從而使免疫反應(yīng)更加減輕了。

本實(shí)驗(yàn)成功制作出克羅恩病模型，并通過實(shí)驗(yàn)證明經(jīng)過Tac處理的imDC更能加強(qiáng)其抑制炎癥的作用。其機(jī)制可能介導(dǎo)了TH17/Treg軸的偏倚，從而揭示了經(jīng)Tac處理的imDC抑制克羅恩病小鼠模型炎癥進(jìn)展的分子基礎(chǔ)，這為如何保持imDC穩(wěn)定狀態(tài)從而更加安全地減輕克羅恩病炎癥進(jìn)程提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，也為其在臨床中的應(yīng)用提供了新的方法。

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Research of the function and mechanism of Tacrolimus-treated dendritic cells on mouse inflammatory bowel disease

WEIDanyun ZHANG Hong PEN Rui ZHANG Ying
Department of Pharmacy,Renmin Hospital ofWuhan University,Hubei Province,Wuhan 430060,China

[Abstract]Objective To investigate the effect of Tacrolimus-treated immture dendritic cells(imDC)on the Crohn's micemodels induced by 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid(TNBS)and the actionmachnasim.M ethods Dendritic cells were obtained from the murine bone marrow and treated with Tac to maintain its immature,and Crohn's mice models were induced by TNBS.48 mice were randomly divided into four groups:control group,model group,imDC group and Tac-imDC group,evey group contains 12 mice.The other three groups were iuduced to Crohn'smodels by instillation of the 50%ethanol/TNBS enema.And the control group was instilled 50%ethanol enema.24 hours before and after instill enema,PBS or cells was injected via tail vein.Control group and model group were injected PBS;the imDC group were injected DC that did not treated by Tac;the Tac-imDC group were injected imDC that treated by Tac.Then the general situation ofmice were observed.After one week,the disease activity indexbook=26,ebook=29(DAI),colon macroscopic damage index(CMDI)and tissue damage index(TDI)were evaluated;the colon levels of interleukin-17(IL-17),interleukin-10(IL-10),transforming growth factor-β(TGF-β)were determined by enzymelinked immunosorbent assay(ELISA).Results Compared with the control group,scores of DAI,CMD an TDI inmodel group were significantly increased[DAI:(0.75±0.10)vs(5.12±1.05)scores,CMDI:(0.70±0.12)vs(6.52±1.18)scores; TDI:(0.34±0.03)vs(5.53±1.12)scores;all P＜0.01].And the colon tissue levels of IL-10,TGF-βwere significantly decresed[TGF-β:(20.421±2.091)vs(14.356±1.756)pg/mL;IL-10:(6.162±0.512)vs(4.012±0.469)pg/mL;all P＜0.01].But the level of IL-17 was significantly increased[(19.232±2.187)vs(25.754±3.621)pg/mL,P＜0.01].Compared with model group,the scores of DAI,CMDI,TDI in imDC and Tac-imDC group were significantly decreased [DAI:(5.12±1.05)vs(4.01±0.92),(3.12±0.81)scores;CMDI:(6.52±1.18)vs(5.04±1.05),(3.54±0.98)scores;TDI: (5.53±1.12)vs(4.00±0.88),(3.22±0.92)scores,P＜0.05 or P＜0.01].The colon levels of IL-10,TGF-βin imDC group and Tac-imDC group were incresed significantly[TGF-β:(14.356±1.756)vs(16.012±2.012),(19.002±2.756)pg/mL, IL-10:(4.012±0.469)vs(4.956±0.534),(5.618±0.595)pg/mL,P＜0.05 or P＜0.01],and the level of IL-17 was decresed significantly[(25.754±3.621)vs(22.741±3.051),(20.319±2.654)pg/mL,P＜0.05 or P＜0.01].Butwhen compared with imDC group,the changes were more significantly[DAI:(4.01±0.92)vs(3.12±0.81)scores;CMDI:(5.04±1.05)vs (3.54±0.98)scores;TDI:(4.00±0.88)vs(3.22±0.92)scores;TGF-β:(22.741±3.051)vs(20.319±2.654)pg/mL;IL-17: (16.012±2.012)vs(19.002±2.756)pg/mL;IL-10:(4.956±0.534)vs(5.618±0.595)pg/mL;P＜0.05 or P＜0.01].Conclusion ImDC can significantly attenuates intestinal inflammation in Crohn'smicemodels and the effection can be enhanced by Tac.Themechanism may be involved in the shiftof Th17/Treg axis.

[Key words]Tacrolimus;Dendritic cells;Inflammatory bowel disease;Crohn'smicemodels

收稿日期：（2015-08-12本文編輯：任念）

[通訊作者]張洪（1962.5-），男，教授，碩士生導(dǎo)師；研究方向：消化系統(tǒng)疾病治療藥物的藥劑學(xué)與藥理學(xué)研究。

[作者簡(jiǎn)介]魏丹蕓（1990.4-），女，碩士；研究方向：個(gè)體化給藥。

[中圖分類號(hào)]R574

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1673-7210（2016）01（a）-0025-06