通絡(luò)救腦注射液及其組分對(duì)擬缺血損傷腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞GluR3表達(dá)及其功能的影響

馬家寶，李興廣，李衛(wèi)紅，徐 雅，張 賽，姜昭妍，胡艷紅，蘇 靖，張 凡，王 磊

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

通絡(luò)救腦注射液及其組分對(duì)擬缺血損傷腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞GluR3表達(dá)及其功能的影響

馬家寶，李興廣△，李衛(wèi)紅△，徐 雅，張 賽，姜昭妍，胡艷紅，蘇 靖，張 凡，王 磊

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

目的:觀察通絡(luò)救腦注射液及其有效組分對(duì)擬缺血損傷腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞谷氨酸受體3(glutamate receptor 3，GluR3)表達(dá)及其功能的影響。方法:采用大鼠原代培養(yǎng)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，氧糖剝奪法制備擬缺血模型，分別用通絡(luò)救腦注射液及其2組分梔子苷、三七總皂苷對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，采用PCR和免疫蛋白印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞中GluR3 mRNA及蛋白表達(dá)水平，并用免疫蛋白印跡法檢測(cè)GluR3調(diào)節(jié)的下游分子基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子CD147、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:通絡(luò)救腦注射液及其組分能夠從基因到蛋白水平顯著下調(diào)GluR3的表達(dá)，對(duì)CD147、MMP-9也有顯著下調(diào)作用，且通絡(luò)救腦注射液療效優(yōu)于2組分。結(jié)論:通絡(luò)救腦注射液及其組分可調(diào)節(jié)擬缺血損傷腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞GluR3的表達(dá)及其功能，這可能是其在腦缺血性損傷中保護(hù)血腦屏障、減輕炎癥反應(yīng)的機(jī)制之一。通絡(luò)救腦注射液效果優(yōu)于2組分，顯示了復(fù)方配伍發(fā)揮整合調(diào)節(jié)的療效優(yōu)勢(shì)。

通絡(luò)救腦注射液;腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞;GluR3;CD147;MMP-9

通絡(luò)救腦注射液是基于“毒損腦絡(luò)”病機(jī)理論研發(fā)的一種用于缺血性中風(fēng)急性期的中藥復(fù)方新藥。前期藥理研究顯示，該藥可通過多種途徑抑制腦缺血的發(fā)生與發(fā)展，對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用［1-2］。利用基因芯片技術(shù)對(duì)該藥的靶基因進(jìn)行篩選，我們發(fā)現(xiàn)通絡(luò)救腦注射液對(duì)擬缺血損傷腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞谷氨酸受體3(glutamate receptor 3，GluR3)的mRNA具有顯著下調(diào)作用。因此，本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，以該注射液的2個(gè)有效組分梔子苷和三七總皂苷作為對(duì)照，觀察了通絡(luò)救腦注射液對(duì)擬缺血腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞 GluR3 mRNA和蛋白表達(dá)的影響，以及對(duì)GluR3調(diào)節(jié)的下游相關(guān)蛋白 CD147、基質(zhì)金屬蛋白酶 9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，以深入揭示通絡(luò)救腦注射液發(fā)揮血管保護(hù)作用的分子靶點(diǎn)，同時(shí)闡釋該復(fù)方新藥的配伍優(yōu)勢(shì)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 細(xì)胞的原代培養(yǎng)與傳代

采用本室已建立的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)方法［3］，選取SD大鼠進(jìn)行細(xì)胞取材、分離純化和培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)用第3代細(xì)胞。

1.2 制備擬缺血損傷模型

本室已建立糖氧剝奪模型［4］，將第3代細(xì)胞置于無糖的Kreb’s液中，在三氣培養(yǎng)箱中模擬低氧環(huán)境(氣體設(shè)為94%N2，5%CO2，1%O2)培養(yǎng)6 h。

1.3 分組與處理

通絡(luò)救腦注射液由中藥梔子、三七組分配伍而成，故本研究中以2種組分梔子苷和三七總皂苷作為對(duì)照。將細(xì)胞分成正常組、模型組、梔子苷組、三七總皂苷組、通絡(luò)救腦注射液組5組。除正常組外，各組均按上述方法造模，在造模前3 h及造模過程中給藥，梔子苷組的終濃度為33.2 μg/ml(與通絡(luò)救腦注射液組中梔子苷的終濃度相同);三七總皂苷組終濃度為22 μg/ml(與通絡(luò)救腦注射液組中三七總皂苷的終濃度相同);通絡(luò)救腦注射液按4 μL/ ml給藥，處理結(jié)束后進(jìn)行以下指標(biāo)檢測(cè)。

1.4 PCR法檢測(cè)GluR3 mRNA表達(dá)水平

各組細(xì)胞加Trizol后提總RNA，測(cè)定RNA濃度。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，在7500型PCR儀上檢測(cè)GluR3基因的mRNA表達(dá)水平，表達(dá)變化倍數(shù)采用2-ΔΔCt算法。計(jì)算公式:ΔCt =Ct目的基因–Ct內(nèi)參;ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組–ΔCt對(duì)照組。PCR引物如下:GluR3:F:AACGATACTTG ATTGACTGTGAA，R:ATGTAGTGATAGCCTCTTG AATG;內(nèi)參 β-actin:F:TATCGGCAATGAGCGG TTCC，R:AGCACTGTGTTGGCATAGAGG。

1.5 Western blotting法檢測(cè)各組 GluR3、CD147、MMP-9的表達(dá)

各組細(xì)胞處理完畢后，加入裂解液收集細(xì)胞，并用細(xì)胞破碎機(jī)進(jìn)行破碎，4℃離心后取上清，BCA法進(jìn)行蛋白定量。配制聚丙烯酞胺凝膠后將蛋白樣品上樣，凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜(PVDF)，用5%脫脂奶粉封閉1 h，洗膜后加入相應(yīng)的一抗4℃過夜。次日洗膜后加入相應(yīng)二抗孵育，ECL顯色、照相，并進(jìn)行灰度值定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 通絡(luò)救腦注射液及其組分對(duì)擬缺血腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞GluR3 mRNA的影響

圖1顯示，與正常組比較，模型組GluR3 mRNA水平明顯增高(P＜0.05)，提示氧糖剝奪可誘導(dǎo)GluR3 mRNA的高表達(dá);與模型組比較，各給藥組GluR3 mRNA表達(dá)均顯著降低(P＜0.05，P＜0.01)，3給藥組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 通絡(luò)救腦注射液及其組分對(duì)擬缺血腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞GluR3蛋白表達(dá)的影響

圖1 各組腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞GluR3 mRNA的表達(dá)

圖2顯示，Western blotting檢測(cè)GluR3蛋白表達(dá)情況。與正常組比較，造模后GluR3的表達(dá)量顯著增多(P＜0.01)，與模型組比較，各給藥組GluR3蛋白表達(dá)顯著下降(P＜0.01)，提示通絡(luò)救腦注射液和2組分均可下調(diào)GluR3蛋白表達(dá);與梔子苷組、三七總皂苷組比較，通絡(luò)救腦注射液組GluR3表達(dá)下降更為明顯(P＜0.01，P＜0.05)，提示注射液的療效優(yōu)于2組分單獨(dú)作用。

圖2 各組腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞GluR3的蛋白表達(dá)

2.3 通絡(luò)救腦注射液及其組分對(duì)擬缺血腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞CD147蛋白表達(dá)的影響

圖3顯示，與正常組比較，模型組CD147表達(dá)量顯著增多(P＜0.01);與模型組比較，各給藥組CD147蛋白表達(dá)均明顯下降(P＜0.05，P＜0.01)，提示通絡(luò)救腦注射液及其組分均可抑制CD147的表達(dá)，其中通絡(luò)救腦注射液的下調(diào)作用優(yōu)于三七總皂苷(P＜0.05)。

2.4 通絡(luò)救腦注射液及其組分對(duì)擬缺血腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞MMP-9蛋白表達(dá)的影響

圖4所示，與正常組比較，模型組細(xì)胞MMP-9的表達(dá)量增多(P＜0.05);與模型組比較，各給藥組MMP-9表達(dá)均顯著降低(P＜0.01)，提示通絡(luò)救腦注射液及其組分均可抑制MMP-9的表達(dá)，通絡(luò)救腦注射液對(duì)MMP-9的下調(diào)作用優(yōu)于梔子苷(P＜0.05)。

圖3 各組腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞CD147的蛋白表達(dá)

圖4 各組腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞MMP-9的蛋白表達(dá)

3 討論

腦缺血時(shí)谷氨酸大量釋放，其受體被激活，可從多種途徑造成腦損傷。離子型谷氨酸受體AMPA (amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid)是由4個(gè)亞單位GluR1～GluR4構(gòu)成的同聚體或異聚體［5］。GluR3是AMPA的一個(gè)重要亞型，傳統(tǒng)認(rèn)為它主要存在于神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞中，激活后會(huì)導(dǎo)致大量的Na+內(nèi)流，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要介導(dǎo)快速興奮性突觸傳遞。相關(guān)研究表明，其基因功能異?？梢鹕窠?jīng)元損害，表現(xiàn)為智力缺陷及癲癇，參與神經(jīng)性頭痛［6］。近年來，谷氨酸及其受體在其他組織或細(xì)胞的表達(dá)及功能得到越來越多的關(guān)注，如在人類T細(xì)胞中GluR3活化后會(huì)誘導(dǎo)T細(xì)胞的黏附和趨化性遷移［7］，提示其參與更廣泛的生理病理過程。但該受體在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)鮮有報(bào)道。前期用基因芯片技術(shù)進(jìn)行差異基因篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)，缺血損傷后腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞GluR3 mRNA表達(dá)明顯升高。故本實(shí)驗(yàn)采用PCR和Western blotting技術(shù)檢測(cè)GluR3在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，GluR3可表達(dá)于腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，擬缺血損傷后表達(dá)明顯上調(diào)，提示該受體可能參與缺血后的血管損傷。

Ganor等在對(duì)GluR3功能研究中發(fā)現(xiàn)，該受體在癌癥T細(xì)胞中會(huì)激發(fā)CD147的表達(dá)［8］。CD147是一種基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子，可通過自分泌或旁分泌的方式誘導(dǎo)MMP-9的產(chǎn)生。MMP-9是一種降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)分子的中性蛋白酶，可降解細(xì)胞外基質(zhì)。在腦缺血過程中，既參與血腦屏障的損傷［9］，又作為炎癥相關(guān)因子促進(jìn)炎癥的發(fā)展［10］。從結(jié)果可以看出，缺血性損傷后腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞GluR3、CD147和MMP-9表達(dá)均顯著上調(diào)，提示缺血誘導(dǎo)了該信號(hào)通路的活化，導(dǎo)致終產(chǎn)物MMP-9的高表達(dá)。這可能是缺血后血腦屏障的破壞和炎癥反應(yīng)加重的內(nèi)在機(jī)制之一。

通絡(luò)救腦注射液是由梔子和三七配伍組成，具有解毒通絡(luò)的功能，在缺血性中風(fēng)治療中發(fā)揮了良好的治療作用，但其藥理機(jī)制并不明確。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通絡(luò)救腦注射液及其2組分梔子苷、三七總皂苷對(duì)擬缺血腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞GluR3具有明顯的下調(diào)作用，且通絡(luò)救腦注射液的作用更為明顯。同時(shí)通絡(luò)救腦注射液及其2組分對(duì)GluR3的下游分子CD147、MMP-9也有顯著下調(diào)作用，提示對(duì)該信號(hào)通路的調(diào)節(jié)可能是注射液保護(hù)內(nèi)皮功能、維持血腦屏障穩(wěn)定、減輕炎癥反應(yīng)的內(nèi)在機(jī)制，也可能是該復(fù)方發(fā)揮“解毒通絡(luò)”作用的現(xiàn)代生物學(xué)基礎(chǔ)。同時(shí)通絡(luò)救腦注射液的治療作用在不同程度上優(yōu)于其單一組分，體現(xiàn)了中藥復(fù)方配伍發(fā)揮整合調(diào)節(jié)的療效優(yōu)勢(shì)。

［1］李衛(wèi)紅，王東坡，李興廣，等．通絡(luò)救腦注射液及其有效成分對(duì)擬缺血損傷人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用［J］．安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，30(6):42-46．

［2］郭曉謹(jǐn)，李興廣，李衛(wèi)紅，等．三七、梔子組分配伍對(duì)擬缺血損傷腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響［J］．中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2014，20(2):215-216．

［3］李衛(wèi)紅，李澎濤，華茜，等．不同內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液對(duì)皮層神經(jīng)元線粒體功能的影響及通絡(luò)救腦注射液的保護(hù)作用［J］．中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007，27(2):131-134．

［4］朱元，李澎濤，李衛(wèi)紅，等．不同狀態(tài)的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞血腦屏障特征性酶的影響［J］．世界科學(xué)技術(shù):中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2012，14(2):1393-1397．

［5］Tanaka H，Grooms SY，Bennett MV，et al．The AMPAR subunit GluR2:still front and center-stage［J］．Brain Res，2000，886 (1-2):190-207．

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［8］Ganor Y，Grinberg I，Reis A，et al．Human T-leukemia and T-lymphoma express glutamate receptor AMPA G1uR3，and the neurotransmitter glutamate elevates the cancer-related matrixmetalloproteinases inducer CD147/EMMPRIN，MMP-9 secretion and engraftment of T-leukemia in vivo［J］．Leuk Lymphoma，2009，50(6):985-997．

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The Effects of Tong Luo Jiu Nao Injection and its Components on the Expression and Function of GluR3 in Mimic Ischemic Brain Microvascular Endothelial Cells

MA jia-bao，LI wei-hong△，LI xing-guang△，XU ya，ZHANG sai，KANG soyeon，HU yan-hong，SU jing，ZHANG fan，WANG lei
(Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China)

Objective:To study the effects of Tong Luo Jiu Nao injection(TLJN)and its active components on the expression and function of Glutamate receptor 3(GluR3)in mimic ischemic brain microvascular endothelial cells (BMECs)．Methods:Primary rat BMECs were used and mimic cerebral ischemia in vitro was established by oxygenglucose-deprived(OGD)method．OGD-induced BMECs were treated with Geniposide，Panax notoginseng saponins(PNS) and TLJN respectively．The expression of GluR3 in mRNA and protein level was detected using RT-PCR and Western blot methods．The expression of CD147 and matrix metalloproteinase-9(MMP-9)in various groups were detected by Western blot．Results:The expression of GluR3 in OGD-induced BMECs was down-regulated by TLJN and its components geniposide，PNS．The expression of CD147 and MMP-9 were also decreased in administration groups．Effect of TLJN was superior to geniposide or PNS．Conclusion:TLJN and its components could regulate the expression and function of GluR3 in mimic ischemic BMECs，which may be the internal mechanism of TLJN’s effect on Blood Brain Barrier damage and inflammation in cerebral ischemia．Meanwhile，TLJN had more optimized effect than its active components，which showed the therapeutic advantages of Chinese medicine compatibility．

Tong Luo Jiu Nao injection;brain microvascular endothelial cells;GluR3;CD147;MMP-9

R285．5

B

1006-3250(2016)02-0200-03

2015-07-15

馬家寶(1988-)，女，在讀碩士，從事中藥復(fù)方的配伍機(jī)制研究。

△通訊作者:李興廣，男，教授，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，Tel:13621008162，E-mail:lixingguang@hotmail．com;李衛(wèi)紅，女，副教授，主治醫(yī)生，碩士研究生導(dǎo)師，Tel:15001221959，E-mail:liweihong．403@163．com。