補(bǔ)腎活血法對(duì)腎虛血瘀型大鼠雌、孕激素及其受體的影響*

馮玉霞，王田平，曾 倩△，王 毅，黃金珠，鄧琳雯，韓雪梅

(成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，成都 610072)

補(bǔ)腎活血法對(duì)腎虛血瘀型大鼠雌、孕激素及其受體的影響*

馮玉霞1，王田平1，曾 倩1△，王 毅2，黃金珠2，鄧琳雯3，韓雪梅3

(成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，成都 610072)

目的:探討補(bǔ)腎活血法對(duì)腎虛血瘀型大鼠雌孕激素及其受體的影響。方法:選動(dòng)情前期大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、補(bǔ)腎活血方藥低劑量組、高劑量組和五子組造腎虛血瘀模型，妊娠第4天處死大鼠，留取血清及子宮標(biāo)本，放射免疫法測(cè)定血清雌二醇(E2)、孕酮(P)，免疫組化結(jié)合圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)子宮雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)含量。結(jié)果:模型組E2、P、ER、PR明顯低于空白組;各治療組E2和P、高劑量組ER和PR、低劑量組和五子組的PR比模型組明顯升高。多元相關(guān)性分析，ER、PR與E2呈正相關(guān)，間質(zhì)PR與P呈正相關(guān)。結(jié)論:補(bǔ)腎活血法可升高腎虛血瘀型大鼠E2、P水平，調(diào)控ER、PR表達(dá)，利于子宮內(nèi)膜成熟及胚泡著床。

補(bǔ)腎活血法;雌激素;孕激素;雌激素受體;孕激素受體;子宮內(nèi)膜容受性

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)健康SD未交配雌性大鼠70只，體質(zhì)量190～240 g，同品系有生育能力雄性大鼠16只，體質(zhì)量250～280g，購(gòu)自成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證號(hào)scxk(川)2008-11)。雌雄分籠飼養(yǎng)，給予12 h光照、12 h避光，室內(nèi)溫度(22±1)℃，相對(duì)濕度約為40%，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用水。

1.2 藥物

補(bǔ)腎活血方藥(即助孕I號(hào)方)制備:菟絲子、枸杞子、覆盆子、丹參等(由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室提供，批號(hào)20130327)按一定比例制成含生藥3.14 g/ml的無(wú)菌煎劑，置4℃冰箱冷藏備用;羥基脲片:北京嘉林藥業(yè)股份有限公司(批號(hào)130203);高分子右旋糖苷:上海金穗生物科技有限公司(批號(hào)JS11715);五子衍宗丸:太極集團(tuán)四川綿陽(yáng)制藥有限公司(批號(hào)1306011)。

1.3 試劑及器材

E2(批號(hào)RG61312)、P(批號(hào)RG51312)放免試劑盒購(gòu)自天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司;一抗ER (克隆號(hào) 6136518，兔抗鼠多克隆抗體)購(gòu)自BeacomBio公司;PR(克隆號(hào)Y-B4-07C17B，兔抗鼠多克隆抗體)購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，二抗及相應(yīng)試劑盒購(gòu)自北京中杉生物有限公司; BX43正置顯微鏡購(gòu)自 OLYMPUS公司(型號(hào)BSA224S-CW)。

1.4 分組及建立模型

參照《動(dòng)物試驗(yàn)方法學(xué)》［7］，選擇陰道涂片顯示為動(dòng)情前期大鼠50只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、補(bǔ)腎活血方藥低劑量組、高劑量組和五子組。建立腎虛血瘀型大鼠模型［8-10］:空白組給予蒸餾水5 ml/kg灌胃，其余各組給予羥基脲450 mg/ (kg·d)連續(xù)灌胃8 d，空白組、模型組給予蒸餾水5ml/kg灌腸，低劑量組、高劑量組分別給予補(bǔ)腎活血方7.3 g/kg、14.6 g/kg灌腸，五子組給予五子衍宗丸溶液1.68 g/kg灌胃。第9天以后早晨9∶00陰道涂片，若發(fā)現(xiàn)膨大的上皮細(xì)胞核消失，成為鱗狀脫落的角化上皮細(xì)胞，并聚集像許多落葉堆積占細(xì)胞的絕大多數(shù)，白細(xì)胞和有核上皮細(xì)胞很少，認(rèn)為動(dòng)情期則選各組動(dòng)情期雌鼠按雌雄2∶1合籠，次日早晨9∶00陰栓或陰道涂片發(fā)現(xiàn)精子認(rèn)為合籠成功，記為妊娠第1天，繼續(xù)給藥至妊娠第4天，末次給藥后1 h尾靜脈快速推注高分子右旋糖苷5 ml/kg。

施肥器主要采用不銹鋼材料制成，料倉(cāng)等部件采用ABS工程塑料，保證產(chǎn)品強(qiáng)度的同時(shí)也使得產(chǎn)品質(zhì)量較輕易于攜帶。施肥器整體結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，結(jié)實(shí)耐用，易于維修維護(hù)，大大降低了產(chǎn)品成本。下料量、踏板高度均可進(jìn)行調(diào)節(jié)，可以滿足不同作業(yè)需求。把手加設(shè)軟性膠墊，使手部操作更加舒適。其工作效率明顯高于無(wú)專項(xiàng)農(nóng)具輔助的手工作業(yè)，作業(yè)成本又大幅度低于大型機(jī)器，而且適應(yīng)各種復(fù)雜環(huán)境，造型簡(jiǎn)潔大方，價(jià)格低廉，多數(shù)農(nóng)戶都可以接受，此設(shè)計(jì)方案應(yīng)有較好的市場(chǎng)前景。

1.5 檢測(cè)血清E2、P水平

末次給高分子右旋糖苷30 min后股動(dòng)脈取血，取上清液用放射免疫分析法測(cè)定血清E2、P水平。

1.6 檢測(cè)子宮內(nèi)膜ER、PR含量

取血后脫頸處死大鼠，剖腹取出子宮放入FAA液固定，逐級(jí)酒精脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、切片，切片厚度4 um，子宮切片做免疫組化染色，操作按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。ER、PR免疫組化結(jié)果判定，ER、PR陽(yáng)性物質(zhì)呈棕黃色、黃色、淺黃色顆粒狀或細(xì)絲狀，陽(yáng)性物質(zhì)表達(dá)于胞漿、胞核。光鏡下觀察切片，先在低倍(100×)下選取5個(gè)上皮、間質(zhì)陽(yáng)性物質(zhì)表達(dá)最明顯區(qū)域，然后在中倍(200×)視野下攝入上述5個(gè)區(qū)域圖像，采用Mias-2000圖形圖像分析系統(tǒng)(四川川大智勝軟件股份有限公司)分別測(cè)量上皮、間質(zhì)ER、PR積分光密度，求5個(gè)區(qū)域積分光密度總和，分別表示上皮、間質(zhì)ER、PR含量。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，若2項(xiàng)檢驗(yàn)均符合則采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，對(duì)不滿足任一檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)，采用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)中多個(gè)獨(dú)立可Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)處理，組間比較采用Mann Whitney U法檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠妊娠第4天血清E2、P比較

表1顯示，與空白組比較，模型組E2、P均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與模型組比較，補(bǔ)腎活血法高、低劑量組、五子組E2明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與模型組比較，高劑量組P明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，低劑量組、五子組P升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各組大鼠妊娠第4天血清E2、P比較(±s)

表1 各組大鼠妊娠第4天血清E2、P比較(±s)

注:與空白組比較:＊＊P＜0.01;與模型組比較:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組 別 鼠數(shù) 雌二醇(pg/ml) 孕酮(ng/ml)空 白 組10 26.73±3.01 78.28±19.27模 型 組 10 11.00±3.26＊＊ 39.88± 2.83＊＊低劑量組 10 19.48±6.05▲▲ 61.08±14.19▲高劑量組 10 21.80±2.73▲▲ 75.41±19.42▲▲五 子 組 10 18.96±5.56▲▲ 63.27±20.68▲

圖1 各組大鼠妊娠第4天ER免疫組化染色(×200)

2.2 各組大鼠妊娠第4天ER、PR比較

圖1、2顯示，在光鏡下觀察ER、PR在大鼠子宮內(nèi)膜組織上皮、間質(zhì)均有表達(dá)，空白組上皮、間質(zhì)ER表達(dá)呈棕黃色、黃色，分布密集，面積廣;模型組上皮、間質(zhì)ER、PR表達(dá)呈黃色、淺黃色，分布稀疏，面積較小;與模型組比較，低、高劑量組和五子組ER、PR表達(dá)均有不同程度的增加，呈棕黃色、黃色，分布密集，面積廣。

表2顯示，與空白組比較，模型組ER、PR表達(dá)均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與模型組比較，高劑量組ER和PR、低劑量組和五子組的PR表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);高劑量組ER表達(dá)高于低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖2 各組大鼠妊娠第4天PR免疫組化染色(×200)

表2 各組大鼠妊娠第4天ER、PR比較(±s)

表2 各組大鼠妊娠第4天ER、PR比較(±s)

注:與空白組比較:＊＊P＜0.01;與模型組比較:▲P＜0.05，與劑低量組比較:◆P＜0.05

組 別 鼠數(shù) ER 積分光密度總和 PR 積分光密度總和上皮 間質(zhì) 上皮 間質(zhì)空 白 組 10 34165.28±6948.37 78513.04± 7805.07 54463.89±36090.88 57665.89± 7494.60模 型 組 10 23876.39±3856.66＊＊ 59270.54± 6332.64＊＊ 36090.8±12321.30＊＊ 41709.40±12394.70＊＊低劑量組 10 28222.86±3078.15 62765.79±11812.11 48566.19± 6630.18▲ 52089.59± 5561.43▲高劑量組 10 30821.62±4123.59▲ 72398.86±10309.16▲◆ 49325.08± 8370.49▲ 53548.17± 7893.27▲五 子 組 10 26617.64±3272.87 59285.16± 8430.48 48151.89± 3749.00▲ 51814.19± 6693.76▲

2.3 多元相關(guān)性分析

表3顯示，上皮和間質(zhì)的ER、PR與E2水平呈正相關(guān)，間質(zhì)PR與P水平呈正相關(guān)，上皮與間質(zhì)ER、上皮PR與P無(wú)直線相關(guān)關(guān)系。

表3 各組大鼠妊娠第4天上皮和間質(zhì)ER、PR與E2、P多元相關(guān)性分析

3 討論

子宮內(nèi)膜容受性［11］是指子宮內(nèi)膜處于一種允許囊胚定位黏附侵入并使內(nèi)膜間質(zhì)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致胚胎著床的狀態(tài)。在著床期，子宮內(nèi)膜在雌、孕激素作用下發(fā)生一系列與胚泡發(fā)育同步，并有利于胚泡著床的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，對(duì)胚泡具有容受性，能使胚泡順利著床［12］。雌、孕激素通過(guò)各自的細(xì)胞內(nèi)受體作用于內(nèi)膜組織，使子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)增生發(fā)育，為胚胎著床提供物質(zhì)基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)［13］，COH明顯干擾了子宮內(nèi)膜腺上皮ER、PR的正常表達(dá)，使內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞ER、PR的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率下降，影響子宮內(nèi)膜胞飲泡的正常發(fā)育，致內(nèi)膜發(fā)育延遲，也影響子宮內(nèi)膜發(fā)育的成熟度。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組E2、P、ER、PR比空白組明顯降低，說(shuō)明腎虛血瘀會(huì)導(dǎo)致E2、P分泌降低，抑制ER、PR表達(dá)，影響子宮內(nèi)膜的形態(tài)、功能，降低子宮內(nèi)膜容受性，從而影響胚胎著床。補(bǔ)腎活血法低、高劑量組和五子組的E2、P比模型組高，高劑量組的ER和PR、低劑量組和五子組的PR表達(dá)比模型組升高，說(shuō)明補(bǔ)腎法和補(bǔ)腎活血法可升高E2、P水平，改善腎虛血瘀對(duì)ER、PR表達(dá)的抑制，增加ER、PR在子宮內(nèi)膜表達(dá)，改善子宮內(nèi)膜容受性。

研究［14］發(fā)現(xiàn)，血清E2與子宮內(nèi)膜ER、PR表達(dá)呈正相關(guān)，有刺激ER、PR合成的作用，血清P與ER、PR表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，抑制ER合成，并間接抑制PR合成的作用。而腺上皮的PR下調(diào)和間質(zhì)細(xì)胞P上調(diào)的失敗是導(dǎo)致子宮內(nèi)膜容受性下降的原因之一［15-16］。劉子霞［17］等研究發(fā)現(xiàn)，IVF-ET助孕患者妊娠組P可下調(diào)腺上皮PR和上調(diào)間質(zhì)PR表達(dá)，非妊娠組P下調(diào)腺上皮PR失敗的結(jié)果一致。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用藥組E2、P、ER、PR明顯高于模型組，且低于空白組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多元相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，E2與ER、PR呈正相關(guān)，P與間質(zhì)PR呈正相關(guān)。由此可以推測(cè)，補(bǔ)腎活血法可升高E2、P，E2、P上調(diào)上皮、間質(zhì)ER和間質(zhì)PR表達(dá)，使E2、P、ER、PR提高到正常范圍內(nèi)，促進(jìn)子宮內(nèi)膜蛻膜化，從而改善子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)、功能，提高子宮內(nèi)膜容受性，促進(jìn)著床。

中醫(yī)學(xué)無(wú)“子宮內(nèi)膜容受性”相關(guān)概念，根據(jù)“子宮內(nèi)膜容受障礙”證候?qū)儆凇安辉邪Y”“滑胎”“胎漏、胎動(dòng)不安”“月經(jīng)失調(diào)”等范疇，與“腎氣”“氣血”有密切聯(lián)系［18］。前期研究已證實(shí)，其主要為腎虛血瘀證。現(xiàn)代醫(yī)家認(rèn)為［19］，腎陰是卵泡的物質(zhì)基礎(chǔ)，腎陽(yáng)是促使其生長(zhǎng)發(fā)育以及黃體形成的動(dòng)力。若腎虛則胞宮胞脈失于濡養(yǎng)，血瘀則胞宮胞脈血行瘀滯不暢，胞宮受納失常，妨礙妊娠?，F(xiàn)代藥理研究，楊鑒冰［20］臨床研究證明，補(bǔ)腎中藥有促進(jìn)黃體功能的作用，且能直接或間接作用于卵巢，促使P合成和分泌，提高和延長(zhǎng)P分泌高峰期。有研究發(fā)現(xiàn)［21］，資沖顆粒直腸給藥和灌胃給藥均具有促進(jìn)幼齡大鼠卵泡發(fā)育的作用和增加雌激素樣效應(yīng)。張明敏［22］實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，將補(bǔ)腎法和活血法結(jié)合起來(lái)的補(bǔ)腎安胎方可提高E2、P及促進(jìn)PR、ER表達(dá)，能更大程度上改善著床障礙小鼠子宮內(nèi)膜容受性，促進(jìn)胚泡著床。補(bǔ)腎活血方通過(guò)補(bǔ)腎中陰陽(yáng)、活血通絡(luò)使胞宮胞脈得以滋養(yǎng)，胞脈胞絡(luò)血行暢達(dá)，兩精相搏，使胞宮受納才能妊娠。

補(bǔ)腎活血方藥由菟絲子、枸杞子、覆盆子、丹參等組成。研究證實(shí)，菟絲子含有糖類、黃酮類化合物等，有雌激素樣活性［23］;覆盆子能調(diào)控下丘腦-垂體-性腺功能［24］;枸杞子具有抗氧化、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)以及保護(hù)生殖系統(tǒng)的作用［25］;丹參能改善微循環(huán)，促進(jìn)血液流速，能改善血液流變性，降低血液黏度，抑制血小板聚集和凝血功能，激活纖溶，對(duì)抗血栓形成［26］。全方配伍可促進(jìn)E2、P分泌和ER、PR表達(dá)，改善微循環(huán)障礙，對(duì)腎虛血瘀型大鼠有療效。

綜上所述，補(bǔ)腎活血法可以改善腎虛血瘀型大鼠的子宮內(nèi)膜容受性，其作用機(jī)制可能是升高E2、P水平，調(diào)控ER、PR表達(dá)，利于子宮內(nèi)膜成熟和胚泡著床。

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Effect of Bushen Huoxue Method on Estrogen，Progesterone and Its Receptor in Rats with Kidney Deficiency and Blood Stasis

FENG Yu-xia1，WANG Tian-ping1，ZENG Qian1△，WANG Yi2，HUANG Jin-zhu2，DENG Lin-wen3，HAN Xue-mei3
(The Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610072，China)

Objective:To study the effects of tonifying the kidney and promoting blood circulation on estrogen and progesterone and their receptors in rats with kidney deficiency and blood stasis type．Method:the proestrus rats were randomly divided into blank group，model group，both low and high dose group of Bushen Huoxue recipe and the five sub group，made of kidney deficiency and blood stasis model，and killed on day 4 of pregnancy．Samples of their serum and uterine were collected for detecting serum estradiol(E2)，progesterone(P)using radioimmunoassay;and endometrial expression contents of their receptors，ER and PR using immunohistochemistry and image analysis system．Results:E2，P，ER and PR of the model group were significantly lower than blank group;E2and P of the treatment group，ER and PR of high dose group，PR of low dose group and five sub group increased than the model group．Multivariate correlation analysis，ER，PR and E2were positively correlated，interstitial PR and P were positively．Conclusion:tonifying kidney and promoting blood circulation can improve E2，P level of kidney deficiency and blood stasis rats，and regulate the expression of ER，PR to improve endometrial maturation so as to conducive to blastocyst implantation．

Tonifying the kidney and promoting blood circulation;Estrogen;Progesterone;Estrogen receptor; Progesterone receptor; Endometrial receptivity

R285．5

B

1006-3250(2016)02-0191-04

2015-06-24

四川省教育廳科研基金資助項(xiàng)目(13ZA0284)-基于細(xì)胞外機(jī)制分子網(wǎng)絡(luò)研究補(bǔ)腎活血法改善子宮內(nèi)膜容受性的作用機(jī)理;成都市科技局科研基金資助項(xiàng)目(H2013050)-助孕I號(hào)方經(jīng)直腸給藥對(duì)腎虛血瘀模型大鼠生殖功能的調(diào)控機(jī)制研究

馮玉霞(1987-)，女，甘肅人，醫(yī)學(xué)碩士，從事不孕癥的中醫(yī)藥防治與研究。

△通訊作者:曾 倩(1965-)，女，主任醫(yī)師，從事不孕癥、圍試管嬰兒期調(diào)治、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、月經(jīng)不調(diào)等疾病的中醫(yī)藥防治與研究，Tel:13488936756，E-mail:zqan999d@126．com。