一種病證結(jié)合痰濁阻竅證老年期癡呆大鼠模型的建立*

陳燕清，張俊龍，郭 蕾，秦亞莉，韓 誠(chéng)

(山西中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，太原 030024)

一種病證結(jié)合痰濁阻竅證老年期癡呆大鼠模型的建立*

陳燕清，張俊龍△，郭 蕾，秦亞莉，韓 誠(chéng)

(山西中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，太原 030024)

目的:建立一種病證結(jié)合的痰濁阻竅證老年期癡呆大鼠模型。方法:61只大鼠隨機(jī)分為A空白對(duì)照組、B老年性癡呆組、C血管性癡呆組、D痰濁阻竅證組、E病證結(jié)合(AD+VD+痰濁阻竅證)組，從Morris水迷宮、血脂、海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)等不同方面，對(duì)痰濁阻竅證老年期癡呆大鼠模型的建立進(jìn)行初步探索。結(jié)果:造模成功后，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示B、C、E組與A組間逃避潛伏期及目標(biāo)象限停留時(shí)間、原平臺(tái)區(qū)穿越次數(shù)數(shù)據(jù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血脂化驗(yàn)顯示，D組及E組的TC、LDL-C升高為其余各組的2倍以上。透射電鏡下觀察大鼠海馬CA1區(qū)超微結(jié)構(gòu)，可見(jiàn)E組的神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)受損最為嚴(yán)重，B組次之，再次為C組與D組。結(jié)論:該模型可作為痰濁阻竅證老年期癡呆模型使用，用于老年期癡呆的實(shí)驗(yàn)研究。

病證結(jié)合;痰濁阻竅證;老年期癡呆

老年期癡呆［1］是指老年人(＞60歲)出現(xiàn)持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的智力損害，表現(xiàn)為記憶、計(jì)算、思維、定向力、情感障礙及人格改變，并出現(xiàn)社會(huì)活動(dòng)能力和自身活動(dòng)能力的減退，其主要臨床類型包括老年性癡呆(AD)和血管性癡呆(VD)［2］。國(guó)內(nèi)研究表明［3］，60歲以上的老年人中按癡呆的患病率為0.75% ～4.69%。中醫(yī)藥治療老年期癡呆具有肯定的療效，但目前對(duì)于動(dòng)物模型的藥效學(xué)和作用機(jī)制的探討，多停留于西醫(yī)疾病水平，很少結(jié)合中醫(yī)的證候因素進(jìn)行研究，病證結(jié)合的老年期癡呆動(dòng)物模型較少。本研究通過(guò)集VD、AD及痰濁阻竅證于一體的大鼠模型，為建立一種新的病證結(jié)合老年期癡呆大鼠模型提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SPF級(jí)SD雄性大鼠61只，體質(zhì)量(300± 20)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(許可證號(hào)SCXK(京)2012-0001)。大鼠在相同條件下喂養(yǎng)，室溫(22±2)℃，保持自然光照，自由飲水、攝食。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，應(yīng)用Rand函數(shù)將大鼠隨機(jī)分為A組(空白對(duì)照組)9只，B組(老年性癡呆組)13只，C組(血管性癡呆組)13只，D組(痰濁阻竅證組)13只，E組(病證結(jié)合AD+VD+痰濁阻竅證)13只。

1.2 藥品與儀器

D-半乳糖(Amresco公司，批號(hào)20120120);水合氯醛(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20100331);戊二醛(成都市新都區(qū)木蘭鎮(zhèn)工業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)，批號(hào)0120213);DigBehv-MG(通用型)Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)(上海吉量軟件科技有限公司); JEM-1011透射電鏡(日本電子公司);高脂飼料購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司，高脂飼料配方為10%豬油、10%蛋黃粉、1%膽固醇、0.5%丙基硫氧嘧啶，78.5%基礎(chǔ)飼料。

2 方法

2.1 造模方法

各組大鼠同時(shí)開(kāi)始處理。A組每日以生理鹽水1 ml腹腔注射，連續(xù)6周;B組每日D-半乳糖50 mg/kg腹腔注射，連續(xù)6周;C組先結(jié)扎一側(cè)頸總動(dòng)脈，1周后結(jié)扎另外一側(cè)。A、B、C組均喂飼普通飼料。D組采用高脂飼料喂養(yǎng)，連續(xù)6周;E組同C組方式結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈，每日D-半乳糖50 mg/kg腹腔注射，并采用高脂飼料喂養(yǎng)，連續(xù)6周。

2.2 行為學(xué)測(cè)試

6周造模結(jié)束后，采用Morris水迷宮測(cè)試大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。在目標(biāo)象限放置沒(méi)入水下2 cm的平臺(tái)，采用視頻攝像跟蹤技術(shù)，同步記錄大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡。前5 d進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠的學(xué)習(xí)能力，選取目標(biāo)象限及對(duì)側(cè)象限將大鼠面向池壁放入水中，系統(tǒng)記錄大鼠尋找并爬上平臺(tái)時(shí)所需時(shí)間(即逃避潛伏期)，每次訓(xùn)練時(shí)間為120 s。如果大鼠在規(guī)定時(shí)間內(nèi)未找到平臺(tái)，須將其引至平臺(tái)并停留20 s。第6天進(jìn)行空間搜索實(shí)驗(yàn)，撤除平臺(tái)，在目標(biāo)象限的對(duì)側(cè)象限將大鼠面向池壁放入水中，系統(tǒng)記錄大鼠在60 s內(nèi)目標(biāo)象限停留時(shí)間及原平臺(tái)區(qū)穿越次數(shù)，測(cè)試大鼠的記憶保持能力。

2.3 電鏡樣品的制備

6 d水迷宮測(cè)試結(jié)束后，禁食不禁水12 h，5%水合氯醛(7 ml/kg)腹腔注射麻醉，開(kāi)腹、腹主動(dòng)脈采血2 ml用于檢測(cè)血脂。開(kāi)胸暴露心臟，灌注針由心尖部插入升主動(dòng)脈，同時(shí)剪開(kāi)右心耳，用預(yù)冷到4℃的生理鹽水快速灌注200 ml，至流出液清亮，然后換用預(yù)先冷藏的2.5%戊二醛PBS液灌注200 ml，充分固定，冰盤(pán)上迅速取腦，剝離右側(cè)海馬，在海馬CA1區(qū)切取大小為1 mm3的組織塊，放入預(yù)冷的pH 7.0，2.5%的戊二醛固定液3 h，緩沖液中冷藏待檢。電鏡室采用1%鋨酸固定，梯度丙酮逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，超薄切片厚度60～80 nm，醋酸雙氧鈾-枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡下觀察大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)，并選取典型部位攝片。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。水迷宮的定位航行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量?jī)梢蛩囟嗨椒讲罘治?，其余?shù)據(jù)采用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 Morris水迷宮檢測(cè)結(jié)果

3.1.1 定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果 表1顯示，5組大鼠隨著訓(xùn)練時(shí)間的推移，尋找平臺(tái)的時(shí)間都在縮短。但各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力不同，從第2天開(kāi)始，B、C、E組與A組比較，逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。D組與A組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 定位航行實(shí)驗(yàn)各組大鼠逃避潛伏期的變化(±s)

表1 定位航行實(shí)驗(yàn)各組大鼠逃避潛伏期的變化(±s)

注:與A組比較:▲P＜0.05

組 別 鼠數(shù)逃避潛伏期(s)第1天 第2天 第3天 第4天 第5天A組 9 110.6±12.2 62.2± 3.5 29.7± 7.9 10.0±2.0 6.9±2.3 B組 11 115.2±11.3 79.6± 4.5▲ 43.5± 8.3▲ 32.3±9.3▲ 27.4±6.8▲C組 10 107.3± 8.2 81.9± 9.3▲ 42.7±11.5▲ 33.3±4.6▲ 23.7±7.3▲D組 9 106.8± 3.8 63.3±13.5 31.0± 3.2 12.0±3.5 8.5±5.8 E組 9 113.2± 9.3 82.1± 5.1▲ 65.1± 8.9▲ 39.6±6.8▲ 29.2±7.6▲

3.1.2 空間搜索實(shí)驗(yàn)結(jié)果 表2顯示，B、C、E組與A組比較，目標(biāo)象限停留時(shí)間、原平臺(tái)區(qū)穿越次數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01)。D組與A組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 各組大鼠目標(biāo)象限停留時(shí)間、原平臺(tái)區(qū)穿越次數(shù)(±s)

表2 各組大鼠目標(biāo)象限停留時(shí)間、原平臺(tái)區(qū)穿越次數(shù)(±s)

注:與A組比較:▲▲P＜0.01

組別 鼠數(shù) 目標(biāo)象限停留時(shí)間(s)原平臺(tái)區(qū)穿越次數(shù)A組9 49.18±3.23 7.39±1.36 B組 11 28.69±6.15▲▲ 3.23±1.31▲▲C組 10 26.06±8.19▲▲ 3.56±1.73▲▲D組 9 47.96±3.68 6.96±1.99 E組 9 25.05±5.13▲▲ 3.54±1.65▲▲

3.2 血脂檢測(cè)結(jié)果

表3顯示，各組大鼠的TC與LDL-C水平比較，D組與E組比A組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表3 各組大鼠血脂檢驗(yàn)結(jié)果(±s)

表3 各組大鼠血脂檢驗(yàn)結(jié)果(±s)

注:與A組比較:▲P＜0.05。

組別 鼠數(shù)TC TG HDL-C LDL-C A組9 1.27±0.28 0.31±0.11 0.88±0.06 0.25±0.01 B組 11 1.21±0.31 0.35±0.06 0.79±0.12 0.23±0.07 C組 10 1.19±0.15 0.42±0.13 0.82±0.11 0.31±0.08 D組 9 3.39±0.49▲ 0.47±0.02 0.79±0.07 1.61±0.12▲E組 9 3.28±0.36▲ 0.43±0.02 0.77±0.14 1.82±0.21▲

3.3 電鏡觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)結(jié)果

圖1顯示，各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)如線粒體、軸突、細(xì)胞核、溶酶體等變化。

圖1 各組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

電鏡下可見(jiàn)，A組的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)正常，線粒體結(jié)構(gòu)清晰;細(xì)胞核的核型規(guī)整，核膜完好;神經(jīng)突觸結(jié)構(gòu)完整，突觸小泡均勻。B組細(xì)胞內(nèi)線粒體空泡變性，線粒體嵴脫落，排列紊亂;細(xì)胞核核型不規(guī)整，表面凹凸不平，核膜發(fā)生斷裂;突觸小泡減少。C組細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)不清，嵴脫落斷裂，高爾基體腫脹，并有自噬現(xiàn)象的次級(jí)溶酶體，吞噬物主要為破碎的線粒體;細(xì)胞核核型不規(guī)整，核膜有斷裂現(xiàn)象，突觸小泡減少。D組細(xì)胞線粒體腫脹變形，嵴排列紊亂;細(xì)胞核無(wú)明顯變化，神經(jīng)突觸相對(duì)正常。電鏡下觀察，本組標(biāo)本在各造模組中損害最輕。E組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞線粒體腫脹、膜破裂，出現(xiàn)多量畸形線粒體。次級(jí)溶酶體有明顯的自噬現(xiàn)象，吞噬物主要為破碎的線粒體。細(xì)胞核變形，染色體邊集，核膜斷裂。突觸連接間斷，突觸小泡明顯減少。電鏡下觀察，本組標(biāo)本在各造模組中損害最為嚴(yán)重。

4 討論

從臨床可知，VD與AD的癥狀、病理、神經(jīng)生物化學(xué)等諸多特點(diǎn)經(jīng)常交叉重疊，難以截然分開(kāi)［4］，且常見(jiàn)2種癡呆并存［5］。故本次實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈造成VD模型，并同時(shí)給予D-半乳糖腹腔注射造成AD的復(fù)合疾病模型。鑒于之前同時(shí)結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈，大鼠腦部短時(shí)間內(nèi)缺血損害嚴(yán)重，腦部供血不能迅速代償，死亡率高。本次實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)［6］間隔1周結(jié)扎兩側(cè)的頸總動(dòng)脈，大鼠存活率較高。采用經(jīng)典的考察大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的Morris水迷宮進(jìn)行驗(yàn)證，老年期癡呆疾病模型造模成功。

中醫(yī)認(rèn)為，高脂血癥乃血中之痰濁，屬于“無(wú)形之痰”范疇［7］。研究發(fā)現(xiàn)［8］，痰濁證患者血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白含量均明顯高于非痰濁證組和正常人組。高脂血癥的脂質(zhì)水平和中醫(yī)辨證分型有一定的相關(guān)性［9］，即高血脂為血中痰濁的客觀指標(biāo)或生化物質(zhì)基礎(chǔ)［10］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，外源性的脂質(zhì)攝入是血脂升高的重要原因。本次實(shí)驗(yàn)采用高脂飼料喂養(yǎng)42 d的方式造成大鼠高脂血癥。血脂結(jié)果顯示，喂飼高脂飼料的痰濁阻竅證組、病證結(jié)合組的TC、LDL-C明顯升高，但TG、HDL-C無(wú)明顯變化，與文獻(xiàn)報(bào)道［11］的高脂飼料可以造成大鼠的高膽固醇血癥一致，高膽固醇血癥可以看作是中醫(yī)的痰濁證。透射電鏡結(jié)果顯示，造模各組海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞都有程度不同的損害，其中尤以造模干預(yù)最多的病證結(jié)合組最為嚴(yán)重。但是只單純喂飼高脂飼料的痰濁阻竅證的CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞也有損害，這些損害積聚到一定程度，也可能成為癡呆癥狀產(chǎn)生的物質(zhì)基礎(chǔ)，故高脂血癥可以看作是痰濁阻竅證。

病證結(jié)合的中醫(yī)動(dòng)物模型是指在制作模型時(shí)，將西醫(yī)的疾病與中醫(yī)證候同時(shí)加以考慮，不僅能夠體現(xiàn)疾病的生理病理變化，而且具備中醫(yī)證候特征，此類模型在用于中醫(yī)藥的研究時(shí)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)［12］。本次實(shí)驗(yàn)在老年期癡呆動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上疊加了中醫(yī)的痰濁阻竅證，造成病證結(jié)合的動(dòng)物模型，在癡呆疾病中引進(jìn)中醫(yī)痰濁證的病因病機(jī)，為建立一種病證結(jié)合老年期癡呆動(dòng)物模型進(jìn)行了有益的探索。

［1］盛樹(shù)立．老年性癡呆及相關(guān)疾?。跰］．北京:科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2006:4．

［2］晏勇．血管性癡呆的診斷和相關(guān)問(wèn)題［J］．中華老年心腦血管病雜志，2008，10(5):321-323．

［3］李智杰．老年期癡呆［M］．北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010: 4．

［4］Kalaria R．Similarities between Alzheimer's disease and vascular dementia［J］．J Neurol Sci，2002 Nov 15，203-204:29-34．

［5］Zekry D，Hauw JJ Mixed dementia:epidemiology，diagnosis，and treatment［J］．J Am Geriatr Soc，2002，50(8):1431-1438．

［6］黃敬，劉學(xué)源，梅元武，等．老化血管性癡呆大鼠的制備［J］．中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2008，7(2):143-147．

［7］韓崇偉．健脾化痰治療高脂血癥的理論探討［J］．山東醫(yī)藥，2006，46(10):78．

［8］孫建芝，牛曉亞，韓麗華，等．痰濁證微觀辨證指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)研究［J］．河南中醫(yī)，1996，16(2):21．

［9］屠浩明．高脂血癥血脂水平與中醫(yī)辨證分型的相關(guān)性研究［J］．福建中醫(yī)藥，2003，34(6):3．

［10］宋劍南，周瑕菁，周玉萍，等．從高脂血癥及動(dòng)脈粥樣硬化探討痰瘀理論及痰瘀同治機(jī)制［J］．醫(yī)學(xué)研究通訊，2001，30 (8):24-25．

［11］姬鳳彩，姚剛，李琳琳，等．對(duì)大鼠高脂血癥模型分型的探討［J］．新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，30(11):1297-1298．

［12］趙慧輝，郭書(shū)文，王偉．病證結(jié)合動(dòng)物模型判定標(biāo)準(zhǔn)的建立［J］．北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，32(6):365-367．

Establishment of the Combined Disease and Syndrome Model of Phlegm Blockage in Senile Dementia Rats

CHEN Yan-qing，ZHANG Jun-long△，GUO Lei，QIN Ya-li，HAN Cheng
(Shanxi University of Traditional Chinese medicine，Taiyuan 030024，China)

The syndrome of phlegm obstructing orifices of senile dementia rat model was established by a combination of disease and syndrome．Methods:61 rats were randomly divided into A blank control group，B AD group，C VD group，D phlegm blocking orifices group，E combination of disease and syndrome(AD+VD+syndrome of phlegm obstructing orifices)group，from the behavior of rats，biochemical，morphological aspects preliminary exploration of establishing model，the syndrome of phlegm obstructing orifices of senile dementia rats．Results:After the success of modeling，Morris water maze test showed that B，C，E group and A group had significant difference．Blood tests:D group and E group TC，LDL-C increased above 2 times+the other groups．Observation on ultrastructure of hippocampus CA1 area of rats under transmission electron microscope，neuronal cell ultrastructure was observed in E group the damage was most severe，followed by the B group，C group and D group again．Conclusion:The model may be used as phlegm blocking orifices of senile dementia model，used for experimental study of senile dementia．

Combination of disease and syndrome;Syndrome of phlegm obstructing orifices; Senile dementia

R-332

B

1006-3250(2016)02-0174-03

2015-06-24

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81173165)-老年期癡呆典型證候病證結(jié)合判別模式研究;國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81202623)-老年性癡呆腎陽(yáng)虛證與痰濁阻竅證同病異證及方證相應(yīng)的生物學(xué)機(jī)制研究;山西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2013011051-3)-老年性癡呆模型大鼠同病異證的機(jī)制研究

陳燕清(1973-)，女，山西太谷人，副教授，醫(yī)學(xué)博士，從事藏象理論研究。

△通訊作者:張俊龍(1963-)，男，山西吉縣人，教授，醫(yī)學(xué)博士，從事中醫(yī)基礎(chǔ)理論，E-mail:jlzhang63@163．com。