姜黃素對骨肉瘤U2OS細(xì)胞系增殖、凋亡及侵襲的影響

王軍，陳鵬（山東大學(xué)第二醫(yī)院，濟(jì)南250033）

姜黃素對骨肉瘤U2OS細(xì)胞系增殖、凋亡及侵襲的影響

王軍，陳鵬
（山東大學(xué)第二醫(yī)院，濟(jì)南250033）

目的 探討姜黃素對人骨肉瘤U2OS細(xì)胞系增殖、凋亡及侵襲的影響。方法 取處于對數(shù)生長期的人骨肉瘤U2OS細(xì)胞，隨機(jī)分為4組，A、B、C、D組分別加入PBS緩沖液、姜黃素5、10、20 μmol/L，采用MTT法測算各組細(xì)胞生長抑制率，流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡情況，Transwell細(xì)胞侵襲實驗觀察細(xì)胞侵襲能力變化。結(jié)果A、B、C、D組第48小時細(xì)胞生長抑制率分別為0、13.2±2.5、23.6±4.3、41.5±6.2，第72小時細(xì)胞生長抑制率分別為0、23.1±5.1、43.2±2.7、65.7±7.3，與同組48 h比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。隨著姜黃素濃度的升高，U2OS細(xì)胞的凋亡指數(shù)明顯增高，呈濃度依賴性。U2OS細(xì)胞培養(yǎng)24 h后A、B、C、D組細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為10.01%、18.76%、24.68%、42.81%。四組間兩兩比較，P均＜0.05。U2OS細(xì)胞培養(yǎng)72 h后A、B、C、D組每高倍鏡下穿膜細(xì)胞數(shù)目分別為96.8±8.2、82.4±7.1、76.3±6.5、53.4±3.3，C、D組與A組比較，P均＜0.05。結(jié)論 姜黃素對人骨肉瘤細(xì)胞系增殖有明顯的抑制作用，且呈濃度及時間依賴性，能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞侵襲能力。

骨肉瘤；姜黃素；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞侵襲

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.25.012

骨肉瘤發(fā)病約占所有骨惡性腫瘤的30%，目前用于化療的藥物不良反應(yīng)較大，有可能進(jìn)一步降低骨肉瘤患者的生存率［1］。姜黃素是傳統(tǒng)中藥，人體耐受性良好［2］。研究表明，姜黃素對肝癌、胃癌、胰腺癌等腫瘤具有較明顯的抗癌作用，但目前關(guān)于姜黃素對人骨肉瘤細(xì)胞作用規(guī)律的研究較少［3］。2014 年5月～2015年12月，我們通過觀察不同濃度姜黃素對人骨肉瘤U2OS細(xì)胞系的抑制作用，分析姜黃素對U2OS細(xì)胞系增殖、凋亡及侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人骨肉瘤U2OS細(xì)胞系（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）；DMEM培養(yǎng)基（GIBCO-BR公司）、新生牛血清（杭州四季青生物制品有限公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（英國Galaxy公司）；姜黃素（Sigma公司）；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（eBioscience，San Diego）；FACSCalibur細(xì)胞分析儀（Becton Dickinson，MountainView）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 人骨肉瘤U2OS細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長。實驗細(xì)胞隨機(jī)分為4組，A組為空白對照組，加入PBS緩沖液；B、C、D組培養(yǎng)液中姜黃素的濃度分別為5、10、20 μmol/L。

1.3 細(xì)胞增殖能力檢測 采用MTT法。取對數(shù)生長期人骨肉瘤U2OS細(xì)胞，以1×104/孔接種于96孔板，培養(yǎng)12 h，按照預(yù)先分組，A、B、C、D組分別加入PBS緩沖液和5、10、20 μmol/L姜黃素，繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h。向各孔中分別加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。向各孔中分別加入150 μL二甲基亞砜，振蕩10 min使結(jié)晶充分溶解。于酶標(biāo)儀490 nm波長處分別測量各孔的吸光度值。細(xì)胞生長抑制率（IR）=（1-加藥組吸光度值/對照組吸光度值）×100%。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)。取對數(shù)生長期U2OS細(xì)胞接種于12孔板（1.5×105/孔），A、B、C、D組分別加入PBS緩沖液和5、10、20 μmol/L姜黃素，培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞。采用凋亡檢測試劑盒進(jìn)行檢測。懸浮于緩沖液中的細(xì)胞，室溫下于暗室用AnnexinV-FITC和碘化丙啶孵育15 min。應(yīng)用CellQuest軟件，通過FACSCalibur細(xì)胞分析儀進(jìn)行分析。Annexin V陽性的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞，記錄各組細(xì)胞凋亡指數(shù)。

1.5 細(xì)胞侵襲能力檢測 用無血清DMEM培養(yǎng)基按1∶19稀釋Matrigel，取50 μL鋪于Transwell小室上室，A、B、C、D組U2OS細(xì)胞分別加入PBS緩沖液和5、10、20 μmol/L姜黃素處理，取處理過的U2OS細(xì)胞100 μL；下室加入含10%血清的DMEM培養(yǎng)基500 μL；24 h后取出小室，膜下表面的細(xì)胞用PBS洗一遍；甲醇固定并結(jié)晶紫染色。將附著于膜下表面的細(xì)胞于高倍鏡下（×100）隨機(jī)取5個視野計數(shù)，取平均數(shù)。重復(fù)實驗2次。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對U2OS細(xì)胞增殖能力的影響 隨著姜黃素濃度的升高，U2OS細(xì)胞系增殖受到顯著抑制，受抑制程度呈濃度依賴性。A、B、C、D組第48小時細(xì)胞生長抑制率分別為0、13.2%±2.5%、23.6%±4.3%、41.5%±6.2%，第72小時細(xì)胞生長抑制率分別為0、23.1%±5.1%、43.2%± 2.7%、65.7%±7.3%，與同組48 h比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。

2.2 姜黃素對U2OS細(xì)胞凋亡的影響 隨著姜黃素濃度的升高，U2OS細(xì)胞的凋亡指數(shù)明顯增高，呈濃度依賴性。U2OS細(xì)胞培養(yǎng)24 h后A、B、C、D組細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為10.01%、18.76%、24.68%、42.81%。四組間兩兩比較，P均＜0.05。

2.3 姜黃素對U2OS細(xì)胞侵襲能力的影響 U2OS細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，A、B、C、D組每100倍鏡下穿膜細(xì)胞數(shù)分別為96.8±8.2、82.4±7.1、76.3±6.5、53.4±3.3，C、D組與A組比較，P均＜0.05。

3 討論

骨肉瘤是最常見的骨惡性腫瘤，小兒發(fā)病率較高。骨肉瘤發(fā)病的第一個高峰是青春期，第二個高峰是65歲以后。美國骨肉瘤的發(fā)生率約為400例/年。在中國的發(fā)病率約為4/100萬。骨肉瘤的10生存率為60%～75%。目前骨肉瘤的治療一般采取術(shù)前化療，截肢術(shù)或保留肢體的腫瘤切除術(shù)，術(shù)后化療。目前用于化療的藥物對于骨肉瘤細(xì)胞和人體正常細(xì)胞均有明顯的殺傷作用，不良反應(yīng)較大。

姜黃素對多種腫瘤有抗癌作用，其可作用于多種分子及細(xì)胞傳導(dǎo)通路，在基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)合成等過程中發(fā)揮重要作用［4］。姜黃素不僅通過抑制多個基因而抑制腫瘤的細(xì)胞增殖，且能影響腫瘤增殖相關(guān)的多種生長受體和細(xì)胞黏附分子［5］。在包括骨肉瘤的多種腫瘤細(xì)胞系中，姜黃素均能上調(diào)腫瘤抑制基因的表達(dá)［6］。

既往研究［7，8］表明，Bax、Cleaved PARP表達(dá)增高，Bcl-2表達(dá)降低均會明顯促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡。miR-138被認(rèn)為與骨肉瘤的凋亡有關(guān)，miR-138的表達(dá)量增大，將會抑制Smad4、NF-κB、p65和Cyclin D3等基因的表達(dá)，從而抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡［9］。研究表明，姜黃素能對多個靶點、多個傳導(dǎo)通路發(fā)生作用；以上傳導(dǎo)通路均可能受到姜黃素調(diào)節(jié)，從而發(fā)揮促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的作用。

本實驗結(jié)果顯示，姜黃素干預(yù)后骨肉瘤細(xì)胞系的增殖受到明顯抑制，凋亡水平明顯增高，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。姜黃素對骨肉瘤細(xì)胞的抑制呈濃度依賴性和時間依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。本研究中Transwell細(xì)胞侵襲實驗證明，相對于A組，C、D組骨肉瘤細(xì)胞的侵襲能力明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；表明在較高濃度姜黃素作用下，骨肉瘤細(xì)胞的侵襲能力會受到抑制。

目前關(guān)于姜黃素對人骨肉瘤U2OS細(xì)胞影響的研究較少，本研究結(jié)果顯示，姜黃素對人骨肉瘤細(xì)胞系增殖有明顯的抑制作用，且呈濃度及時間依賴性，能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞侵襲能力。姜黃素在水中的溶解度低，且在人體中的代謝率高，臨床應(yīng)用受限。未來研究中需為姜黃素尋找一種合適的載體，使其既能溶于水，又能避免退變，并能有效地釋放到作用靶區(qū)。

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R738

A

1002-266X（2016）25-0039-03

陳鵬（E-mail：0356154@fudan.edu.cn）

2016-03-10）