細胞自噬在兒童急性B淋巴細胞白血病化療抵抗中的作用

蘇莉，呂壯偉，蘇敏

(1新鄉(xiāng)醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院，河南新鄉(xiāng)453003；2新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院)

?

細胞自噬在兒童急性B淋巴細胞白血病化療抵抗中的作用

蘇莉1，呂壯偉2，蘇敏1

(1新鄉(xiāng)醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院，河南新鄉(xiāng)453003；2新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院)

摘要：目的以長春新堿(VCR)處理的人急性B淋巴細胞白血病細胞(BLCs)為模型，研究細胞自噬在兒童急性B淋巴細胞白血病(B-ALL)化療中的作用。方法將BLCs隨機分為對照組、藥物組、阻斷組和聯(lián)合組，分別加入等體積的PBS、1 μg/mL的VCR、10 mmol/L的細胞自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)、1 μg/mL的VCR+10 mmol/L的3-MA處理48 h，采用WST-1法測算細胞增殖抑制率，免疫印跡法檢測自噬相關蛋白輕鏈3β(LC3β)。結果處理細胞48 h后，藥物組、阻斷組和聯(lián)合組細胞增殖抑制率分別為9.7%±3.3%、63.4%±9.1%、80.6%±8.3%；各組間兩兩比較，P均<0.01。對照組、藥物組、阻斷組和聯(lián)合組LC3β蛋白表達量分別為0.02±0.01、0.31±0.05、0.01±0.01、0.02±0.01，藥物組高于其他組(P均<0.01)，其余各組間比較無統(tǒng)計學意義。結論細胞自噬可在ALL化療過程中活化導致化療抵抗。

關鍵詞：急性淋巴細胞白血??；細胞自噬；自噬相關蛋白輕鏈3β；化學療法；耐藥；3-甲基腺嘌呤；兒童

細胞自噬是一種生理調(diào)節(jié)和進化保守的過程，在真核細胞胞質(zhì)蛋白和大分子物質(zhì)降解中起關鍵作用。盡管自噬在一些疾病尤其是感染性疾病中發(fā)揮抗感染作用[1]，甚至在免疫系統(tǒng)發(fā)育中也起關鍵作用[2]；但研究也表明，自噬經(jīng)常在化療或放療的腫瘤細胞中激活[3]，這可能是腫瘤細胞應對治療并生存的一種策略，因此自噬可能是腫瘤治療的一個靶向[4]。急性淋巴細胞白血病(ALL)是兒童時期最常見的一類白血病，聯(lián)合化療后仍有約20%的患兒因高度耐藥而復發(fā)，尤其是急性B淋巴細胞白血病(B-ALL)。過去認為，這是治療后一些耐藥基因如多藥耐藥基因高表達的后果[5]，但常在治療后活化的細胞自噬與兒童ALL藥物抵抗是否有關尚不十分清楚。2014年1月～2015年6月，我們以長春新堿(VCR)處理的人急性B淋巴細胞白血病細胞(BLCs)為模型，研究細胞自噬在兒童B-ALL化療過程中的作用。

1材料與方法

1.1材料BLCs與培養(yǎng)試劑，ECL發(fā)光試劑盒，WST-1細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒，均購自碧云天生物技術有限公司；兔抗人自噬相關蛋白輕鏈3β(LC3β)、β-actin單克隆抗體購自Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗、HRP標記羊抗鼠二抗購自北京中杉公司；CD19-FITC及同型對照、Alexa647標記的羊抗兔二抗購自BD公司；長春新堿(VCR)、細胞自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)購自Sigma公司。

1.2方法

1.2.1BLCs增殖情況觀察96孔板加入BLCs細胞5×103/孔(100 μL)，隨機分為對照組、藥物組、阻斷組和聯(lián)合組，分別加入等體積的PBS、1 μg/mL的VCR[6]、10 mmol/L的3-MA、1 μg/mL的VCR+10 mmol/L的3-MA，每組8個復孔。處理48 h后采用WST-1法檢測細胞吸光度(A)值，按試劑盒說明書操作；實驗重復3次，取平均值。細胞增殖抑制率=(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值×100%。

1.2.2BLCs中LC3β蛋白檢測于24孔板加入5×105/mL的BLCs細胞懸液1 mL，其分組與處理同1.2.1。處理48 h后提取蛋白，采用免疫印跡法檢測β-actin及LC3β蛋白；一抗1∶1 000稀釋，4 ℃過夜；二抗1∶1 000稀釋，室溫孵育1.5 h；ECL發(fā)光后拍照，以LC3β與β-actin蛋白條帶光密度比值表示目的蛋白相對表達量。

2結果

2.1各組細胞增殖抑制率比較處理細胞48 h后，藥物組、阻斷組和聯(lián)合組細胞增殖抑制率分別為9.7%±3.3%、63.4%±9.1%、80.6%±8.3%；組間兩兩比較，P均<0.01。

2.2各組LC3蛋白表達量比較處理細胞48 h后，對照組、藥物組、阻斷組和聯(lián)合組LC3蛋白表達量分別為0.02±0.01、0.31±0.05、0.01±0.01、0.02±0.01，藥物組高于其他組(P均<0.01)，其余各組間比較無統(tǒng)計學意義。

3討論

細胞自噬是目前生命科學研究的熱點之一，尤其是在腫瘤和應激方面。雖然研究發(fā)現(xiàn)了一些自噬標志性的基因如LC3β[7]，以及一些重要的參與自噬的基因如高遷移率族蛋白1[8]，但是自噬在腫瘤細胞中的作用沒有得到很好的解釋，尤其是當受到各種應激壓力時，包括化療。Tang等[6]研究顯示，抗癌藥物VCR可通過氧化-還原調(diào)節(jié)胰腺癌細胞Panc02和結直腸癌細胞HCT116的自噬反應，影響其抗腫瘤療效，這提示自噬是腫瘤化療抵抗的關鍵因素之一。

LC3β是公認的細胞自噬的標志物，其功能涉及微管裝配和細胞質(zhì)中細胞器降解，在正常細胞中表達極少，但在應激、化療等誘發(fā)的細胞自噬中均呈高表達。本實驗在模擬ALL化療的體外模型中發(fā)現(xiàn)，微管蛋白聚合抑制劑VCR處理BLCs后，一方面表現(xiàn)為強大的抗瘤能力，腫瘤細胞大量死亡；但是，另一方面也伴隨著LC3β表達的逐漸增強，即化療后誘導的細胞自噬活化。由于自噬的本質(zhì)是細胞通過吞噬不必要的細胞器以保證細胞度過外界的應激，提示在ALL化療中存在的細胞自噬可能是化療抵抗的一個重要原因。研究表明，3-MA可通過抑制PI3K-mTOR信號通路抑制自噬的發(fā)生[9]。為了驗證以上假說，本課題應用了細胞自噬的抑制劑3-MA，結果表明3-MA可明顯抑制VCR誘導的自噬現(xiàn)象，同時伴有細胞增殖抑制率的明顯升高，進一步說明了自噬是VCR誘導化療抵抗的關鍵因素。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞對化療藥物的應答主要有兩條途徑，其中一條是細胞凋亡，如一些氧化態(tài)蛋白的表達，進而誘導Caspase。在臨床治療ALL的過程中，盡管80%的患者可獲得不錯的療效，但仍有少部分患者因化療耐藥而復發(fā)。研究已經(jīng)表明，少量殘存的腫瘤細胞是臨床化療后復發(fā)的一個重要因素[10]。結合本實驗，我們認為ALL化療失敗患者可能是因為化療時腫瘤細胞自噬活化，少量腫瘤細胞因此度過化療，化療結束后又大量擴增，進而造成臨床上的耐藥復發(fā)。

抑制細胞自噬，進而提高血液腫瘤化療效果，可能成為未來血液腫瘤治療的靶點[11]。雖然本實驗發(fā)現(xiàn)了ALL治療過程中存在著因細胞自噬而發(fā)生的化療抵抗，可能是耐藥復發(fā)的關鍵因素，但仍需要進一步研究導致自噬在化療中激活的分子機制，例如PI3K-mTOR信號通路[12]、NF-κB途徑[13]，這將為靶向自噬的新型藥物在臨床應用提供依據(jù)。

參考文獻：

[1] Deretic V. Autophagy in immunity and cell-autonomous defense against intracellular microbes[J]. Immunol Rev, 2013,240(1):92-104.

[2] Arsov I, Adebayo A, Kucerova-Levisohn M, et al. A role for autophagic protein beclin 1 early in lymphocyte development[J]. J Immunol, 2015,186(4):2201-2209.

[3] Grandér D, Panaretakis T. Autophagy: cancer therapy′s friend or foe[J]. Future Med Chem, 2010,2(2):285-297.

[4] Ní Cheallaigh C, Keane J, Lavelle EC, et al. Autophagy in the immune response to tuberculosis: clinical perspectives[J]. Clin Exp Immunol, 2013,164(3):291-300.

[5] Rao DN, Anuradha C, Vishnupriya S, et al. Association of an MDR1 gene (C3435T) polymorphism with acute leukemia in India[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2014,11(4):1063-1066.

[6] Tang D, Kang R, Cheh CW, et al. HMGB1 release and redox regulates autophagy and apoptosis in cancer cells[J]. Oncogene, 2013,29(38):5299-5310.

[7] Shpilka T, Weidberg H, Pietrokovski S, et al. Atg8: an autophagy-related ubiquitin-like protein family[J]. Genome Biol, 2011,12(7):226.

[8] Kang R, Livesey KM, Zeh HJ 3rd, et al. HMGB1 as an autophagy sensor in oxidative stress[J]. Autophagy, 2011,7(8):904-906.

[9] Wu YT, Tan HL, Shui G, et al. Dual role of 3-methyladenine in modulation of autophagy via different temporal patterns of inhibition on class I and III phosphoinositide 3-kinase[J]. J Biol Chem, 2014,285(14):10850-10861.

[10] 張志向，柴憶歡，何海龍，等.急性淋巴細胞白血病患兒骨髓微小殘留病檢測的臨床意義[J].實用臨床兒科雜志,2010,25(15):1133-1135.

[11] Puissant A, Robert G, Auberger P. Targeting autophagy to fight hematopoietic malignancies[J]. Cell Cycle, 2013,9(17):3470-3478.

[12] Sun H, Wang Z, Yakisich JS. Natural Products Targeting Autophagy via the PI3K/Akt/mTOR pathway as anticancer agents[J]. Anticancer Agents Med Chem, 2012,13(7):1048-1056.

[13] Criollo A, Chereau F, Malik SA, et al. Autophagy is required for the activation of NF-κB[J]. Cell Cycle, 2014,11(1):194-199.

Role of cellular autophagy in chemotherapy resistance of children with B-cell acute lymphocytic leukemia

SULi1,LYUZhuangwei,SUMin

(1TheSecondAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003,China)

Abstract:ObjectiveWe take the human B-cell acute lymphocytic leukemia cells (BLCs) treated with vincristine (VCR) as the models to investigate the role of cellular autophagy in chemotherapy resistance of childhood B-cell acute lymphoblastic leukemia (B-ALL).MethodsBLCs were randomly divided into the control group, experimental group, blocker group and union group, which were respectively treated with the same volume of PBS, 1 μg/mL VCR, 10 mmol/L 3-methyladenine (3-MA) and 1 μg/mL VCR+10 mmol/L 3-MA for 48 h. Transmission electron microscope was used to detect the autophagosome, WST-1 was employed to calculate the proliferation inhibitory rate and Western blotting was performed to detect the autophagy-related protein light chain 3β (LC3β) expression. ResultsThe inhibition rates after 48 h treatment in the experimental group, blocker group and union group were 9.7%±3.3%, 63.4%±9.1% and 80.6%±8.3%, respectively (all P<0.01). The LC3β expression in the control group, experimental group, blocker group and union group was 0.02±0.01, 0.31±0.05, 0.01±0.01 and 0.02±0.01, respectively, and the experimental group was higher than the other groups (all P<0.01), no significant difference was found among the other three groups. ConclusionAutophagy can be activated during chemotherapy of ALL, leading to chemotherapy resistance.

Key words:acute lymphoblastic leukemia; autophagy; autophagy-related protein light chain 3β; chemotherapy; drug-resistance; 3-methyladenine; child hood

(收稿日期：2015-10-24)

中圖分類號：R557.4

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)10-0020-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.10.007

作者簡介：第一蘇莉(1975-)，女，碩士，主管檢驗技師，主要研究方向為血液病檢驗。E-mail: suli_1975@163.com

基金項目：河南省教育廳自然科學基金項目(13A310843)；新鄉(xiāng)醫(yī)學院重點研究領域招標課題項目(ZD2011-12)。