怎樣做好正向間接血凝試驗(yàn)

王亞琴　張永勇　劉綏榮　肖港會

（①湖南省邵陽縣畜牧水產(chǎn)局　422100　②湖南省邵陽縣塘渡口鎮(zhèn)動物防疫站）

怎樣做好正向間接血凝試驗(yàn)

王亞琴①張永勇①劉綏榮②肖港會①

（①湖南省邵陽縣畜牧水產(chǎn)局422100②湖南省邵陽縣塘渡口鎮(zhèn)動物防疫站）

間接血凝實(shí)驗(yàn)（IHA）是一種簡單、快速、適用的血清學(xué)診斷技術(shù)，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果受操作技術(shù)、器材、樣品影響較大，本人根據(jù)多年的實(shí)踐體會，現(xiàn)就實(shí)驗(yàn)中器材、試劑、樣品、過程和判定標(biāo)準(zhǔn)等方面的優(yōu)化做一綜述，以期作為本實(shí)驗(yàn)的借鑒。

正向間接血凝試驗(yàn)因其準(zhǔn)確度較高、操作相對簡單實(shí)用、檢測成本相對較低深受縣級縣級獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室的青睞。間接血凝試驗(yàn)（IHA）是上世紀(jì)六十年代在我國發(fā)展起來的血清學(xué)診斷技術(shù)，是用已知血凝抗原致敏與免疫無關(guān)的惰性微粒表面（載體）檢測未知血清抗體的試驗(yàn)，迄今仍在許多疫病診斷中廣泛應(yīng)用。林琳等研究表明應(yīng)用豬瘟正向間接血凝法（IHA）與斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（dot-ELISA）以及豬瘟抗體免凝金標(biāo)試紙條比較，對規(guī)模化養(yǎng)豬場138份不同階段豬血清進(jìn)行檢測，三種方法檢測抗體的陽性率結(jié)果接近［1］［2］。數(shù)十年來正向間接血凝試驗(yàn)技術(shù)不斷完善，具有簡單、經(jīng)濟(jì)、快速、實(shí)用的特點(diǎn)，在我國有很大的用戶群，特別是規(guī)模養(yǎng)殖場也逐漸在使用這種診斷方法來診斷動物疫病和抗體水平，使得近年來，蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)的豬瘟和口蹄疫正向間接血凝試驗(yàn)的試劑用量在逐年加大；然而，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果受影響因素較多。為做好正向間接血凝試驗(yàn)，使免疫抗體低的家畜能及時(shí)得到補(bǔ)免，有效地避免疫病風(fēng)險(xiǎn)。

1　試驗(yàn)器材的選擇

本試驗(yàn)所使用的試驗(yàn)器材包括微量血凝板，微量振蕩器，移液器和吸頭，為保證試驗(yàn)的順利進(jìn)行，要選擇質(zhì)量有保障，穩(wěn)定性好的器材，要從正規(guī)有資質(zhì)的廠家或代理商處進(jìn)貨，。

1.1微量血凝板實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常使用的是有機(jī)玻璃材質(zhì)1100底角的96孔V型微量血凝板，此板可以疊放，不占實(shí)驗(yàn)室臺面，處理樣品量較大時(shí)合適；如果1100底角的96孔V型微量血凝板不夠或未購買，就選用90o板子做實(shí)驗(yàn)，清洗方法：一般先用清水浸泡，然后馬上用高壓清水沖洗，洗凈后用手甩干板子倒置于37℃溫箱中烘干。用前要先檢查血凝板孔底是否干凈，如發(fā)現(xiàn)有透光性差一點(diǎn)的孔，可用酒精棉簽擦凈。除了有機(jī)玻璃板以外，還有一次性血凝板，不需清洗，也不用擔(dān)心板子不干凈影響結(jié)果，但不能疊放，測定少量樣品適合；注意：微量血凝板在做完實(shí)驗(yàn)后要馬上洗干凈，否則時(shí)間久了再怎么洗也洗不干凈的。

1.2微量振蕩器使用振蕩器振蕩時(shí)間不宜超過10～20s鐘，振蕩強(qiáng)度不能太大，先從小到大，最后到中等強(qiáng)度即可；多塊板疊加后振蕩時(shí)要用手壓住最上一板，以防上下的振動造成孔中液體濺出而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性；如果實(shí)驗(yàn)室沒有它，也可用手輕拍血凝板的邊緣20秒即可；以上兩種方法均已血球分布均勻?yàn)闇?zhǔn)。

1.3單、多道微量移液器建議使用高質(zhì)量的移液器，如eppendorf移液器，用定量移液器需要準(zhǔn)備50μl和25μl兩種。50μl的用來加稀釋液和稀釋血清，25μl的用來加血凝抗原?？烧{(diào)的移液器要選擇與檢測過程中加樣量相近量程的移液器，吸取液體時(shí)動作要輕緩，防止溶液吸入過快，沖入移液器污染柱塞或造成堵塞漏氣。一定要養(yǎng)成移液器用完后放在移液器架上把移液器恢復(fù)到最大量程的習(xí)慣；移液器要輕拿輕放，移液器如果掉到地下很容易損壞。用完后移液器用75%的酒精棉擦拭消毒。

2　試劑的選擇

2.1抗原液體正向血凝抗原搖勻后呈棕紅色或咖啡色，無塊狀物沉淀，靜置后血球逐漸沉入瓶底。搖勻后能很快形成均勻混懸液的是好抗原，搖勻后仍有小塊黑色沉淀物（血球團(tuán)）的抗原建議不要使用，抗原放置時(shí)一定要垂直放置，使血球團(tuán)處于液體中。一瓶抗原可以檢測20～30份血清。值得一提的是液體正向血凝抗原4～8℃保存，保存期3個(gè)月，不能冷凍保存。

1.4吸嘴吸嘴一定要使用質(zhì)量優(yōu)良的國產(chǎn)吸嘴或進(jìn)口吸嘴，決不能使用劣質(zhì)吸嘴，否則會引起吸上來的液面不一樣高；高質(zhì)量的吸嘴經(jīng)過處理后可以重復(fù)使用。處理方法：吸嘴用完后浸泡在清水里，先用清水漂洗，用超聲波清洗器處理10min，換水后用二層紗布包好，用洗衣機(jī)甩干，再用超聲波清洗器處理10min，再用洗衣機(jī)甩干，高壓消毒滅菌器中121℃，20min即可，去蓋后任水分蒸發(fā)，或放37℃溫箱中烘干。吸嘴用完后沒有用清水浸泡的很難洗干凈，不必重復(fù)使用。接觸過高感染性材料的吸嘴要高溫消毒后廢棄。經(jīng)過處理后的吸嘴如果尖頭變彎，則質(zhì)量不好，不要重復(fù)使用。

2.2對照血清陰性對照血清呈淡黃色清亮液體，陽性對照血清微紅或淡黃色略微粘性的液體。陰陽性對照血清應(yīng)在4到8℃保存，有效期3個(gè)月。

2.3稀釋液稀釋液無色透明或呈淡黃色，一般情況4～8℃保存。用前建議將稀釋液放37℃溫箱中0.5h后搖勻再用較好。

3　樣品血清的處理和優(yōu)化

離心時(shí)，一般轉(zhuǎn)速應(yīng)設(shè)置為4000～12000轉(zhuǎn)/min×3～5min之間，如果所買的離心管較差易爛則轉(zhuǎn)速設(shè)低些時(shí)間設(shè)置長些；如只出點(diǎn)血清，則第二次重新離心（最好離心前用牙簽等把已凝固的血液與離心管壁劃開劃松），則血清會增多，多到一定時(shí)候，再離心血清也不會增多；空間很大的離心管（如5ml真空管），靜置一段時(shí)間（如一晚），一般會很好地析出血清來；多數(shù)帶紅色的血清靜置2h左右上部會變成清亮的，僅下端有一紅點(diǎn)，或離心后也會變成這樣，但有少部分離心后照樣會是帶紅色的血清；離心后有極少部分血清會成膠凍狀，處理辦法是戳碎并重新離心后速倒出血清，以免重新膠結(jié)；根據(jù)檢測次數(shù)和備份的需要確定最少的血清需要量，血清有0.5～1.0ml一般夠了。新分離血清應(yīng)盡快檢測完，未檢血清-15～-20℃保存。冷凍血清待檢時(shí)需融化，同時(shí)避免血清反復(fù)凍融影響檢測結(jié)果，最好需經(jīng)過56℃水浴滅活30min。嚴(yán)重溶血、嚴(yán)重污染、腐敗、變黑或有懸浮雜質(zhì)的血清樣品不宜檢測，以免發(fā)生非特異性反應(yīng)，從而影響判定結(jié)果。實(shí)驗(yàn)過程優(yōu)化

4　正向血凝試驗(yàn)過程

包括加稀釋液、稀釋待檢血清、稀釋陽性陰性血清、加血凝抗原、震蕩靜置、結(jié)果判定。在通常的試驗(yàn)當(dāng)中，為了節(jié)約試劑和血凝板，一般橫向做到第8孔就夠了，現(xiàn)以做到第8孔為例講講在試驗(yàn)中要注意的問題：

4.1加稀釋液為簡便起見，先在血凝板上所有的孔上各加稀釋液50μl。

4.2稀釋待檢血清和陰陽性血清取1號待檢血清50μl加入第1排第1孔，并將槍頭插入孔底，混勻后，從該孔吸取50μl移入第2孔，混勻后從該孔吸取50μl移入第3孔，直至第8孔。此時(shí)第1排1～8孔待檢血清的稀釋度（稀釋倍數(shù)）依次為1∶2、1∶4、1∶8、…….1∶256。每個(gè)待檢血清樣品均按上述方法稀釋。在稀釋血清操作時(shí)注意不要產(chǎn)生很多氣泡，每稀釋一份血清要換吸嘴，每次試驗(yàn)要做陰陽性對照各2～3排，做二排空白對照，即孔中加50μl稀釋液后加25μl抗原。

4.3加血凝抗原被檢血清各孔、陰性對照各孔、陽性對照各孔、稀釋液對照孔均各加血凝抗原25μl。血凝抗原用前要充分搖勻，瓶底應(yīng)無血球沉淀。一次試驗(yàn)過程應(yīng)選擇同一批號的抗原，并先從稀釋度高的孔加起，避免吸嘴和孔內(nèi)的液體直接接觸。

4.4振蕩混勻?qū)⒀逯糜谖⒘空袷幤魃险袷?0～20s，如發(fā)現(xiàn)孔中有氣泡可用電吹風(fēng)吹滅。然后將血凝板放在白紙上觀察各孔紅血球是否混勻，以沒有血球沉淀為合格。蓋上玻板，室溫下靜置2h或37℃下靜置1～1.5h判定結(jié)果；在20℃室溫下不能超過5h看，否則會不準(zhǔn)確；也可將板置冰箱中冷藏延至次日判定。

5　判定標(biāo)準(zhǔn)

（1）將血凝板放在白紙上，先觀察陰性對照血清1∶16孔和稀釋液對照孔，均應(yīng)無凝集（血球全部沉于孔底形成邊緣整齊的小圓黑點(diǎn)），或僅出現(xiàn)“+”凝集（血球大部分沉于孔底，邊緣稍有少量血球凝集）。（2）陽性對照血清1∶2到1∶256各孔（1～8孔）應(yīng)出現(xiàn)“++”到“++++”凝集為合格（少量血球沉于孔底，大部分血球凝集）。如圖1所示，該陽性血清滴度為1∶256倍或記為8log2。（3）在對照孔合格的前提下，觀察待檢血清各孔，以呈現(xiàn)“++”凝集的最大稀釋倍數(shù)為該份血清的抗體效價(jià)。例如1號待檢血清1～5孔呈現(xiàn)“++”到“++++”凝集，6-8孔呈現(xiàn)“++”凝集，那么就可判定該份血清的抗體效價(jià)為1：256，或者說8log2。（4）接種口蹄疫和豬瘟疫苗的畜群免疫抗體效價(jià)達(dá)到1∶32（即5log2；第5孔）呈現(xiàn)“++”凝集（呈現(xiàn)為散開的白色云霧狀）為免疫合格。不少地方作抗體篩檢時(shí)樣品血清只稀釋8個(gè)孔，加血凝抗原時(shí)只加第3、4、5、6、7孔，只要第5孔（含）以上出現(xiàn)凝集的就判該血清為陽性，否則為陰性（呈現(xiàn)為小黑圓點(diǎn)狀為不合格）。這種方法可以大量減少試劑的用量。值得注意的是，有時(shí)盡管小心翼翼的按標(biāo)準(zhǔn)做了，又重做了，但是，還是會出現(xiàn)部分比陰性對照散得開看不到小圓黑點(diǎn)又沒陽性對照白黃的樣品，筆者認(rèn)為應(yīng)該把這些樣品也視為陽性，因?yàn)榻?jīng)其他試驗(yàn)室多次比對這些樣品一般檢測為陽性結(jié)果，不過，為了保險(xiǎn)起見，建議這種檢測結(jié)果最好降一格判定。

6　值得探討的問題

不同血凝板的孵育時(shí)間和判定：試劑盒要求使用110度底角的血凝板，但不少實(shí)驗(yàn)室仍在使用90度底角的血凝板。如果使用的是90度底角的血凝板，結(jié)果判斷時(shí)會存在一定的差異，一般結(jié)果會偏低一些。在判讀結(jié)果的時(shí)間上，90度底角的血凝板判讀結(jié)果在1.5～2h，低于1h會判斷不準(zhǔn)，多出現(xiàn)高判結(jié)果的現(xiàn)象。而110度底角的血凝板，判讀結(jié)果時(shí)間應(yīng)在2h后為妥，冬天還可適當(dāng)長一點(diǎn)，低于1.5h會判斷不準(zhǔn)。使用90度底角的血凝板要注意掌握好判讀結(jié)果的時(shí)間，也要注意樣品凝集圖形的梯度變化情況。如果前4個(gè)孔為100%凝集，標(biāo)記為“#”或有的標(biāo)記為“++++”，第5孔為成片、塊狀的凝集，不是均勻分布，也不是多數(shù)血球沉于孔底，這時(shí)結(jié)果可以結(jié)合第4孔為100%的情況，判終點(diǎn)為第5孔。如果判為第4孔則判嚴(yán)了。如果是110度底角的血凝板就不存在這種情況了。第4孔和第5孔的判斷是這個(gè)試驗(yàn)的關(guān)鍵，判了第4孔則該份血清為陰性，判了第5孔則為陽性，陰陽之差往往就在這一下，所以要特別引起重視。

［1］ 范明遠(yuǎn)編. 于恩庶論文集［C］. 北京∶ 中華流行病學(xué)雜志編輯部，1988∶ 399-403.

［2］ 林琳， 江斌， 吳勝會等. 三種豬瘟抗體檢測技術(shù)的應(yīng)用比較［J］. 福建畜牧獸醫(yī)， 2004，6（3）∶ 23-24.

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