食管癌變進(jìn)程中HGF、c-met、VEGF蛋白的表達(dá)變化及意義

徐志彬，馮軍波，袁麗，鄭秀麗，王士杰，吳明利

(1河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，石家莊050011; 2 寧晉縣婦幼保健院)

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食管癌變進(jìn)程中HGF、c-met、VEGF蛋白的表達(dá)變化及意義

徐志彬1，馮軍波2，袁麗1，鄭秀麗1，王士杰1，吳明利1

(1河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，石家莊050011; 2 寧晉縣婦幼保健院)

摘要：目的研究從正常食管→食管癌前病變→早期食管癌→進(jìn)展期食管癌過(guò)程中，處于不同病變階段上皮或間質(zhì)中HGF、c-met及VEGF蛋白的表達(dá)變化及意義。方法 免疫組化法檢測(cè)HGF、c-met及VEGF蛋白在正常食管組織20份、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織30份、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織50份、早期癌組織25份、進(jìn)展期癌組織25份中的表達(dá)?？贵wCD34標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，測(cè)算微血管密度。結(jié)果正常食管低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、早期癌變、早期癌、進(jìn)展期癌上皮組織中，HGF蛋白陽(yáng)性表達(dá)率依次為0(0/20)、3%(1/30)、26%(13/50)、36%(9/25)、60%(15/25)；在間質(zhì)中的陽(yáng)性表達(dá)率依次為0(0/20)、0%(0/30)、30%(15/50)、52%(13/25)、76%(19/25)；在食管病變上皮中c-met蛋白陽(yáng)性表達(dá)率依次為0(0/20)、10%(3/30)、30%(15/50)、36%(9/25)、56%(14/25)；在間質(zhì)中VEGF蛋白陽(yáng)性表達(dá)率依次為0(0/20)、3%(1/30)、26%(13/50)、36%(9/25)、52%(13/25)；MVD值分別為12.33±1.68、15.72±1.97、20.91±2.20、26.42±1.96、30.01±2.35。5種組織中，HGF、c-met、VEGF蛋白的表達(dá)及MVD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。結(jié)論 隨食管癌變進(jìn)展，食管上皮組織中HGF、c-met及間質(zhì)中VEGF蛋白表達(dá)均明顯升高，HGF/c-met蛋白通路可刺激間質(zhì)成纖維細(xì)胞分泌VEGF蛋白，促進(jìn)間質(zhì)微血管形成，加速癌的進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：食管腫瘤；癌相關(guān)纖維母細(xì)胞；肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子；c-met；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)主要由活化的間質(zhì)成纖維細(xì)胞(常以α-SMA+為標(biāo)志)分泌，它的生物學(xué)活性是由原癌基因c-met編碼的受體蛋白介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的[1]。已證實(shí)HGF/c-met通路與腫瘤的生長(zhǎng)和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2~4]。HGF、c-met蛋白在食管癌組織中的表達(dá)已有報(bào)道，且被發(fā)現(xiàn)與患者的預(yù)后密切相關(guān)，但在食管癌變動(dòng)態(tài)進(jìn)程中，尤其是在癌前病變階段，該通路與食管病變相關(guān)性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，且它們與VEGF蛋白的共同表達(dá)是否可促進(jìn)腫瘤的血管形成仍未有定論。本文進(jìn)行了相關(guān)探討?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1資料與方法

1.1 臨床資料選取本院2006年1月～2012年12月行內(nèi)鏡黏膜切除術(shù)后所得的150例食管癌前病變及食管早期癌患者標(biāo)本，男84例、女66例，年齡48～76歲。入選標(biāo)本中低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變30份(低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組)、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變50份(高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組)、早期癌25份(早期癌組)。同時(shí)隨機(jī)選取2011年1~12月食管進(jìn)展期癌患者的組織蠟塊25份(進(jìn)展期癌組)，患者男13例、女12例，年齡56~76歲；賁門癌患者手術(shù)治療后的陰性上殘正常食管組織20份(正常組)，患者男9例、女11例，年齡56~66歲。各組患者年齡、性別均衡可比。

1.2組織HGF、c-met及VEGF蛋白的檢測(cè)采用免疫組織化學(xué)一步法。用已知陽(yáng)性的人癌組織切片作陽(yáng)性對(duì)照；以PBS液代替一抗作陰性對(duì)照。α-SMA鼠抗人單克隆抗體和CD34鼠抗人單克隆抗體由北京西雅金橋生物技術(shù)有限公司提供；HGF兔多抗IgG、c-met兔單克隆抗體、VEGF兔多克隆抗體，由美國(guó)Bioworldtechnology公司提供。

判斷標(biāo)準(zhǔn)：按照王立峰等[5]的標(biāo)準(zhǔn)，以間質(zhì)成纖維細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，觀察5個(gè)具有代表性的高倍視野(×400)，根據(jù)陽(yáng)性范圍：無(wú)明顯陽(yáng)性細(xì)胞為-，局灶陽(yáng)性者判定為+，彌漫陽(yáng)性者判定為++，為便于統(tǒng)計(jì)，將+和++合并為陽(yáng)性。上皮中細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，在染色均勻的區(qū)域，選取5個(gè)高倍鏡視野(×400)，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比，<1/3為陰性表達(dá)，≥1/3為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3微血管密度(MVD)值的測(cè)算 參照Maeda等[6]的方法，先在100倍視野下觀察CD34陽(yáng)性染色的微血管高密度區(qū)，即熱點(diǎn)區(qū)，在400倍視野下觀察，凡與周圍細(xì)胞和結(jié)締組織成分有明顯區(qū)別的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇作為一個(gè)微血管；管腔直徑>8個(gè)紅細(xì)胞或肌層較厚的血管均不計(jì)數(shù)。記錄3個(gè)高倍視野下的微血管數(shù)值，取平均值作為每例的MVD值。

2結(jié)果

2.1各組α-SMA蛋白的表達(dá)α-SMA在正常食管組織成纖維細(xì)胞基本無(wú)表達(dá)(0/20)，僅在平滑肌細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)；低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組、早期癌組、進(jìn)展期癌組間質(zhì)中α-SMA陽(yáng)性表達(dá)率分別為10%(3/30)、36%(18/50)、60%(15/25)、92%(23/25)；陽(yáng)性細(xì)胞呈梭形或條帶樣，主要存在于癌前病變或癌巢周圍間質(zhì)中，在進(jìn)展期癌時(shí)密集呈條索狀包裹著癌巢。各組α-SMA陽(yáng)性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與正常組比較，低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、早期癌及進(jìn)展期癌組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。

2.2各組HGF蛋白的表達(dá)HGF蛋白表達(dá)主要定位于上皮基底層細(xì)胞及異型細(xì)胞、癌細(xì)胞及癌旁纖維母細(xì)胞，胞質(zhì)著色。正常組、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組、早期癌組、進(jìn)展期癌組上皮HGF陽(yáng)性表達(dá)率分別為0(0/20)、3(1/30)、26%(13/50)、36%(9/25)、60%(15/25)。正常組、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組、早期癌組、進(jìn)展期癌組間質(zhì)中HGF陽(yáng)性表達(dá)率分別為0(0/20)、0(0/30)、30%(15/50)、52%(13/25)、76%(19/25)。組間比較差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(間質(zhì)χ2=36.44，上皮χ2=31.81，P均<0.01)。

2.3各組c-met蛋白的表達(dá) c-met蛋白只表達(dá)于上皮，正常、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、早期癌、進(jìn)展期癌組上皮中，c-met陽(yáng)性表達(dá)率分別為0(0/20)、10%(3/30)、30%(15/50)、36%(9/25)、56%(14/25)。組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=23.52.81，P<0.01)。

2.4各組VEGF蛋白的表達(dá)VEGF在間質(zhì)成纖維細(xì)胞的表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，正常食管為陰性表達(dá)，在低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組、早期癌組、進(jìn)展期癌組VEGF陽(yáng)性表達(dá)率分別為3%(1/30)、26%(13/50)、36%(9/25)、52%(13/25)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=20.17，P<0.01)。

2.5各組微血管密度MVD比較正常食管和低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織中血管少，形態(tài)規(guī)則，而進(jìn)展期癌血管明顯增高，管腔大小不一，分布雜亂。正常組、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、早期癌、進(jìn)展期癌組MVD值分別為12.33±1.68、15.72±1.97、20.91±2.20、26.42±1.96、30.01±2.35，組間比較，F(xiàn)=251.327，P=0.000。

3討論

腫瘤由實(shí)質(zhì)和間質(zhì)構(gòu)成，間質(zhì)微環(huán)境在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中所起的重要作用已被大家熟知，微環(huán)境中主要的細(xì)胞成分——癌相關(guān)纖維母細(xì)胞(CAFs)對(duì)于促進(jìn)上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)變起至關(guān)重要作用。CAFs是活化的間質(zhì)纖維母細(xì)胞，α-SMA陽(yáng)性表型是其活化標(biāo)志之一。CAFs功能復(fù)雜，可分泌多種金屬蛋白酶降解基質(zhì)，促進(jìn)癌細(xì)胞的遷徙；分泌多種生長(zhǎng)因子，促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖。HGF是活化的CAFs能夠大量分泌表達(dá)的一類非常重要的生長(zhǎng)因子，它可以促進(jìn)上皮細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)，兼具促血管生成作用。c-met是由原癌基因編碼的蛋白產(chǎn)物，具有酪氨酸激酶活性，廣泛分布于上皮細(xì)胞膜表面，是HGF的單一受體。研究表明，HGF和c-met在多種惡性腫瘤中常共同過(guò)度表達(dá)，二者可構(gòu)成異常自分泌環(huán)，持續(xù)激活信號(hào)通路，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲和生長(zhǎng)。HGF還可通過(guò)PI3K途徑誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)和分泌，后者具有強(qiáng)大的促腫瘤血管生成作用。

本研究顯示，在正常食管組織中，間質(zhì)成纖維細(xì)胞的α-SMA表型為陰性，在從低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變→高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變→早期癌→進(jìn)展期癌轉(zhuǎn)變過(guò)程中，間質(zhì)成纖維細(xì)胞的α-SMA陽(yáng)性表達(dá)率逐漸升高，進(jìn)展期癌組織中則可見(jiàn)大量的CAFs，主要分布于癌團(tuán)邊緣，呈團(tuán)、片狀，或呈條帶狀包裹著癌巢。上述結(jié)果提示：食管癌變進(jìn)程中，伴隨著上皮細(xì)胞的惡變，間質(zhì)成纖維細(xì)胞也在逐步發(fā)生活化，在逐漸向CAFs轉(zhuǎn)化的同時(shí)，其數(shù)量明顯增加，說(shuō)明此類細(xì)胞可能參與了食管鱗狀上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)變。本研究還發(fā)現(xiàn)，隨病變進(jìn)展，癌變各階段間質(zhì)成纖維細(xì)胞高表達(dá)HGF，提示其可能通過(guò)旁分泌途徑參與上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，癌變各階段上皮細(xì)胞也聯(lián)合高表達(dá)HGF和c-met蛋白，由此推測(cè)，活化的間質(zhì)成纖維細(xì)胞通過(guò)旁分泌HGF而與上皮細(xì)胞表面的c-met結(jié)合，使細(xì)胞外刺激由細(xì)胞表面?zhèn)魅?，啟?dòng)了胞質(zhì)中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過(guò)多種途徑將信號(hào)傳遞到上皮細(xì)胞核內(nèi)，促進(jìn)上皮細(xì)胞自分泌HGF，這種HGF再與上皮細(xì)胞自身的受體c-met結(jié)合形成自分泌環(huán)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞自身的增殖，間質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的HGF很可能在這一過(guò)程中是一個(gè)重要的始動(dòng)因素。

腫瘤的快速生長(zhǎng)離不開(kāi)豐富的血管供氧和養(yǎng)分。HGF是血管生成誘導(dǎo)劑，受到HGF活化的c-met受體可誘導(dǎo)骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移。臧茹琨等研究發(fā)現(xiàn)，HGF陽(yáng)性的食管癌組織MVD值較HGF陰性的癌組織MVD值高，且高M(jìn)VD組HGF陽(yáng)性率明顯高于低MVD組。VEGF是促血管生長(zhǎng)因子，能直接刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖，誘導(dǎo)腫瘤血管生成。研究顯示，HGF能夠直接或間接促進(jìn)VEGF分泌表達(dá)，并且二者具有協(xié)同作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨食管癌變進(jìn)展，食管間質(zhì)成纖維細(xì)胞逐步發(fā)生活化，其表達(dá)HGF和VEGF蛋白均逐漸增高，MVD值亦逐漸增高，尤其在高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變階段，其增高尤為明顯，提示此兩種蛋白的共同分泌表達(dá)、協(xié)同作用能明顯促進(jìn)間質(zhì)的微血管生成。

在食管癌變進(jìn)程中，伴隨著上皮細(xì)胞的惡性變，間質(zhì)成纖維細(xì)胞逐漸發(fā)生了活化，功能異?；钴S，間質(zhì)成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞表達(dá)HGF蛋白均逐漸升高，與之相似，上皮細(xì)胞表達(dá)c-met也逐漸升高，可見(jiàn)，隨著食管惡變，間質(zhì)成纖維細(xì)胞可以旁分泌HGF蛋白，與c-met蛋白結(jié)合而促進(jìn)上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和增殖，同時(shí)可間接刺激VEGF蛋白的表達(dá)，HGF與VEGF蛋白的共同表達(dá)對(duì)于促進(jìn)食管病變間質(zhì)微血管生成起重要作用，作為核心環(huán)節(jié)， 阻斷HGF/c-met通路有可能成為食管癌阻斷治療突破點(diǎn)。

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Changes in levels of HGF, c-met and VEGF expression in esophageal carcinogenesis

XUZhibin1,FENGJunpo,YUANLi,ZHENGXiuli,WANGShijie,WUMingli

(1FourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression changes in levels of HGF, c-met and VEGF of fibroblasts in different esophageal lesions from normal to precancerous lesion, then to early carcinoma and advanced carcinoma. Methods Immunohistochemistry was uesd to detect the protein expression of HGF, c-met and VEGF in 20 cases of normal tissues, 30 cases of low-grade intraepithelial neoplasia (LGIEN), 50 cases of high-grade intraepithelial neoplasia (HGIEN), 25 cases of carcinoma tissues in the early stage (CIS) and 25 cases of carcinoma tissues in the progressive stage (EA), respectively. Antibody CD34 marker was used to mark vascular endothelial cells for microvascular density detection. ResultsAs the esophageal carcinogenesis progressed, the positive expression rates of HGF protein in the esophageal epithelia were 0%(0/20), 3.33%(1/30), 26%(13/50), 36%(9/25) and 60%(15/25), respectively. The positive expression rates of HGF protein in esophageal stromal fibroblasts were 0%(0/20), 0%(0/30), 30%(15/50), 52%(13/25) and 76%(19/25). The positive expression rates of c-met protein in the esophageal epithelia were (0/20), 10%(3/30), 30%(15/50), 36%(9/25) and 56%(14/25). The positive expression rates of VEGF protein were 0(0/20), 3.3% (1/30), 26%(13/50), 36%(9/25) and 52%(13/25). Significant difference was found in the positive expression of HGF, c-met and VEGF among five kinds of tissues (χ2=36.44, 31.81, 23.52 and 20.17, respetively; all P <0.05).ConclusionsAs esophageal carcinogenesis progresses, the expression of HGF and c-met in the esophageal epithelial tissues and VEGF protein in the stromal fibroblasts is significantly increased. HGF/c-met protein pathway can stimulate interstitial fibroblasts to secrete and express VEGF protein, promote the formation of interstitial capillaries and speed up the progress of cancer.

Key words:esophageal neoplasms; cancer-associated fibroblasts; hepatocyte growth factor; c-met; wascular endothelial growth factor

(收稿日期：2015-09-11)

中圖分類號(hào)：R735.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)01-0009-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.01.003

通信作者簡(jiǎn)介：吳明利(1964-)，男，主任醫(yī)師，主要從事食管癌早診早治研究。E-mail：wu.ml@tom.com

作者簡(jiǎn)介：第一徐志彬(1976-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事食管癌早診早治研究。E-mail：xzblxh@sina.com

基金項(xiàng)目：河北省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃項(xiàng)目(20150749)。