毛細(xì)血管瘤患兒增生期和退化期瘤組織中AMPK、mTOR表達(dá)對比觀察

李娟，俞松，王凱，柳望舒，季一發(fā)，甘永橋

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義563003)

毛細(xì)血管瘤患兒增生期和退化期瘤組織中AMPK、mTOR表達(dá)對比觀察

李娟，俞松，王凱，柳望舒，季一發(fā)，甘永橋

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義563003)

目的 對比觀察增生期和退化期小兒毛細(xì)血管瘤組織中磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)表達(dá)，探討AMPK/mTOR通路在小兒毛細(xì)血管瘤消退過程中的作用。方法 收集50例小兒毛細(xì)血管瘤患者的瘤組織標(biāo)本，按照Mulliken分類法24例患兒瘤組織處于增生期(增生期組)，26例患兒瘤組織處于退化期(退化期組)，采用免疫組織化學(xué)法檢測其中AMPK、mTOR的積分光密度。結(jié)果 增生期組AMPK、mTOR的積分光密度分別為33.94±12.78、182.43±47.10，退化期組分別為85.87±19.53、47.22±44.52。兩組毛細(xì)血管瘤組織AMPK、mTOR積分光密度相比，P均<0.01。50例小兒毛細(xì)血管瘤患者瘤組織AMPK、mTOR積分光密度值呈負(fù)相關(guān)(r=-0.78，P<0.01)。結(jié)論 與增生期小兒毛細(xì)血管瘤組織相比，消退期小兒血管瘤組織中AMPK表達(dá)升高，mTOR表達(dá)降低。AMPK/mTOR信號通路參與小兒毛細(xì)血管瘤的消退過程。

血管瘤；毛細(xì)血管瘤；兒童；5磷酸腺苷活化蛋白激酶；哺乳動物雷帕霉素靶蛋白；血管瘤分期

毛細(xì)血管瘤是血管內(nèi)皮細(xì)胞及周細(xì)胞的異常增殖導(dǎo)致的良性血管腫瘤，為兒童最常見的良性腫瘤[1]，歷經(jīng)增生期、消退期及消退完全期3個自然進(jìn)程。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路在小兒血管瘤消退過程中起到重要作用[1]，PI3K/Akt非依賴性途徑磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)/mTOR信號通路與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)[2～4]，但其與小兒毛細(xì)血管瘤消退的關(guān)系尚不明確。本研究檢測并比較了增生期和消退期小兒毛細(xì)血管瘤組織中AMPK、mTOR的表達(dá)，探討AMPK/mTOR信號通路在小兒毛細(xì)血管瘤消退中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集我院2008～2015年間存檔的50例小兒毛細(xì)血管瘤患者的瘤組織蠟塊?；純褐心?0例、女30例，年齡4個月～13歲，平均28.3個月。毛細(xì)血管瘤分布在頸部35例、背部22例、上臂28例及腹部皮膚11例?；純盒g(shù)前均未做任何輔助性治療，因瘤體巨大或增長迅速等原因，家屬強(qiáng)烈要求手術(shù)切除。標(biāo)本使用征得家長同意。根據(jù)Mulliken分類分為增生期24例(增生期組)和消退期26例(消退期組)。

1.2 毛細(xì)血管瘤組織AMPK、mTOR檢測方法 采用免疫組化SP法。一抗分別為濃縮型兔抗人/鼠/兔AMPK-a單克隆抗體、濃縮型兔抗人/鼠/兔mTOR單克隆抗體(美國Santa Cruz Biotechnology Inc生產(chǎn))。一抗工作濃度1∶50。操作按試劑盒說明書進(jìn)行。以已知陽性切片作陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。AMPK以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色或棕黑色顆粒為陽性細(xì)胞，mTOR以胞膜出現(xiàn)棕黃色或棕黑色顆粒為陽性細(xì)胞。用LICA DM1000研究顯微鏡觀察切片，用LICA DFC 280攝像頭進(jìn)行圖像采集，每張切片隨機(jī)選取10個視野，保證在同等條件下拍照存檔。用IPWIN60圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析計(jì)算AMPK、mTOR積分光密度(IOD)值，取平均值。

2 結(jié)果

增生期組AMPK、mTOR的IOD分別為33.94±12.78、182.43±47.10，退化期組分別為85.87±19.53、47.22±44.52。消退期組毛細(xì)血管瘤組織AMPK的IOD低于增生期，mTOR的IOD高于消退期(P均<0.01)。50例小兒毛細(xì)血管瘤患者瘤組織AMPK、mTOR的IOD呈負(fù)相關(guān)(r=-0.78，P<0.01)。

3 討論

毛細(xì)血管瘤是血管內(nèi)皮細(xì)胞及周細(xì)胞的異常增殖導(dǎo)致的良性血管腫瘤，為兒童最常見的良性腫瘤[5]，歷經(jīng)增殖期、消退期及消退完全期3個自然進(jìn)程。小兒毛細(xì)血管瘤消退與否，主要取決于調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖或凋亡信號傳導(dǎo)通路的變化情況。mTOR為多條信號通路的交匯點(diǎn)，是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和增殖的關(guān)鍵分子?；蚋淖兓蛐盘柾穫鬟f異常，可激活mTOR，活化的mTOR磷酸化下游核糖體40S小亞基S6K蛋白激酶(p70S6K)及真核起始因子4E(eIF-4E)結(jié)合蛋白1(4E-BP1)促進(jìn)蛋白質(zhì)翻譯，使細(xì)胞周期從G1期直接進(jìn)入S期并大量增殖，毛細(xì)血管瘤進(jìn)入增生期。而當(dāng)mTOR/p70S6K信號通路受到抑制時，mTOR活化受阻，抑制p70S6K及4E-BP1磷酸化，從而抑制蛋白質(zhì)翻譯，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，毛細(xì)血管瘤進(jìn)入消退期[6,7]。

AMPK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，由α催化亞基，β、γ調(diào)節(jié)亞基組成的異源三聚體[8]。AMPK在真核生物中具有高保真性，能夠保守地調(diào)節(jié)細(xì)胞低能量狀態(tài)，被認(rèn)為是“細(xì)胞能量調(diào)節(jié)器”。AMPK通過感知外環(huán)境變化，如細(xì)胞間壓力改變、營養(yǎng)奪獲、缺氧或受二甲雙胍調(diào)節(jié)使得一磷酸腺苷濃度增加，而被激活[9]。PI3K/Akt非依賴性途徑AMPK/mTOR信號通路通過感知AMP/ATP比值實(shí)現(xiàn)對mTOR的負(fù)性調(diào)控[10]。當(dāng)腫瘤細(xì)胞迅速增殖，細(xì)胞間壓力改變且依賴有氧糖酵解途徑消耗大量能量，AMP/ATP比值增加，AMPK/mTOR信號通路被激活[11]。與PI3K/Akt/mTOR信號通路的作用相反，活化的AMPK可通過直接激活TSC1/2復(fù)合體，下調(diào)mTORC1復(fù)合體活性。而缺乏TSC2的細(xì)胞可通過AMPK磷酸化Raptor亞基上的兩個保守的蘇氨酸位點(diǎn)誘導(dǎo)14-3-3結(jié)合，使Raptor脫離mTORC1復(fù)合體，下調(diào)mTORC1活性[12～15]。

研究表明，抑制mTOR表達(dá)或減低mTOR的活性可使下游的4EBP1、p70S6K、RSK及eIF4G1磷酸化受阻，蛋白質(zhì)合成受到抑制，最終導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯并觸發(fā)凋亡，血管瘤消退[6,7]。尉娜等[16]發(fā)現(xiàn)激活狀態(tài)的AMPK/mTOR信號通路，可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及代謝，并促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，增生期毛細(xì)血管瘤組織AMPK表達(dá)低于消退期，mTOR高于消退期，提示在毛細(xì)血管瘤增生期，血管內(nèi)皮細(xì)胞大量增殖和能量代增強(qiáng)使組織處于缺氧狀態(tài)，AMPK系統(tǒng)被激活，導(dǎo)致活化AMPK在細(xì)胞中呈高表達(dá)，進(jìn)而抑制mTOR表達(dá)，并使其下游分子磷酸化過程受阻，進(jìn)而抑制蛋白質(zhì)合成，將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、代謝，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而使毛細(xì)血管瘤消退。

[1] Ji Y,Chen S,Li K,et al.Signaling pathways in the development of infantile hemangioma [J].Hematol Oncol,2014,7(1):13.

[2] Zheng QY, Jin FS, Yao C, et al. Ursolic acid-induced AMP-activated protein kinase (AMPK) activation contributes to growth inhibition and apoptosis in human bladder cancer T24 cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2012,419(4):741-747.

[3] An HK, Kim KS, Lee MH, et al. Mimulone-lnduced autophagy through p53-mediated AMPK/mTOR pathway increases caspase-mediated apoptotic cell death in A549 human lung cancer cells[J]. PLoS One, 2014,9(12):e114607.

[4] Xu XB, Gao HQ, Qin J, et al. TMP21 modulates cell growth in papillary thyroid cancer cells by inducing autophagy through activation of the AMPK/mTOR pathway[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015,8(9):10824-10831.

[5] Mulliken JB, Glowack J. Hemangiomas and vascular malformations in infants and children: a classification based on endothelial characteristics[J]. Plast Reconstr Surg, 1982,69(3):412-420.

[6] 呂欣,俞松,劉遠(yuǎn)梅,等.mTOR/p70S6K在體外培養(yǎng)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)及意義[J].中華小兒外科雜志,2012,33(2):85-87.

[7] 李堂江,俞松,羅宇,等.p110、磷酸化蛋白激酶B及蛋白激酶B在體外培養(yǎng)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)及意義[J].中華實(shí)用兒科臨床雜志，2013,28(1):73-75.

[8] Liu JL, Mao Z, Ggllick GE, et al. AMPK/TSC2/mTOR-signaling intermediates are not necessary for LKB1-mediated nuclear retention of PTEN tumor suppressor[J]. Neuro Oncology, 2010,13(2):184-194.

[9] Mihaylova MM, Shaw RJ. The AMPK signalling pathway coordinates cell growth, autophagy and metabolism[J]. Nat Cell Biol, 2012,13(9):1016-1023.

[10] 陸建國,俞松.mTOR信號通路與腫瘤研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2015, 31(2):199-202.

[11] Cairns RA, Harris IS, Mak TW. Regulation of cancer cell metabolism[J]. Nat Rev Cancer, 2011,11(2):85-95.

[12] Grahame HD. AMP-activated protein kinase: a key regulator of energy balance with many roles in human disease[J]. Intern Med, 2014,276(6):543-459.

[13] Xu Y, Liu C, Chen S, et al. Activation of AMPK and inactivation of Akt result in suppression of mTOR-mediated S6K1 and 4E-BP1 pathways leading to neuronal cell death in in vitro models of Parkinson′s disease[J]. Cell Signal, 2014,26(8):1680-1689.

[14] Fogarty S, Hardie DG. Development of protein kinase activators:AMPK as a target in metabolic disorders and cancer[J]. Biochim Biophys Acta, 2010,1804(3):581-591.

[15] Cao C,Kang JI, Hong JY, et al. Anti-tumor activity of yuanhuacine by regulating AMPK/mTOR signaling pathway and actin cytoskeleton organization in non-small cell lung cancer cells[J]. PLoS One, 2015,10(12):e0144368.

[16] 尉娜,王建平,路坦.缺氧活化AMPK/mTOR通路對腦血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及代謝的影響[J].中國老年學(xué)雜志,2014,34(5):1283-1285.

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.47.028

R732.2

B

1002-266X(2016)47-0090-02

2016-08-03)