禽白血病病毒檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

周云鋒 邊海霞 王學(xué)強(qiáng) 郭 磊 徐源佑 張 冉 王 潔 王 翔

（1.寧夏曉鳴農(nóng)牧股份有限公司，寧夏銀川 750021；2.寧夏家禽技術(shù)研究中心，寧夏銀川 750021）

禽白血病病毒檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

周云鋒1，2邊海霞1，2王學(xué)強(qiáng)1郭 磊1徐源佑1，2張 冉1，2王 潔1，2王 翔1，2

（1.寧夏曉鳴農(nóng)牧股份有限公司，寧夏銀川 750021；2.寧夏家禽技術(shù)研究中心，寧夏銀川 750021）

禽白血病作為傳染性免疫抑制病已然成為了我國(guó)乃至世界禽業(yè)最難控制的疾病之一，只有通過(guò)凈化手段才能控制，而檢測(cè)手段的可靠性、迅捷性在診斷中起著至關(guān)重要的作用，本文就近些年常用的新型的檢測(cè)技術(shù)做了簡(jiǎn)要的綜述，為實(shí)驗(yàn)室診斷方法的選擇提供參考。

禽白血病病毒（ALV）；檢測(cè)；進(jìn)展

禽白血?。ˋvianleucosis virus，ALV）是由反轉(zhuǎn)錄病毒科，慢病毒亞科，α反轉(zhuǎn)錄病毒屬的禽白血病病毒引起的禽類腫瘤性疾病，ALV已分類至A～J、K11個(gè)亞群，亞群間及各毒株間基因組十分相近，但不同亞型病毒可引起不同的腫瘤；A、B、C、D亞群是引起禽白血病腫瘤，E、F、G、H、I亞群為內(nèi)源性病毒，在雞群中普遍存在。J亞群從肉雞中分離得到的，據(jù)推測(cè)是重組體，主要誘發(fā)髓細(xì)胞白血病，該亞群病毒宿主廣泛，感染后，致病率、死淘率高，已經(jīng)是我國(guó)嚴(yán)重的傳染性疾病之一；K亞群禽白血病為2012年報(bào)道的從我國(guó)地方品系中發(fā)現(xiàn)的新亞群。目前禽白血病檢測(cè)方法主要有傳統(tǒng)的病毒分離后鑒定、基于血清學(xué)的抗原和抗體檢測(cè)、分子生物學(xué)檢測(cè)。本文就近些年來(lái)主要的檢測(cè)方法進(jìn)行了簡(jiǎn)述。

1 病原分離和鑒定

病毒分離雖然對(duì)臨床診斷意義有限，但對(duì)新毒株的鑒定、疫苗安全性檢驗(yàn)、凈化雞群的病毒檢測(cè)非常有用?？梢匀』疾∏莸娜?、組織、口腔、泄殖腔拭子、蛋清、腫瘤、羽髓、精液等。ALV病毒可以在細(xì)胞中增殖但不形成病變，該病毒在雞只體內(nèi)能形成腫瘤病變。ALV病毒對(duì)熱敏感，-60℃以下可以長(zhǎng)期保存。增殖培養(yǎng)后通過(guò)PCR等方法對(duì)病毒進(jìn)行鑒定，經(jīng)該方法鑒定后，可為雞群診斷提供準(zhǔn)確依據(jù)，但費(fèi)用高、耗時(shí)長(zhǎng)、技術(shù)要求高、工作量大、對(duì)體內(nèi)潛伏感染的病毒敏感性較低，只適合小批量樣品檢測(cè)。

2 基于血清學(xué)的抗原、抗體檢測(cè)

2.1 病毒中和試驗(yàn)

中和試驗(yàn)（NeutralizationTest）是以測(cè)定病毒的感染力為基礎(chǔ)，以比較病毒受免疫血清中和后的殘存感染力為依據(jù)，來(lái)判定免疫血清中和病毒的能力。中和試驗(yàn)具有較高的特異性，是亞群分類的基礎(chǔ)之一，只要抗體與病毒粒子上的表面抗原相對(duì)應(yīng)就能取得良好的效果，被稱為檢測(cè)ALV抗體最特異的方法[1]，但ALV分離物中存在多種蛋白質(zhì)，可能干預(yù)抗體與抗原結(jié)合，造成結(jié)果偏差。這種方法可大量檢測(cè)樣品，但制備單一抗原費(fèi)用較高，推廣較慢。

2.2 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

瓊脂擴(kuò)散是利用抗體與抗原在固體支持物瓊脂上，兩者比例適當(dāng)并有電解質(zhì)存在及一定的溫度條件下，經(jīng)一定的時(shí)間，可形成肉眼可見的沉淀物或顏色反應(yīng)。該方法可以從5日齡以上的雞只用羽髓檢測(cè)ALV病毒抗原，該方法易于推廣，操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低廉，能在兩日內(nèi)獲得結(jié)果，但在拔出羽翼時(shí)容易造成雞群應(yīng)激反應(yīng)，而且精確度較差，假陽(yáng)性較高，在實(shí)際操作中困難較大。

2.3 ELISA檢測(cè)

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）技術(shù)適用于包括蛋清、血清、胎糞、泄殖腔棉拭子等多種樣品的檢測(cè)。在生產(chǎn)中常通過(guò)ELISA方法檢測(cè)ALV抗原或抗體來(lái)診斷雞群ALV感染情況。

國(guó)外已經(jīng)建立了包括J亞型在內(nèi)的不同亞型抗體ELISA檢測(cè)試劑盒和p27抗原ELISA檢測(cè)試劑盒。國(guó)內(nèi)于1987年首次引用ELISA檢測(cè)ALV[2]，自此國(guó)內(nèi)大批研究人員開始研制、開發(fā)ELISA試劑盒，仇鈺等[3]包被p27-GST融合蛋白建立了檢測(cè)雞血清中抗ALV抗體的間接ELISA方法，與進(jìn)口禽白血病抗原檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果基本一致，已基本達(dá)到國(guó)外同類產(chǎn)品的水平。

ELISA方法特異性、敏感性高，設(shè)備要求低，可作為一種有效的普檢方法，適合大批量的流行病學(xué)調(diào)查和生產(chǎn)凈化。目前，目前市場(chǎng)上已有用檢測(cè)ALV-p27抗原和ALV-A、B亞型ELISA試劑盒出售，抗原檢測(cè)較抗體檢測(cè)在生產(chǎn)中應(yīng)用較廣，但不同試劑盒之間的敏感性存在差異[11]，而且與不同的病料組織敏感度不同，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蛋清和棉拭子是檢測(cè)外源病毒的最好的病料[4，5]。雖然ELISA方法存在著諸多缺陷，但敏感性仍遠(yuǎn)高于AGP，在疾病快速檢測(cè)和ALV檢疫及凈化方面發(fā)揮著一定作用[6，7]，可是ELISA檢測(cè)在臨床有假陽(yáng)性出現(xiàn)，因此只用于普查而不用于確診。

2.4 IFA方法

免疫熒光試驗(yàn)（IFA）可對(duì)抗原進(jìn)行細(xì)胞定位，熒光抗體試驗(yàn)特異性強(qiáng)，可對(duì)待檢病料作出快速診斷，所需時(shí)間較短。細(xì)胞抗原上的每個(gè)分子結(jié)合3～5個(gè)抗體分子，當(dāng)此抗體作為抗原時(shí)又可結(jié)合3～5個(gè)熒光抗體分子，因此單克隆抗體的間接熒光抗體法敏感性與特異性比較強(qiáng)，雖然該方法一直被研究并取得了良好的效果，但有時(shí)病料所產(chǎn)生的非特異性熒光干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此IFA檢測(cè)方法只適合實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

3 病毒核酸檢測(cè)

ALV基因結(jié)構(gòu)為：5’-（R-U5）-gag/pro-pol- env-（U3-R）-3’，編碼ALV-A～E亞群的env基因中的gp85序列中存在hr1和hr2兩個(gè)高變區(qū)，vr1、vr2和vr3三個(gè)相對(duì)保守區(qū)，可以反映不同亞群間的差異。J亞群gp85的序列在不同株間差異也很大，特別是高變區(qū)，因此通過(guò)E亞群和J亞群設(shè)計(jì)的不同引物，通過(guò)PCR等方法可以對(duì)ALV分離株進(jìn)行分群。

3.1 PCR檢測(cè)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）可以對(duì)微量的DNA或RNA進(jìn)行檢測(cè)，大大提高了檢測(cè)準(zhǔn)確性和可靠性。Hatai H等[22]用基因組3’非編碼區(qū)設(shè)計(jì)的引物建立了高靈敏度的巢式PCR法；金志強(qiáng)等[23]以單管套式PCR方法排除了E群內(nèi)源性病毒干擾，檢測(cè)外源性ALV的長(zhǎng)末端重復(fù)序列LTR，取得良好的效果；周剛等[8]于2010年優(yōu)化建立了同時(shí)檢測(cè)并鑒別內(nèi)外源性ALV的多重PCR方法。PCR和RTPCR方法是基于DNA和RNA的檢測(cè)技術(shù)，受到病毒的env基因序列和正常雞群中同源基因的干擾，另外還受到基因突變、重組、缺失等因素的困擾，這使得PCR的使用變得越來(lái)越復(fù)雜，因此至今未能找到一種方法能快速診斷ALV病毒，同時(shí)對(duì)該和病毒進(jìn)行的快速分型。

qRT-PCR是一種實(shí)時(shí)定量檢測(cè)特定核酸的技術(shù)，它是PCR技術(shù)與核酸探針技術(shù)的結(jié)合產(chǎn)物，能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)自動(dòng)化。Kim Y B等對(duì)J亞群病毒RNA定量化的結(jié)果顯示：qRT-PCR法較Qc-RT-PCR、TCID50、ELISA等方法特異性強(qiáng)、易于操作、重復(fù)性好。王峰[9]等根據(jù)ALV-J env和pol基因保守序列設(shè)計(jì)的引物建立了SYBRGreen I RT-PCR檢測(cè)ALV的方法，該方法不需要設(shè)計(jì)探針，因此靈敏度比不同PCR高出1000倍，為ALV-J早期快速診斷及種雞場(chǎng)凈化提供了一種新的檢測(cè)途徑。

3.2 LAMP檢測(cè)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）是一種嶄新的體外恒溫核酸擴(kuò)增方法。與PCR相比LAMP擴(kuò)增反應(yīng)的全過(guò)程均在同一溫度下進(jìn)行，大大簡(jiǎn)化反應(yīng)程序，降低了儀器的要求，縮短反應(yīng)時(shí)間。劉業(yè)兵等[10]根據(jù)ALV病毒基因組保守序列區(qū)域設(shè)計(jì)了多套LAMP引物，縮短試驗(yàn)時(shí)間同時(shí)建立了可視化RT-LAMP方法，結(jié)果表明與原檢測(cè)結(jié)果基本一致。康忠惠[11]根據(jù)針對(duì)gp85區(qū)段設(shè)計(jì)了兩組分別用于檢測(cè)A、B亞群禽白血病的LAMP引物，建立了可視化LAMP方法該方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)A、B亞群的快速檢測(cè)。

3.3 Dot Blot方法

斑點(diǎn)雜交（Dot Blot）是用已標(biāo)記的探針與待測(cè)的DNA或RNA進(jìn)行雜交，再將探針的標(biāo)記物顯色或顯影，直接判斷樣品中是否存在該基因片段，通過(guò)放大該方法能發(fā)現(xiàn)微量DNA。近年來(lái)也有很多科學(xué)家將Dot Blot技術(shù)引入到禽白血病的檢測(cè)中，2010年周剛[12]將特異性P27抗原基因的部分片段做成了Dot Blot探針，應(yīng)用于禽白血病診斷，但該方法無(wú)法分辨內(nèi)源禽白血病；2011年崔治中等[13]發(fā)明的Dot Blot試劑盒不但能區(qū)分內(nèi)源和外源禽白血病病毒，還可以確定A～J亞型，該方法是目前經(jīng)實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證的最為準(zhǔn)確的檢測(cè)方法[14-16]。

4 結(jié)語(yǔ)

雞是ALV的自然宿主，感染后可導(dǎo)致病雞發(fā)育緩慢、產(chǎn)蛋率低、良性和惡性腫瘤等，是一種慢性消耗性疾病，而且是一種免疫抑制性疾病，引起機(jī)體抵抗力下降和免疫抑制，導(dǎo)致其它疾病的繼發(fā)感染，是危害養(yǎng)雞業(yè)的主要疾病之一；ALV可通過(guò)垂直和水平兩種傳播方式自然感染雞群，而一些禽源生物制品中含有的禽白血病病毒是跨地域傳播的主要方式。禽白血病沒有有效的疫苗防疫和藥物治療，主要通過(guò)淘汰感染種雞，不斷凈化雞群，以控制禽白血病傳播，因此檢測(cè)方法的可靠性、靈敏度、可操作性對(duì)白血病的防控至關(guān)重要。傳統(tǒng)方法分離病毒后鑒定，雖然能準(zhǔn)確診斷病雞群，但多數(shù)都要在15天以上才能完成檢測(cè)，不利于傳染性的ALV控制；基于血清學(xué)的檢測(cè)雖然能大面積普及，但受到補(bǔ)體和內(nèi)源性ALV等因素的干擾準(zhǔn)確性較低；PCR方法雖然敏感性高、可操作性強(qiáng)，但受限于ALV病毒基因組的快速變異，需不停的改進(jìn)方法，在實(shí)際操作中干擾因素較多。因此對(duì)ALV的檢測(cè)需多種方法結(jié)合的“組合拳”并進(jìn)行多次隨機(jī)檢測(cè)，避免某一種方法的缺陷造成的漏檢現(xiàn)象。血清學(xué)檢測(cè)時(shí)需注意，ALV抗體高只說(shuō)明感染過(guò)病毒，不能說(shuō)明雞體內(nèi)存在病毒；一些其他免疫抑制性病毒，可能提高機(jī)體排毒，而抗體水平不升高。

[1] 秦愛建，崔治中，Lee Lucy，等.抗J亞群禽白血病病毒囊膜糖蛋白特異性單克隆抗體的研制及其特性[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2001，32（6）：556-562.

[2] 李厚達(dá).用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)雞白血病以及控制根除雞白血病措施的探討[J].揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），1987，8 （4）：1-4.

[3] 仇鈺，秦愛建，錢琨，等.間接ELISA檢測(cè)抗禽白血病病毒抗體方法的建立[J].中國(guó)家禽，2010，32（22）：16-20.

[4] 郭慧君，李中明，李宏梅，等.3種ELISA試劑盒檢測(cè)不同亞型外源性雞白血病病毒的比較[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，41（3）：310-314.

[5] 陳福勇.蛋種雞白血病凈化研究[J].中國(guó)家禽，2012，34（1）：38.

[6] 楊飛躍，吳艷，黃翌，等.禽白血病p27抗原檢測(cè)陽(yáng)性與病毒分離的相關(guān)性比較[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2012，48（5）：26-29.

[7] 黃進(jìn)，陳德威，張冰.應(yīng)用ELISA和AGP檢測(cè)雞白血病病毒的比較[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，1996，22（6）：6-7．

[8] 周剛，牛成明，司昌德，等.內(nèi)源和外源性禽白血病病毒鑒別PCR檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，32（7）：546-549.

[9] 王峰，劉青王，曉偉，等.實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)禽白血病病毒J亞群[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，30（11）：1422-1426.

[10] 劉業(yè)兵，張磊，孫躍輝，等.可視化的RT-LAMP方法檢測(cè)禽白血病病毒[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，42（1）：150-156.

[11] 康忠惠.AB亞群禽白血病病毒LAMP檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用[D].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[12] 周剛，牛成明，司昌德，等.禽白血病病毒斑點(diǎn)雜交檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，（1）：53-55，70.

[13] 崔治中，趙鵬，孫淑紅，等.雞致病性外源性禽白血病病毒特異性核酸探針交叉斑點(diǎn)雜交檢測(cè)試劑盒的研制[J].中國(guó)獸藥雜志，2011，（8）：5-11.

[14] 徐海鵬，孟凡峰，董宣，等.種蛋中內(nèi)源性禽白血病病毒的檢測(cè)和鑒定[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，（8）：1317-1323.

[15] 孟凡峰，范建華，徐步，等.核酸雜交技術(shù)在禽白血病病毒TCID50測(cè)定中的應(yīng)用[J].中國(guó)家禽，2015，（1）：13-16.

[16] 欒懷彪，趙穎潔，呂艷艷，等.核酸斑點(diǎn)雜交法與ELISA在SPF雞檢測(cè)弱毒疫苗中ALV污染的應(yīng)用與比較[J].中國(guó)家禽，2016，（4）：10-13.