m iRNAs在HBV感染及肝癌發(fā)病中的作用

王　毅　綜述，楊振華　審校

m iRNAs在HBV感染及肝癌發(fā)病中的作用

王毅綜述，楊振華審校

miRNAs是一類非編碼的小RNA，對細胞增殖、分化、凋亡起著重要的作用。最重要的是它可以導(dǎo)致組織細胞發(fā)生癌變。肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，HBV感染是導(dǎo)致肝癌發(fā)生的最為重要的危險因素，miRNAs在此過程中起到很重要的作用。本文將對miRNAs在HBV感染及在肝癌發(fā)病中扮演的角色做逐一闡述。

肝細胞癌；微小RNA；乙型肝炎病毒

[Abstract]MicroRNAs(miRNAs)are a kind of non-coding RNAs，which play an important role in cell proliferation，differentiation and apoptosis.Most importantly，miRNAs take part in carcinogenesis.HBV infection is the most important risk factor related to the occurrence of liver cancer and miRNAs are involved in this process.

【Key words】Hepatocellular carcinoma;MicroRNAs；Hepatitis B virus

MicroRNAs（miRNAs）是一類較小的非編碼的RNA并且廣泛地存在于真核生物之中。通過完全或部分地堿基互補配對方式作用于靶基因，導(dǎo)致mRNA的降解或翻譯抑制。miRNAs積極地參與到動、植物的很多生理過程中，如細胞的增殖、分化、凋亡，當miRNAs表達異常時則可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。已經(jīng)有大量文獻報道m(xù)iRNAs可在腫瘤的發(fā)生中扮演著重要的角色，肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）為世界上廣泛存在的惡性腫瘤，認為與乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）的感染有密切的關(guān)系[1]。HBV可以通過下調(diào)或者上調(diào)很多分子影響肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。在由HBV發(fā)展到HCC的過程中，miRNAs發(fā)揮了重要的作用，近年的研究發(fā)現(xiàn)了由HBV導(dǎo)致的肝癌與異常表達的m iRNAs存在著重要的關(guān)聯(lián)[2]。因此，miRNAs在HBV及肝癌的發(fā)生發(fā)展演變過程中扮演著非常重要的角色。本文將從以下幾個方面予以介紹。

1　m iRNAs在腫瘤發(fā)病中的作用

m iRNAs是一類長約21～30個堿基的非編碼的小RNA，在人類全基因組中被發(fā)現(xiàn)的miRNAs已經(jīng)將近有1000個。成熟m iRNAs是通常是由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄成較長的初級產(chǎn)物，又經(jīng)Dicer酶等核酸酶剪切加工生成，隨后在細胞質(zhì)中組裝成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC），m iRNAs通常是通過與基因的3′UTR區(qū)域結(jié)合來抑制阻遏基因的表達。RISC通過降解靶基因的mRNA來抑制靶基因的表達，每個miRNAs可以結(jié)合200多個靶基因的mRNA[3]。盡管m iRNAs已經(jīng)被公認為可以調(diào)控基因的表達，但是精確的調(diào)節(jié)機制到目前為止還并不是十分的清楚。已經(jīng)有許多報道稱miRNAs在很多細胞發(fā)育的過程、細胞的增殖、分化、凋亡中扮演著重要的角色，并且還可以導(dǎo)致細胞發(fā)生癌變[4]。miRNAs芯片研究顯示，miRNAs可以作為很多腫瘤潛在的腫瘤標志物[5]，在未來這無疑會對腫瘤的診斷提供巨大的便利。很多miRNAs已經(jīng)被確定為腫瘤促進因子或者腫瘤抑制因子，在腫瘤組織中大多數(shù)miRNAs的表達下調(diào)的，說明m iRNAs更多是作為腫瘤抑制因子。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中miRNAs可以調(diào)節(jié)腫瘤干細胞的遷移[6]，所以快速準確的研究miRNAs及其靶基因會對很多疾病和腫瘤的治療提供更多的途徑。

2　m iRNAs與HBV感染和HCC發(fā)病的關(guān)系

HCC是最常見的惡性腫瘤之一，在最常見的惡性腫瘤中排在第五位并且在腫瘤死亡率中高居第三位[7]，每年在全球范圍內(nèi)HCC的發(fā)病人數(shù)超過6萬人，HCC通常是由一些慢性肝臟疾病發(fā)展而來并且可能伴隨著肝硬化[8]。

HBV感染是導(dǎo)致HCC發(fā)生的最為重要的危險因素之一[1]，因此研究HBV如何影響HCC進展就變得十分的重要。HBV是屬于嗜肝病毒中小分子、有包膜的部分雙鏈環(huán)形DNA病毒，屬于肝脫氧核糖核酸病毒科家族。HBV基因組編碼的蛋白質(zhì)主要有四種：非結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)蛋白（Hepatitis B virus X protein，HBx）、表面抗原（Hepatitis B surface antige，HBs）、核心蛋白?（Hepatitis B core protein，HBc）和DNA聚合酶（Hepatitis B DNA polymerase，HBp）。HBV感染人體后主要可導(dǎo)致急、慢性肝炎，進而發(fā)展成為肝硬化或HCC。HBV促進HCC的發(fā)病機制目前尚未完全清楚。目前的研究表明，HBV的致癌作用可能主要通過兩種途徑發(fā)揮作用：通過將病毒的基因組整合到宿主的基因組來活化原癌基因或抑制抑癌基因的表達；病毒編碼的蛋白可以激活或抑制部分細胞的基因或者信號通路的活性進而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生[9]。

全球有超過350萬的HBV慢性攜帶者和持續(xù)感染者有非常高的風(fēng)險發(fā)展成為肝硬化并最終導(dǎo)致HCC發(fā)生[10]。HBV可以導(dǎo)致HCC的發(fā)生，HBV又可以影響miRNAs的表達。目前，miR-122是HBV感染或者肝臟疾病中研究的最清楚的一個miRNAs。這個肝臟特異性的miRNAs在正常肝細胞中表達量很高，在肝臟的脂質(zhì)代謝，生長發(fā)育，腫瘤形成等過程中發(fā)揮著重要的作用。miR-122可以通過與HBV序列上的一段高度保守區(qū)結(jié)合來抑制病毒的復(fù)制和基因表達。另外，越來越多的研究證明HBx蛋白可以通過調(diào)控miRNAs來影響宿主體內(nèi)基因的表達，最終影響HCC的進展[11]。m iR-1通過下調(diào)HDAC4來增強HBV核心啟動子的轉(zhuǎn)錄。這個miRNAs的作用可能與HBx相互補充來誘導(dǎo)共價閉合環(huán)狀DNA分子（Covalently closed circular DNA，cccDNA）的修飾和病毒的擴增。miR-372和miR-373同樣可以通過作用于核因子I/B來增強HBV的基因表達。let-7家族已經(jīng)被證實可以被HBx負調(diào)控，let-7的下調(diào)導(dǎo)致（Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）活性增強，進而促進了病毒復(fù)制，細胞增殖以及HCC的發(fā)生。Connolly et al發(fā)現(xiàn)miR-17-92和miR-21在HBV感染的肝硬化肝臟組織中表達明顯升高[12]。Tung et al發(fā)現(xiàn)在伴隨著HBV感染的腫瘤早期階段7個miRNA表達異常，連續(xù)檢測后他們發(fā)現(xiàn)伴隨著腫瘤的發(fā)展miR-145和miR-199b保持著一個持續(xù)的低水平，而miR-224則保持著持續(xù)的高水平。這些miRNAs在腫瘤的早期階段與腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲有關(guān)[13]。具體的機制研究發(fā)現(xiàn)miR-101、miR-181受到HBV調(diào)控之后其miRNAs靶基因表達發(fā)生變化影響HCC的進展[14]。

3　m iRNAs作用于HBV

對于HBV生物學(xué)及其致病機制的研究就顯得尤為重要。近年來的一些研究表明，細胞或者病毒所編碼的miRNAs在病毒致病的過程作為一種新型的調(diào)控分子發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。目前已經(jīng)被證實的病毒，例如皰疹病毒，它所編碼的miRNAs可以調(diào)控細胞內(nèi)源性的蛋白及病毒蛋白從而促進病毒感染周期的進展[15]。就像病毒編碼的miRNAs可以調(diào)控宿主蛋白表達一樣，部分宿主編碼的m iRNAs也可以調(diào)控病毒的蛋白。細胞的miRNAs主要通過以下方式直接或者間接對HBV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的影響，及HBV感染對細胞miRNAs表達的改變。

3.1miRNAs調(diào)節(jié)HBV基因轉(zhuǎn)錄和復(fù)制MiR-32是第一個被發(fā)現(xiàn)在哺乳動物體內(nèi)有抗病毒活性的miRNA[16]。MiR-32通過作用于病毒的ORF-2來抑制病毒mRNA的翻譯過程。研究表明miRNAs通過直接作用于HBV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物來抑制HBV的表達和復(fù)制。一些生物信息學(xué)方法被用來篩選miRNAs在HBV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中又能影響HBV復(fù)制的靶向結(jié)合物，一種具體方法是篩選影響HBV復(fù)制的miRNAs，再尋找可以與其配對的miRNAs，通過計算機程序軟件尋找HBV中可以與這些miRNAs結(jié)合的序列。為了確定哪些miRNAs可以影響HBV的表達復(fù)制過程，Zhang et al將328種miRNAs的反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染到HepG2.2.15細胞中，然后檢測細胞中HBsAg的表達水平。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了miR-184、miR-185、miR-196a、miR-199a-3p、miR-210和miR-217的反義寡核苷酸的實驗組HBsAg表達水平升高[17]。利用生物信息學(xué)軟件分別分析預(yù)測miR-210和miR-199a-3p在HBsAg編碼區(qū)域和HBV前S區(qū)域的結(jié)合位點，Chen等人首次發(fā)現(xiàn)了miR-122對HBV表達和復(fù)制的抑制作用，并且利用RNA22，miRanda軟件預(yù)測miR-122結(jié)合HBV序列的具體位點。為了驗證miR-122是否是通過堿基互補配對的方式作用于HBV RNA序列，他們將m iR-122的原始序列和HBV中可以與miR-122結(jié)合的序列進行突變，再去分析野生型和突變型的miR-122對野生型和突變型的HBV基因表達的影響。結(jié)果突顯示突變型的miR-122不能抑制野生型HBV的HBsAg和HBeAg的表達水平，野生型的miR-122也不能明顯影響突變型HBV的蛋白表達水平。然而突變型miR-122明顯抑制突變型HBV的HBsAg和HBeAg表達水平。通過類似的方法發(fā)現(xiàn)，miR-15a和miR-17-92通過作用于病毒轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物來抑制病毒的表達和復(fù)制[18]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些細胞的miRNAs能夠抑制或直接針對病毒的RNA促進病毒復(fù)制。雖然HBV是一種DNA病毒，但是它的轉(zhuǎn)錄體仍然可能被細胞的miRNAs靶向調(diào)控。

3.1.1m iRNAs調(diào)控HBV相關(guān)的細胞蛋白和HBV復(fù)制HBV的復(fù)制周期的多個環(huán)節(jié)受到宿主肝細胞中的多種細胞蛋白的復(fù)雜調(diào)控。HBV的cccDNA能夠穩(wěn)定的感染宿主肝細胞的細胞核的微染色質(zhì)，作為前基因組和mRNA轉(zhuǎn)錄的模板，這個轉(zhuǎn)錄的過程受到表觀遺傳學(xué)的調(diào)節(jié)，例如DNA甲基化、乙?；敖M蛋白修飾[19]。近年來的研究表明調(diào)節(jié)HBV復(fù)制的重要的轉(zhuǎn)錄因子受到宿主肝細胞的內(nèi)源性miRNAs的調(diào)控的。Wang et al發(fā)現(xiàn)可以綁定和激活HBV復(fù)制的轉(zhuǎn)錄因子C/EBP受到miR-155的負調(diào)控，來減弱HBV的復(fù)制[20]。

一些研究用生物信息學(xué)的方法尋找可以特異性抑制HBV轉(zhuǎn)錄體的miRNAs。Zhang et al在HepG2.2.15細胞中轉(zhuǎn)染人的328個miRNAs的RNA拮抗劑通過HBs表達篩選對HBV復(fù)制有作用的miRNAs。研究發(fā)現(xiàn)6組的m iRNAs的RNA拮抗劑可以引起HBsAg的表達增加1.4～1.6倍，但沒有顯著影響宿主細胞的增殖。用生物信息學(xué)方法對這6個miRNA分析表明在HBsAg編碼區(qū)有一個潛在的miR-199a-3p的結(jié)合位點，而miR-210的結(jié)合位點在HBV前-S1區(qū)[21]。

3.1.2細胞miRNAs的調(diào)控HBV復(fù)制m iRNAs除了能影響病毒的轉(zhuǎn)錄，有文獻研究表明它還能影響HBV復(fù)制。DNA甲基化可能不僅在宿主基因沉默，而且在抑制HBV cccDNA的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮關(guān)鍵作用，而（DNA methyltransferase，DNMT）不僅與惡變有關(guān)，還可以通過甲基化病毒DNA來降低HBV基因的表達和復(fù)制。一些研究發(fā)現(xiàn)DNMT-1是miR-148a和的miR-152的靶基因。在HBV相關(guān)HCC中miR-152的表達與DNMT1的表達也表現(xiàn)出負相關(guān)的關(guān)系[22]。這些都表明了miR-152可能是調(diào)節(jié)宿主和病毒的cccDNA的甲基化的一個因素。最近的一項研究中Lu的研究小組指出，miR-1的過度表達導(dǎo)致HBV復(fù)制明顯增加，乙肝病毒的轉(zhuǎn)錄的上調(diào)，抗原表達和分泌的增加。在Qiu的研究中發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染HBV的Huh7細胞中沉默掉miR-122可以明顯的促進HBsAg和HBeAg的分泌，同樣的在內(nèi)源性的miR-122低表達的轉(zhuǎn)染HBV的HepG2細胞中過表達m iR-122，HBsAg和HBeAg表達降低。miR-122的抑制劑可以增加細胞血紅素加氧酶-1（Heme oxygenase-1，HO-1）的表達，HO-1被證明能減少HBc的穩(wěn)定性，從而在體內(nèi)和體外減少HBV cccDNA水平。3.2 HBV編碼的蛋白調(diào)控miRNAs的表達一些文獻報道許多細胞的miRNAs可以調(diào)節(jié)HBV的表達和復(fù)制，然而，較少的研究發(fā)現(xiàn)HBV編碼的蛋白質(zhì)是否可以影響細胞的miRNAs表達。Wang et al在表達HBx的細胞中用miRNAs芯片研究了286個人的miRNAs的表達差異，發(fā)現(xiàn)HBx可以分別顯著上調(diào)的7個細胞的miRNA表達，下調(diào)11個細胞的miRNA表達。同樣的在HCC患者中，HBx蛋白的表達與let-7家族呈現(xiàn)出一種負的相關(guān)性。let-7的是在人類中發(fā)現(xiàn)的第一個miRNAs并且可以靶向調(diào)節(jié)一些重要的細胞癌基因，如Ras、HMGA2和MYC基因[23]。

盡管HBV調(diào)節(jié)miRNAs的具體準確的機制尚不是很清楚，但是在HBV編碼的四個開放閱讀框：HBp、HBs、HBc和HBx中，HBx起著很重要的作用。HBx通過調(diào)節(jié)很多轉(zhuǎn)錄因子如p53的表達，而轉(zhuǎn)錄因子p53可與miR-23a、miR-34、miR-148b和miR-200等miRNAs啟動子結(jié)合，因此HBx會通過誘導(dǎo)或者轉(zhuǎn)錄因子使miRNAs的表達受到調(diào)控[24]。HBV還可以通過調(diào)節(jié)miRNAs啟動子活性來影響其表達[14]。

在表觀遺傳學(xué)當中腫瘤抑制因子在HCC的發(fā)病和發(fā)展之中表達經(jīng)常受到抑制，而miRNAs導(dǎo)致的腫瘤抑制因子沉默提供了另外一種基因沉默機制。miR-21已經(jīng)被確定為是一個促癌因子，它可以通過阻遏腫瘤抑制因子PDCD4的表達來導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[25]。除了降低腫瘤抑制因子之外，增強腫瘤促進因子的表達同樣可以促進HCC的發(fā)生和進展。HBx可以下調(diào)miR let-7的表達，miR let-7通過調(diào)節(jié)一系列腫瘤促進因子如c-Myc、RAS和STAT3來促進HCC的發(fā)生和進展[26]。

4　HBV感染后m iRNAs調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答

當機體感染HBV時，免疫系統(tǒng)在清除病毒過程中有重要作用，近來研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染時miRNAs在免疫系統(tǒng)中有扮演著重要角色[27]。幾項研究結(jié)果顯示在哺乳動物體內(nèi)miRNAs會通過人體干擾素系統(tǒng)來對抗HBV的感染。MiR-155可以通過抑制細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1的表達或者激活JAK-STAT信號通路來增強機體的抗病毒免疫，同時還會抑制HBV的復(fù)制和表達。因此，在未來可能會通過上調(diào)機體miR-155的表達來對抗機體HBV的感染，并且高表達的miR-155可能會阻滯HCC的發(fā)展過程[28]。miR-548則通過與IFN-λ1的3’UTR結(jié)合來抑制IFN-λ1的表達，低表達的IFN-λ1有利于HBV的復(fù)制。但在HBV感染時內(nèi)源性的miR-155表達會被抑制，這對于機體來說是一個保護性的抗病毒應(yīng)答反應(yīng)。盡管這些m iRNAs可以抵抗HBV感染，但是病毒被認為也會利用m iRNAs降低復(fù)制水平來逃避免疫系統(tǒng)的攻擊并保持持續(xù)的病毒復(fù)制[29]。一些miRNAs也會通過HBV來侵害機體免疫系統(tǒng)，最近Wang et al發(fā)現(xiàn)在HBV感染的病人體內(nèi)表達上調(diào)的miR-146會作用于STAT1的mRNA，低表達的STAT1會導(dǎo)致T細胞受到損害從而導(dǎo)致免疫系統(tǒng)受損[30]。miR-34a可以通過調(diào)節(jié)趨化因子CCL2，在HBV感染時miR-34a的表達降低。低表達的m iR-34a可以通過趨化因子CCL2招募募集T細胞，使得效應(yīng)T細胞抗病毒感染過程中活性降低[31]。

5　m iRNAs作為HCC發(fā)生的標志物

miRNAs在病毒復(fù)制、抗病毒免疫、致癌過程中的重要作用，使其在HBV感染及相關(guān)疾病的診斷、預(yù)后、靶向治療方面具有重大的價值。miRNAs在未來有可能成為HCC的腫瘤標志物。miR-122和miR-18a在外周血中釋放，在HBV相關(guān)HCC可以作為未轉(zhuǎn)移的篩選指標[32]，還有miR-let-7g，mi R-29,miR-22，miR-26，miR-99a，miR-124，m iR-139，miR-199b和miR-145被報道與腫瘤血管生成、疾病復(fù)發(fā)和預(yù)后不良有緊密的聯(lián)系[33]。而miR-10b，miR-155，miR-21，miR-135a，miR-182和miR-221與腫瘤的轉(zhuǎn)移有一定關(guān)聯(lián)[34]。Yamamoto et al發(fā)現(xiàn)miR-500在HCC病人的血清中呈現(xiàn)高表達，然而在外科手術(shù)治療后miR-500的血清中表達水平較手術(shù)前出現(xiàn)了明顯的下降[35]。以上皆說明m iRNAs在未來可能會成為診斷HCC的新的腫瘤標志物。miRNAs扮演著促癌因子或者抑癌因子的角色，所以在未來miRNAs有可能會被當成腫瘤治療的新突破口。

6　總結(jié)

miRNAs參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展，許多研究將miRNAs作為HBV、HCC的分子診斷標志和治療靶標。但還存在如下幾方面的問題：1.有效的傳遞到細胞核；2.抵抗miRNAs的降解；3.miRNAs復(fù)合物的穩(wěn)定性；4.miRNAs組織特異性的傳遞。但這些問題都在進一步的解決當中。即使基于miRNAs的基因治療形式有著較高的吸引力，但在真正運用這種治療方法之前弄清它們和靶基因之間的關(guān)系，轉(zhuǎn)錄因子和miRNAs促進體的調(diào)控是非常有必要的。我國是一個HBV感染大國，HCC的發(fā)病與其有著密切的聯(lián)系。相信在不久的將來miRNAs作為HBV、HCC的分子診斷標志和治療靶標將成為現(xiàn)實。

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（收稿：2015-09-08）

（本文編輯:李磊）

Role of m iRNAs in HBV infection and hepatocarcinogenesis

Wang Yi，Yang Zhenhua.Department of General Surgery，Central People’s Hospital，F(xiàn)irst School of Medicine，Sanxia University，Yichang 443003，Hubei
Province，China

10.3969/j.issn.1672-5069.2016.03.000

443003湖北省宜昌市三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院/宜昌市中心人民醫(yī)院普通外科

王毅，男，38歲，醫(yī)學(xué)碩士，主治醫(yī)師。主要從事臨床急診及肝膽疾病防治研究。E-mail:wangyi76822@163.com

楊振華，E-mail:yangzhenhua@163.com