N rf2信號(hào)通路與肝細(xì)胞凋亡研究進(jìn)展

崔　丹　綜述，楊寶山　審校

N rf2信號(hào)通路與肝細(xì)胞凋亡研究進(jìn)展

崔丹綜述，楊寶山審校

肝細(xì)胞凋亡可分為生理性和病理性兩種。當(dāng)肝細(xì)胞凋亡受到抑制或是凋亡過度時(shí)，都會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生?；钚匝跏钦T導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)源性凋亡的因素之一。研究顯示，轉(zhuǎn)錄因NF-E2相關(guān)因子2（Nrf2）在機(jī)體抗氧化、抗炎、抗腫瘤等方面都起到了重要的作用。本文重點(diǎn)介紹了Nrf2的相關(guān)通路及其在肝細(xì)胞受到氧化應(yīng)激時(shí)發(fā)揮抗凋亡作用的研究進(jìn)展。

肝細(xì)胞；凋亡；活性氧；轉(zhuǎn)錄因NF-E2相關(guān)因子2

【Abstract】Hepatocyte apoptosis can be divided into physiological and pathologicalapoptosis.Both of them are relevant to the progression of liver disease.Reactive oxygen species(ROS)play an important role in the induction of hepatocyteapoptosis. Recently,some reports show thatnuclear factor E2-related fator 2(Nrf-2)represents one of the mostimportant cellular defense mechanisms against oxidative stress,inflammatory and tumorigenesis.Here,we reviewed the mechanisms of signal transduction involved in Nrf-2 related pathway and its possible roles in the process of hepatic apoptosis under oxidative stress.

【Key words】Hepatocytes;Apoptosis;Reactive oxygen species;Nuclear factor E2-related fator 2

細(xì)胞凋亡又叫程序性細(xì)胞死亡或者細(xì)胞的自殺性死亡，是機(jī)體固有的一種自我調(diào)節(jié)形式。當(dāng)細(xì)胞凋亡受到抑制或者凋亡過度，打破了機(jī)體的平衡能力時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生。氧化應(yīng)激是機(jī)體受到各種因素刺激時(shí)，體內(nèi)產(chǎn)生過多高分子活性物質(zhì)而引起組織和細(xì)胞損傷的過程，細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡受到破壞，從而影響多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2（Nuclear factor E2-related fator 2，Nrf2）是一個(gè)在全身表達(dá)的一種轉(zhuǎn)錄因子，主要在一些代謝性器官表達(dá)，如肝臟、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚[1]等，參與到各種細(xì)胞生命活動(dòng)中，包括維持氧化還原平衡、代謝、增殖和凋亡。此外，多方面的證據(jù)表明其在肝臟的損傷和修復(fù)中起到了重要的作用[2,3]。研究表明，Nrf2可抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞再生。本文主要?dú)w納了Nrf2信號(hào)通路及其在氧化應(yīng)激下肝細(xì)胞凋亡中的作用,探討其在臨床治療中的指導(dǎo)意義。

1　肝細(xì)胞凋亡

肝臟是人體重要的解毒、代謝、合成器官，可抵御有害物質(zhì)對(duì)人體的侵害。但當(dāng)肝細(xì)胞受到一些因素的影響時(shí)，會(huì)出現(xiàn)過度的凋亡，引發(fā)一系列病理變化，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。以往人們認(rèn)為肝細(xì)胞凋亡受到兩個(gè)途徑調(diào)控：1）外源性（死亡受體途徑）：基本機(jī)制是Fas系統(tǒng)的激活，當(dāng)細(xì)胞在接受凋亡信號(hào)（如TNF-α、FASL等）后，F(xiàn)as和細(xì)胞膜上FasL受體相結(jié)合，激活了細(xì)胞凋亡通路[4]。細(xì)胞表面分子受體相互聚集并與細(xì)胞內(nèi)的銜接蛋白相結(jié)合，procaspases募集在受體周圍并相互活化，產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。2）內(nèi)源性（線粒體途徑）：當(dāng)肝細(xì)胞受到多種信號(hào)（如：活性氧、鈣離子、P53等）刺激時(shí)，可導(dǎo)致線粒體外膜通透性增加和膜電位的下降，線粒體內(nèi)膜上的細(xì)胞色C（Cytochrome C，Cyt-c）釋放到胞質(zhì)中，并與胞質(zhì)內(nèi)的凋亡肽酶激活因子-1、ATP等結(jié)合形成凋亡小體，活化了Pro-caspase-9并激活下游的促凋亡蛋白激酶，不但使得DNA降解為寡聚核苷酸片段，同時(shí)將肝細(xì)胞骨架拆散，切斷其與周圍的聯(lián)系，誘導(dǎo)了肝細(xì)胞表達(dá)促凋亡信號(hào)，引發(fā)細(xì)胞凋亡[5]?，F(xiàn)在人們又發(fā)現(xiàn)第三種途徑，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Endoplasmic reticulum stress，ERS）途徑，ERS是細(xì)胞應(yīng)激的最初的反應(yīng)，過度的ERS可誘發(fā)細(xì)胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激主要激活3條信號(hào)通路：未折疊蛋白反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解功能和調(diào)節(jié)多肽對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)編碼的調(diào)控ERS使Caspase-12活化，誘導(dǎo)相應(yīng)分子伴侶產(chǎn)生增加，繼而激活Caspase-9，引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)凋亡[6]。Nrf2主要是通過抑制線粒體途徑起到抗凋亡作用。

2　活性氧與肝損傷

肝臟作為人體代謝的第一站，常接觸到各種外源性物質(zhì)，在代謝解毒的過程中易會(huì)受到中間代謝產(chǎn)物的氧化損傷。研究表明，一些常見的肝臟疾病如肝硬化、肝炎、肝癌、非酒精性脂肪肝均和氧化應(yīng)激有關(guān)[7～9]。人體內(nèi)大部分的氧參與了線粒體內(nèi)氧化呼吸鏈ATP的生成，以供人體生命活動(dòng)的耗能，但同時(shí)也產(chǎn)生了有害的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)。ROS作為氧代謝過程的中間產(chǎn)物，它包括自由基、羥基、超氧陰離子等。ROS主要在線粒體上的復(fù)合體I（NADH脫氫酶）和復(fù)合體Ⅲ（Cyt C還原酶）上生成。楊聯(lián)軍等人應(yīng)用H2O2誘導(dǎo)髓核細(xì)胞凋亡，并測(cè)量其中ROS及線粒體膜電位水平，發(fā)現(xiàn)ROS增加，同時(shí)線粒體膜電位降低[10]，高濃度的ROS會(huì)影響線粒體膜上的蛋白質(zhì)及心磷脂，也會(huì)損傷線粒體DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）[11]，導(dǎo)致線粒體功能紊亂，加速線粒體破裂，釋放更多的ROS，造成了惡性循環(huán)。面對(duì)ROS損害時(shí)，人體為維持內(nèi)在環(huán)境的穩(wěn)定，能形成了一系列復(fù)雜的氧化應(yīng)激應(yīng)答系統(tǒng)，生成一些保護(hù)性物質(zhì)，以減少細(xì)胞所受的損害。其中存在著一些抗氧化的酶，包括超氧化物歧化酶和過氧化物酶等，正因?yàn)橛兄@些酶的存在，ROS才不會(huì)多度集聚造成損傷[12]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，不同濃度的ROS對(duì)細(xì)胞的作用不同，微摩爾水平的活性氧便可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而維持人體正常生理需求的活性氧僅在納摩爾[13]。但當(dāng)ROS濃度超過機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)能力時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡甚至壞死。研究顯示，肝衰竭時(shí)肝臟氧化應(yīng)激狀態(tài)明顯，當(dāng)肝衰竭出現(xiàn)肝性腦病并發(fā)癥時(shí)，血氨升高引發(fā)線粒體出現(xiàn)膜通透性轉(zhuǎn)換，且伴有氧化磷酸化的障礙，繼而出現(xiàn)ROS升高[14]，說明肝性腦病會(huì)進(jìn)一步加重肝臟的損傷。

3　N rf2的相關(guān)信號(hào)通路

3.1Nrf2/ARE信號(hào)通路Nrf2是轉(zhuǎn)錄因子Cap′-n′-Collar (CNC)家族的一員，是一個(gè)分子量為66kD，含有605個(gè)氨基酸，具有6個(gè)高度保守結(jié)構(gòu)域的堿性亮氨酸拉鏈（Basic region-leucinezipper，bZIP）結(jié)構(gòu)，這6個(gè)功能區(qū)域分別是Neh1-Neh6[15]。位于Nehl區(qū)上的bZIP能與小Maf蛋白相結(jié)合并形成異二聚體，使C端的DNA結(jié)合域與抗氧化反應(yīng)元件(Antioxidant reactive element，ARE)上DNA相結(jié)合[16]，以啟動(dòng)下游基因。Neh2的N端含有賴氨酸殘基，可與Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1（Kelch-like ECH2 associated protein 1，Keap1）結(jié)合，使得Nrf2泛素化并降解，起到負(fù)向調(diào)節(jié)的作用[17]。C端的Neh3可綁定chromo-ATPase/helicase DNA結(jié)合蛋白的家族成員CHD6上，促進(jìn)ARE相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[18]。Neh4和Neh5共同綁定到環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）上，轉(zhuǎn)錄激活Nrf2靶基因[19]。Neh6是氧化還原非敏感區(qū)，通過非Keap1-依賴途徑調(diào)節(jié)Nrf2的降解[20,21]。Keap1是一個(gè)與胞漿肌動(dòng)蛋白相結(jié)合的多肽，由5個(gè)結(jié)構(gòu)域NTR、CTR、BTB、DGR、IV組成[22]。ARE是一段位于Ⅱ相解毒酶、抗氧化酶等保護(hù)性基因上游的啟動(dòng)序列，其核心序列5’-TGACnnnGC -3’可被許多氧化性和親電子物質(zhì)轉(zhuǎn)錄活化。

Nrf2的激活途徑有多種，但現(xiàn)較為常見并被普遍認(rèn)可的途徑是生理性激活。正常情況下Nrf2存在于細(xì)胞質(zhì)中，并通過Neh2與Keap1結(jié)合錨釘在肌動(dòng)蛋白組成的細(xì)胞骨架上，此時(shí)在E3泛素連接酶作用下，Nrf2泛素化并失去活性。當(dāng)受到ROS或是其他因素刺激下，Keap1的半胱氨酸殘基被?修飾并致Keap1上的DGR發(fā)生構(gòu)象改變，導(dǎo)致Nrf2磷酸化，Nrf2上的DLG和ETGE與Keap1發(fā)生解離[23～25]，Nrf2轉(zhuǎn)位到了細(xì)胞核內(nèi)，Nrf2的Neh1可與小Maf蛋白相結(jié)合并作用于ARE上的GCTGAGTCA位點(diǎn)，啟動(dòng)下游Ⅱ相解毒酶、抗氧化酶等基因的轉(zhuǎn)錄。Nrf2激活A(yù)RE并啟動(dòng)下游基因的這一過程即為Nrf2/ARE信號(hào)通路[26]。Nrf2/ARE下游的基因多為保護(hù)性基因，其編碼多種抗炎、抗氧化蛋白/肽類，如血紅素單加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）、醌氧化還原酶（NADPH：quinine oxidoreductase-1，NQO-1）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（Glutathione-S-transferase，γ-GST）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽（glutathion，GSH）等，這些蛋白和酶能滅活內(nèi)源性ROS，預(yù)防ROS濃度過高引發(fā)的應(yīng)激損傷[27,28]。以前人們以為Nrf2的激活劑只在細(xì)胞質(zhì)中作用，但現(xiàn)在有研究發(fā)現(xiàn)5，6-二氫環(huán)戊烯并1，2-二硫雜環(huán)戊烯-3-硫酮和蘿卜硫素等Ⅱ相解毒酶誘導(dǎo)劑能通過細(xì)胞核途徑，減少Nrf2的降解從而提高Nrf2的活性[29]。Nrf2及Keap1是細(xì)胞氧化應(yīng)激的中樞調(diào)節(jié)者，現(xiàn)今人類發(fā)現(xiàn)的最重要的內(nèi)源性抗氧化通路即為Nrf2/ARE通路。

除了抗氧化劑、抗炎等功能，Nrf2還有促進(jìn)細(xì)胞再生的功能，有人將正常野生鼠和Nrf2基因敲除的老鼠均切除部分肝臟，發(fā)現(xiàn)切除肝臟60小時(shí)后，大多數(shù)Nrf2基因缺失的小鼠的肝臟體積減少，激活了肝細(xì)胞表面標(biāo)記物（CD133、TWEAK受體等），使得肝細(xì)胞核因子HNF4a蛋白質(zhì)耗竭，肝細(xì)胞再生受限。因此Nrf2參與維護(hù)再生肝細(xì)胞完全分化狀態(tài)，確保肝細(xì)胞再生[30]。

3.2PERK/Nrf2途徑蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(Protein kinase R-like ER kinase，PERK)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的I型跨膜蛋白，屬于真核起始因子2a（Eukaryotic initiation factor-2a，elF2a）家族，靜息時(shí)與伴侶蛋白BiP呈結(jié)合狀態(tài)而失活，解離后的PERK激活并磷酸化[31]，磷酸化的elF2a可抑制大部分蛋白質(zhì)的合成，但當(dāng)這種磷酸化持續(xù)存在時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。Nrf2則位于PERK下游并可受到PERK調(diào)控。實(shí)驗(yàn)證明，PERK可激活Nrf2，誘導(dǎo)下游HO-1和NQO-1的表達(dá)，從而發(fā)揮生物學(xué)效能[32]。但陶天琪等用缺氧/復(fù)氧方法誘導(dǎo)的小鼠心肌細(xì)胞凋亡，并用腺病毒構(gòu)建了含有MR-1的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，同時(shí)又分出了一個(gè)MR-1敲低組，測(cè)細(xì)胞凋亡數(shù)、Nrf2核轉(zhuǎn)位情況、CHOP、ATF4的表達(dá)指標(biāo)等，發(fā)現(xiàn)MR-1過表達(dá)組細(xì)胞凋亡明顯較其他組輕，且CHPO、Nrf2、ATF4的表達(dá)也受到了抑制，說明PERK/Nrf2途徑是通過上調(diào)ATF4的表達(dá)反向激活了ERS，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡，而MR-1可抑制這一途徑，起到了抗凋亡的作用[33]。PERK/Nrf2途徑現(xiàn)在人們還在研究當(dāng)中，具體在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮的作用仍待商榷。

4　N rf2的激動(dòng)劑與抑制劑

基于Nrf2在機(jī)體中抗氧化、抗炎、抗腫瘤等重要作用，對(duì)Nrf2的激動(dòng)劑與抑制劑的研究有著極其重要的臨床意義。Nrf2激動(dòng)劑就現(xiàn)在人們發(fā)現(xiàn)和合成的就有10多類，這些物質(zhì)有些已經(jīng)被人類研究合成一些藥物，應(yīng)用到各個(gè)領(lǐng)域。對(duì)乙酰氨基酚可導(dǎo)致肝損傷，就有人研究發(fā)現(xiàn)乙酰氨基酚可激活Nrf2/ARE通路[34]，其機(jī)制尚未完全清楚，可能與氧化應(yīng)激后機(jī)體代償機(jī)制有關(guān)，以減輕乙酰氨基酚對(duì)機(jī)體的損傷?，F(xiàn)一些天然或者合成的化合物如奧替普拉、CDDO-IM（人工合成的三萜化合物）、乙氧喹等均可激活Nrf2，誘導(dǎo)抗氧化功能，以起到解毒的功效。還有一些我們常見的抗氧化劑，如叔丁基對(duì)苯二酚（Tertiary butylhydroquinone，tBHQ）可以解離Nrf2和Keap1，穩(wěn)定核轉(zhuǎn)移的Nrf2活性，使caspase-3表達(dá)受限，從而起到抗氧化應(yīng)激的功能[35]。曹旭等在研究1-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP+）誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中，Nrf2激動(dòng)劑萊菔硫烷（Sulforaphane，SFP）對(duì)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)Nrf2活化劑SFP能抑制MPP+對(duì)PC12細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，其機(jī)制是通過PI3K/Akt通路實(shí)現(xiàn)的[36]。中醫(yī)研究發(fā)現(xiàn)，一些中藥成分也可以通過激活Nrf2發(fā)揮抗凋亡作用，甲嘎松湯[37]、黃芩素[38]、姜黃素[39]均證實(shí)可通過Keap1-Nrf2-ARE途徑促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)位，降低肝細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平，從而減輕肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，減少肝毒性。

對(duì)Nrf2的抑制劑人們研究的較少，對(duì)Nrf2/ARE起負(fù)向調(diào)節(jié)的物質(zhì)均可以對(duì)Nrf2的活化起到抑制的作用。Keap1在負(fù)向調(diào)節(jié)Nrf2中有著重要的地位，其不但可以結(jié)合Nrf2，并且還能介導(dǎo)Nrf2泛素化降解。因此可以穩(wěn)定Keap1結(jié)構(gòu)或是抑制Keap1/Nrf2解離的物質(zhì)有可能負(fù)向調(diào)節(jié)該途徑。NF-κB是介導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)的核因子，因其結(jié)構(gòu)與Nrf2相似，可競(jìng)爭(zhēng)性抑制Nrf2的活性[26]。1，4-二氨基-2，3-氰基-1，4-雙[2-氨基苯基硫代]丁二烯[1,4-Diam ino-2,3-dicyano-1,4-bis(o-aminophe-nylmercapto) butadiene，U0126]是ERK信號(hào)通路的一種特異性蛋白激酶阻滯劑，可通過ERK/Nrf2途徑增加細(xì)胞的凋亡能[40,41]。Nrf2可以預(yù)防腫瘤的生長(zhǎng)，是因?yàn)镹rf2可以抵御致癌因素的作用。但同時(shí)有研究證明，在腫瘤細(xì)胞中，Nrf2是高表達(dá)的，一方面促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增長(zhǎng)，同時(shí)也提高了腫瘤細(xì)胞的耐藥性[42]。肝癌是一種對(duì)放化療均不敏感的癌癥，因此肝癌的治療較為困難，生存率也相對(duì)較低，肝癌的抗藥性是否也與Nrf2有關(guān)，現(xiàn)在還未可知。因此人們也在積極尋找可抑制Nrf2活化的物質(zhì)，希望在癌癥治療中能有新的突破。

5　小結(jié)與展望

Nrf2自從發(fā)現(xiàn)以來，抗氧化應(yīng)激中的作用越來越被人類所了解，由于其表達(dá)的廣泛性，在許多器官和組織中都發(fā)揮著重要的作用。氧化應(yīng)激是引起人類多種疾病的因素，如衰老、動(dòng)脈粥樣硬化、先兆子癇、癌癥、慢性肝炎等均有密切關(guān)系。這就使得如何減輕ROS損害成為現(xiàn)在多學(xué)科研究的熱點(diǎn)。肝臟作為人體重要的器官，承擔(dān)著解毒、合成、免疫等作用，所以，肝臟也最易受到外界刺激，出現(xiàn)慢性肝炎、肝壞死、肝癌等情況。多項(xiàng)研究證明，Nrf2可以減輕炎癥、預(yù)防癌癥的發(fā)生、減少細(xì)胞的凋亡，因此研究Nrf2可以積極指導(dǎo)臨床，對(duì)肝臟疾病及其其他系統(tǒng)疾病的治療提供新思路。

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（收稿：2015-10-20）

（本文編輯：李磊）

Role of Nrf2 in the regulation of hepatocyte apoptosis

Cui Dan，Yang Baoshan.Department of Infectious Disease,2nd Affiliated Hospital,Harbin Medical University,Harbin 150086,Heilongjiang Province,China

10.3969/j.issn.1672-5069.2016.03.000

150086哈爾濱市哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院感染病科

崔丹，女，29歲，碩士研究生。主要從事肝細(xì)胞凋亡及肝衰竭防治研究。E-mail：jc2007cd@sina.com

楊寶山，E-mail：baoshanyang@126.com