人參抗菌蛋白的研究進(jìn)展＊

王佳雯，劉美辰，張麗軒，趙大慶，趙 雨

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程研究開(kāi)發(fā)中心 長(zhǎng)春 130117）

人參抗菌蛋白的研究進(jìn)展＊

王佳雯，劉美辰，張麗軒，趙大慶，趙 雨＊＊

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程研究開(kāi)發(fā)中心 長(zhǎng)春 130117）

人參是馳名中外的名貴中藥材，具有較高的藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。人參病害成為人參應(yīng)用的主要制約因素?，F(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展為人參抗病研究提供了新的手段。目前已發(fā)現(xiàn)的人參抗菌蛋白有脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、親環(huán)素、防御素以及PR-4和PR-10等，對(duì)人參多種致病菌均有抑制作用，為人參病害防治提供了有價(jià)值的參考。

人參 人參病害 抗菌蛋白

人參是五加科植物人參Panax ginseng C.A. Mey的干燥根和根莖，被譽(yù)為“百草之王”，被廣泛用于中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)（中醫(yī)）和西方草藥制劑，是世界上應(yīng)用范圍最廣、使用人口最多的中藥材。吉林省是中國(guó)人參的重要產(chǎn)地，人參的病害會(huì)直接影響人參的產(chǎn)量與品質(zhì)。從1985年開(kāi)始，科研人員開(kāi)始著手開(kāi)展人參病害的調(diào)查工作。目前，已被報(bào)道的人參病原菌主要有：銹腐病菌、惡疫霉、鐮孢菌、人參鏈格孢、核盤(pán)菌、火疫霉、立枯絲核菌和腐霉；而己有記載的人參病害有40余種，其中，在中國(guó)發(fā)現(xiàn)的人參病害數(shù)量至少在25種以上。人參的常見(jiàn)病害根據(jù)發(fā)病部位可分為地上部病害、表土中病害和地下部病害。其中，地上部病害主要有黑斑病、灰霉病、疫病、炭疽病、白粉病等；表土中病害主要有猝倒病、立枯病、莖腐病等；地下部病害主要有菌核病、銹腐病、根腐病、紅皮病、疫病等。如果由于田間管理不當(dāng)，造成大片人參出現(xiàn)染病與死亡，這會(huì)直接導(dǎo)致參農(nóng)的經(jīng)濟(jì)損失與人參的產(chǎn)量。隨著對(duì)基因組學(xué)及生物信息學(xué)的研究不斷深入，數(shù)據(jù)庫(kù)的信息不斷更新完善，植物抗病蛋白質(zhì)研究成為大家關(guān)注的焦點(diǎn)。

植物在與外來(lái)病原菌的不斷斗爭(zhēng)中，進(jìn)化出了一系列蛋白和多肽來(lái)防御寄生蟲(chóng)和病原菌，完善自身防御體系。這些蛋白和多肽統(tǒng)稱為抗菌肽，迄今為止已經(jīng)從植物中發(fā)現(xiàn)了多種抗菌蛋白[1]。其抗菌機(jī)制為在靶細(xì)胞膜上形成離子通道，使細(xì)胞膜兩側(cè)的膜電位發(fā)生改變，靶細(xì)胞因滲透壓改變，水溶性物質(zhì)滲出而死亡[2]。根據(jù)氨基酸序列的同源性，抗菌肽主要分為防御素、硫堇、脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白、親環(huán)素、蛻皮素、類(lèi)橡膠蛋白、過(guò)敏多肽、幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶和過(guò)氧化物酶等家族[3]。隨著對(duì)抗菌肽結(jié)構(gòu)、活性、作用機(jī)制認(rèn)識(shí)的不斷深化，人們對(duì)抗菌肽的關(guān)注也越來(lái)越多，如何更好的應(yīng)用抗菌肽尚需要更深入的研究。

1 人參LTP蛋白

植物脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Lipid Transfer Protein，LTP）是一類(lèi)堿性（pH=8.5-12）分泌型蛋白，分子量通常小于10 kDa，占植物可溶性總蛋白的4%左右[4]。該蛋白耐高溫，相對(duì)化學(xué)變性、酶的消化也很穩(wěn)定，在4℃條件下可存放數(shù)月。其穩(wěn)定特性與LTP高度保守的結(jié)構(gòu)有關(guān)：8 個(gè)半胱氨酸殘基（8CM）（C-Xn-C-Xn-CC-Xn-CXC-Xn-C-Xn-C）和2 個(gè)保守的五肽 （Thr/Ser-X1-X2-Asp-Arg/lys和Pro-Tyr- X-Ile-Ser）[5]，由4個(gè)二硫鍵連接8個(gè)保守的半胱氨酸以穩(wěn)定疏水腔的三級(jí)結(jié)構(gòu)，疏水腔貫穿整個(gè)分子，并能在體外與多種疏水分子可逆性地結(jié)合，如轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸、糖脂、乙酰輔酶A、類(lèi)固醇及角質(zhì)單體等。絕大多數(shù)植物L(fēng)TP在N端都具有一個(gè)由 21-29個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，能夠穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入分泌途徑，分泌后定位在細(xì)胞壁[6]。

植物L(fēng)TP廣泛分布于植物的組織和細(xì)胞中，迄今為止，已經(jīng)從數(shù)十種植物中分離純化得到了LTP基因，例如洋蔥[7]、小麥[8]、辣椒[9]、咖啡[10]和擬南芥[11]等。許多研究表明，LTP在植物的生理活動(dòng)中具有重要的作用，顯示出顯著的抑菌功能[6，12]。

人參LTP基因包含363個(gè)堿基，編碼120個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為12.09 kDa，理論等電點(diǎn)為8.63。人參LTP的氨基酸序列與向日葵、珙桐和棉花LTP的氨基酸序列相似度分別為54.2%、54.2%和54.1%。人參LTP含有8個(gè)保守的半胱氨酸，結(jié)構(gòu)域模式為 C1-Xn-C2-Xn-C3C4-Xn-C5XC6-Xn-C7-Xn-C8。蛋白二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，人參LTP具有LTP典型的結(jié)構(gòu)，包括4個(gè)α-螺旋、4對(duì)二硫鍵、1個(gè)可結(jié)合和容納脂質(zhì)分子的疏水腔。構(gòu)建人參LTP的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果顯示，人參LTP與蓮屬、椰子、咖啡和洋蔥LTP序列同源性相對(duì)較高，屬于I類(lèi)LTP家族。使用在線軟件Signalp- 4.1Signalp analysis 對(duì)LTP進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示，人參LTP的N端22個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列，后98個(gè)氨基酸為成熟肽。將人參LTP的cDNA插入到原核表達(dá)載體pGEX-6P1中，并使用IPTG誘導(dǎo)宿主菌，可發(fā)現(xiàn)人參LTP重組蛋白表達(dá)。通過(guò)親和純化方法進(jìn)行包涵體純化及復(fù)制，得到可溶的人參LTP蛋白。分別對(duì)人參的7種常見(jiàn)土傳病真菌進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)研究，結(jié)果表明，人參脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在2.41 μM 和 7.23 μM的濃度下，對(duì)7種真菌菌絲的生長(zhǎng)具有不同的抑制作用，形成抑菌圈。根據(jù)抑菌圈的大小可知，對(duì)菌核病、疫病、立枯病抑制作用較強(qiáng)，對(duì)根腐和銹病抑制作用相對(duì)較弱，對(duì)灰霉和黑斑無(wú)抑制作用。其中對(duì)菌核抑制作用的IC50值最低，為0.12 μM。SYTOX綠色熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LTP蛋白可以誘導(dǎo)根腐孢子膜通透性發(fā)生改變，SYTOX進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA結(jié)合，觀察到綠色熒光。說(shuō)明人參LTP蛋白的抑菌活性是通過(guò)破壞真菌細(xì)胞膜來(lái)實(shí)現(xiàn)的[13]。

2 人參親環(huán)素蛋白

親環(huán)素是免疫超家族三個(gè)蛋白亞家族中的一個(gè)，它是一類(lèi)高度保守的蛋白，他們中大多數(shù)都具有肽基脯氨酰基順?lè)串悩?gòu)酶或者旋轉(zhuǎn)酶活性[14]。親環(huán)素除了能夠催化多肽和蛋白分子間酰胺鍵順?lè)串悩?gòu)化，還具有促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊、影響細(xì)胞間相互作用的能力[15]。目前已有報(bào)道表明，親環(huán)素參與多種細(xì)胞功能活動(dòng)，包括細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、大分子運(yùn)輸、細(xì)胞周期控制和應(yīng)激反應(yīng)[16]。

在植物中親環(huán)素基因研究始于1990年，首次從番茄、玉米及油菜植物中提取分離得到其cDNA[17]，在后來(lái)的研究中發(fā)現(xiàn)親環(huán)素基因在植物分生組織中高水平表達(dá)，并且它在植物抗脅迫及抗病蟲(chóng)害侵染中發(fā)揮重要作用。有關(guān)親環(huán)素抗真菌活性的研究已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，從黑眼豌豆、綠豆和鷹嘴豆分離純化的親環(huán)素蛋白都具有抗真菌作用[18]。

人參親環(huán)素基因的開(kāi)放式閱讀框包含522個(gè)堿基，編碼172個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)等電點(diǎn)為 7.67，理論分子量為19.14 kDa。人參親環(huán)素具有一個(gè)典型的PPIase區(qū)、兩個(gè)保守的半胱氨酸殘基（分別位于40位和168位）和一個(gè)保守的谷氨酸（83位）殘基。經(jīng)軟件預(yù)測(cè)，人參親環(huán)素蛋白包括6.32%的α-螺旋、21.26%的β-片層和72.42%的無(wú)規(guī)卷曲。人參親環(huán)素在氨基酸結(jié)構(gòu)上與棗親環(huán)素的相似度最高，高達(dá)90%，在進(jìn)化樹(shù)的位置也最為接近。構(gòu)建人參親環(huán)素的原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6p-1-CyP并轉(zhuǎn)化宿主菌，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)及包涵體純化獲得體外重組人參親環(huán)素蛋白。抑菌圈實(shí)驗(yàn)及半數(shù)抑制率實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明該蛋白對(duì)人參疫霉菌菌絲的生長(zhǎng)具有較強(qiáng)的抑制作用，IC50值為2.55 μM（圖3）。然而，與白菜親環(huán)素蛋白相比[19]，人參親環(huán)素蛋白的抗菌譜較窄，這可能與其氨基酸序列有關(guān)。同時(shí)，人參親環(huán)素蛋白與其他親環(huán)素蛋白一樣，也具有肽脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶活性[20]。這些結(jié)果說(shuō)明重組人參親環(huán)素蛋白有可能作為一種生物農(nóng)藥進(jìn)行人參疫病的防治。

3 人參Defensin蛋白

植物Defensins是一類(lèi)富含半胱氨酸的小分子（由45-54個(gè)氨基酸殘基組成）堿性蛋白，被認(rèn)為與宿主防御真菌病原體相關(guān)。植物Defensins在蛋白質(zhì)一級(jí)序列上非常多變，唯一的保守性是都具有8個(gè)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的半胱氨酸殘基。它們不會(huì)在人工膜上形成離子滲透孔，但是能夠作用于特定的膜結(jié)合受體上，并引起Ca2+內(nèi)流和K+外流，從而抑制真菌生長(zhǎng)。同時(shí)，Defensin只能作用于新生菌絲，對(duì)于休眠孢子沒(méi)有抑制能力，說(shuō)明Defensin受體僅出現(xiàn)在真菌生命周期的較早期階段[21-23]。

人參 Defensin 基因的開(kāi)放式閱讀框包含 240個(gè)堿基，編碼80個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子量為 12.09 kDa。構(gòu)建重組表達(dá)載體pCAMBIA1303-Defensin，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)浸花法將人參Defensin 基因轉(zhuǎn)入到擬南芥中，經(jīng)過(guò)抗性篩選及分子鑒定獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥。以野生型擬南芥做對(duì)照，分析植株對(duì)銹病菌的抗性作用。結(jié)果表明，經(jīng)銹病菌脅迫5天，轉(zhuǎn)基因擬南芥的生長(zhǎng)狀態(tài)明顯優(yōu)于野生型擬南芥，Defensin基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)量極顯著高于野生型對(duì)照。說(shuō)明人參Defensin對(duì)人參銹病菌具有一定的抑制作用[24]。為未來(lái)進(jìn)一步研究人參Defensin的抗病機(jī)理提供了基礎(chǔ)。同時(shí)，人參Defensin蛋白的原核表達(dá)純化以及抑菌分析也在進(jìn)行中。

4 人參病程相關(guān)蛋白-4/10（PR-4/10）

PR-4蛋白是一種幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白，分子量范圍為13-14.5 kDa，并分為兩類(lèi)。PR-4蛋白已經(jīng)從包括辣椒、玉米、石榴等多種植物中被分離出來(lái)[25-28]。I類(lèi)和II類(lèi)PR-4蛋白都具有較強(qiáng)的廣譜抗真菌活性。人參PR-4的cDNA首次從人參葉片中分離出來(lái)。它具有513個(gè)堿基的開(kāi)放閱讀框，編碼170個(gè)氨基酸。人參PR-4與歐洲接骨木PR-4在氨基酸水平的同源性較高，為72%，屬于II類(lèi)PR-4。人參PR-4在根中的表達(dá)量較高，當(dāng)遇到病原體入侵、高鹽、創(chuàng)傷和激素壓力時(shí)，其表達(dá)量會(huì)上調(diào)[29]。未來(lái)可通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將其轉(zhuǎn)至擬南芥中，進(jìn)一步分析人參PR-4在植物生長(zhǎng)及脅迫過(guò)程中的作用。

PR-10廣泛存在于單子葉和雙子葉植物中[30]。一些物種的PR-10具有多個(gè)同源物，其晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解析出來(lái)[31-33]。PR-10能夠被植物激素、生物壓力如真菌和細(xì)菌感染、非生物壓力如高鹽和低溫等因素調(diào)控。人參PR-10首次報(bào)道于1997年，被認(rèn)為具有核糖核酸酶活性[34]。人參PR-10具有4個(gè)亞型，即PR-10-1、PR-10-2、PR-10-3、PR-10-4。PR-10各個(gè)亞型在所有組織中均有表達(dá)但略有不同，其中PR-10-1在人參花中高表達(dá)，PR-10-2在人參根中高表達(dá)，PR-10-3和PR-10-4在人參葉片中高表達(dá)[35-38]。當(dāng)存在生物脅迫或非生物脅迫時(shí)，人參PR-10的表達(dá)量均會(huì)上調(diào)。在擬南芥中過(guò)表達(dá)人參PR-10可導(dǎo)致植物根變長(zhǎng)并且呈現(xiàn)耐鹽表型，增加對(duì)假單胞菌、尖孢鐮刀菌和灰霉菌等真菌的抗性。人參PR-10的4種亞型在各部位的表達(dá)水平不同，是否說(shuō)明這4種亞型在人參組織發(fā)育過(guò)程中所起作用不同尚需進(jìn)一步研究。同時(shí)，由于氨基酸序列的差異性，以上4種亞型在抵抗真菌侵染時(shí)的能力是否有所不同也是未來(lái)研究的方向。

5 三七抗真菌蛋白

三七與人參同為五加科的藥用植物，針對(duì)三七抗真菌蛋白的研究目前也有了一些進(jìn)展。三七PR-10-1基因全長(zhǎng)863 bp，包含一個(gè)長(zhǎng)465 bp編碼155個(gè)氨基酸的開(kāi)放閱讀框。三七PR-10-1蛋白與人參的PR10-1同源性最高，含有Bet-v-I家族等多個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。三七PR-10-1蛋白在1-3年生三七各組織中均有本底表達(dá)，暗示其參與生長(zhǎng)發(fā)育、代謝調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程；PnPR10-1在根部受根腐病原菌脅迫上調(diào)表達(dá)，推測(cè)三七PR10-1基因可能參與抗三七根腐病等廣譜抗病防御反應(yīng)[39]。

三七PR-1基因序列長(zhǎng)501 bp，編碼166個(gè)氨基酸，與葡萄、煙草、番茄等高等植物中的PR1蛋白同源性較高。目前已經(jīng)通過(guò)異源重組和蛋白表達(dá)純化的方法獲得了重組三七PR-1蛋白，為驗(yàn)證體外生物活性以及后期培育三七抗病品種提供了參考[40]。

6 總結(jié)

人參是中國(guó)名貴藥材，享譽(yù)國(guó)際。人參的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，但是由于較長(zhǎng)的生長(zhǎng)周期，陰濕的生長(zhǎng)環(huán)境，人參在整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中常受病蟲(chóng)侵害，造成非常大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，防治病蟲(chóng)害主要使用化學(xué)藥品控制，一方面容易使病原體產(chǎn)生耐藥性，另一方面農(nóng)藥殘留也會(huì)降低人參的品質(zhì)。因此，解決人參病害的問(wèn)題，尋找新型的抗菌制劑，研究人參自身的抗病機(jī)制及相關(guān)蛋白是非常重要的。從人參本身入手，挖掘抗性相關(guān)基因，培育新的抗病品種，使用重組人參蛋白作為生物農(nóng)藥來(lái)緩解人參的病蟲(chóng)害問(wèn)題成為了新的技術(shù)手段和途徑。隨著對(duì)人參蛋白研究的深入，將會(huì)有更多的人參抗菌蛋白被發(fā)現(xiàn)并投入到應(yīng)用中來(lái)。

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A Research Progress on the Antimicrobial Proteins of Ginseng

Wang Jiawen, Liu Meichen, Zhang Lixuan, Zhao Daqing, Zhao Yu
(Traditional Chinese Medicine and Biotechnology Research and Development Center, Changchun University of Traditional Chinese Medicine, Changchun 130117, China)

Panax ginseng is a precious medicinal herb both in China and abroad with high medicinal and economic value. Ginseng disease has been recognized as the main factor restricting its application. Modern molecular biology for the disease resistance of ginseng promoted the development of new methods. In this study, it was found that the antimicrobial proteins of ginseng involved lipid transfer protein, cyclophilin, defensins, PR-4 and PR-10, showing inhibitory effects on various pathogens. These findings provided a reference for the control of ginseng diseases.

Ginseng, ginseng disease, antimicrobial protein

10.11842/wst.2016.11.020

R931.2

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-11-07

修回日期：2016-11-20

＊ 吉林省省級(jí)經(jīng)濟(jì)結(jié)構(gòu)戰(zhàn)略調(diào)整引導(dǎo)資金專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目（2014N155）吉林省中藥組學(xué)工程實(shí)驗(yàn)室，負(fù)責(zé)人：趙雨。

＊＊ 通訊作者：趙雨，研究員，主要研究方向：中藥有效成分應(yīng)用與開(kāi)發(fā)研究。