血清S100B蛋白的檢測方法綜述

劉仲仲　段康麗綜述，吳松笛審校

（西安市第一醫(yī)院神經內科，陜西西安710002）

·綜述·

血清S100B蛋白的檢測方法綜述

劉仲仲段康麗綜述，吳松笛審校

（西安市第一醫(yī)院神經內科，陜西西安710002）

S100B蛋白是一種小分子鈣結合蛋白，約96%表達于腦內膠質細胞中。血清中S100B蛋白濃度較低，但在一些腦損傷所導致的病理狀態(tài)下則可透過血腦屏障而急性升高，并且其升高的程度與神經系統(tǒng)疾病的病情及預后具有密切關系，被認為是腦的特異性蛋白。因此，準確、方便且快捷的S100B檢測方法對臨床和科研工作尤為重要。本文根據近年來的相關文獻，對S100B蛋白現(xiàn)有的檢測方法及對比研究進行綜述。

S100B蛋白；檢測方法

1　生物學特性

1965年Moore等［1］首次在牛腦組織中分離發(fā)現(xiàn)了S100蛋白，因其在中性飽和硫酸銨溶液中100%溶解而命名。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，S100蛋白是一類具特殊EF-hand型結構的相對分子量較小的酸性鈣結合蛋白，該家族現(xiàn)有24個成員 （包括S100A1-S100A16、S100B、S100P、S100Z等），廣泛分布于不同組織［2-4］。多數S100蛋白以二聚體的形成存在，也能形成三聚體、四聚體等，主要依賴疏水作用力聚合，人的S100蛋白編碼基因主要定位在染色體lq21上。

S100B蛋白（以前曾稱為S100β蛋白）是由兩個β亞單位通過半胱氨酸殘基形成的二硫鍵組成，是S100家族中在腦內主要的和最具有活性的成員。約96%的S100B蛋白存在于腦內膠質細胞中，因此也被認為是腦的特異性蛋白。S100B蛋白有廣泛的生物學活性，生理濃度下發(fā)揮多種重要的生理學功能，包括影響神經膠質細胞的生長、繁殖和分化，維持鈣穩(wěn)態(tài)，并可能對學習記憶等發(fā)揮一定的作用等［2，5］。正常人血清S100B蛋白含量＜0.2μg/L，通常難于測定。腦損傷時造成神經膠質細胞膜受損，S100B蛋白釋放至細胞外間隙，并通過受損血腦屏障進入腦脊液和血液［6］。S100B蛋白表達過量時，具有神經毒作用，使神經系統(tǒng)炎癥惡化加速，導致神經系統(tǒng)功能紊亂，影響鈣自動調節(jié)動態(tài)平衡，導致細胞死亡［2，5］。

隨著對S100B蛋白研究的深入，其血清中的含量與一些神經系統(tǒng)等疾病的病情及預后關系密切［7，8］。因此，在目前的臨床和科研領域，對于S100B蛋白準確、方便且快捷的檢測方法尤為重要。

2　S100B血清學檢測方法

隨著方法學的不斷發(fā)展，在S100B的檢測方法上也有了明顯的改善，當前，S100B的檢測方法主要有：放射免疫分析法（RIA）、免疫放射測定法（IRMA）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、電化學發(fā)光法（ECLIA）以及電化學檢測法（Electrochemical assay）和磁珠量子點檢測法（MB-QD）等［9，10］。方法總結如下：

2.1放射免疫分析法（Radioimmunoassay，RIA）放射免疫分析法（RIA）又稱競爭性飽和分析法，是利用同位素標記與未標記的抗原同抗體發(fā)生競爭性抑制反應的放射性同位素體外微量分析方法。該法的檢測極限可達到ng～pg級，組內和組間變異系數分別約為5%和10%。Gazzolo D等［11］利用RIA法檢測胎兒宮內發(fā)育遲緩（IUGR）癥狀的孕婦臍帶血樣中S100B的含量變化，并與正常組比較，發(fā)現(xiàn)IUGR臍帶血中S100B蛋白的含量明顯高于正常對照組，預示圍產期胎兒腦細胞可能受到損傷。雖然該方法已成為一些基礎學科和臨床醫(yī)學進行實驗和診斷的重要檢驗手段。然而，經長期的臨床和實踐檢測以及非放免分析法的不斷發(fā)展，發(fā)現(xiàn)該方法存在以下不足：⑴該方法只能檢測具有免疫反應性的物質，對于失去免疫反應性的物質則無法檢測。⑵實驗條件要求嚴格，生物試劑的穩(wěn)定性受多種因素影響。⑶由于被測物和標準物都不能全部參與反應，測得的值是相對量而非絕對量。⑷該法存在放射線輻射和污染等問題。目前在檢測中已較少使用。

2.2免疫放射測定法 （Immunoradiometric assay，IRMA）又被稱為“非競爭性RIA”，為了與放射免疫分析法區(qū)分，故稱為免疫放射測定法（IRMA）。是采用過量的標記抗體去結合所有抗原，經吸附除去游離的標記抗體，測定反應中剩余的放射性強度，可以反映出待測抗原的量。Nygaard O等［12］應用IRMA原理，檢測血清或腦脊液中S100B含量，其靈敏度為0.13μg/L，高值和低值CV分別為5%和10%。Heizmann CW［13］等采用IRMA實驗研究發(fā)現(xiàn)該法檢測S100B的特異性很強，線性范圍為0～20μg/L，用來檢測人體體液中S100B結果是明確且可靠的。相比于放射免疫分析法（RIA），雖然免疫放射法IRMA具有一定的優(yōu)勢，但也存在以下缺點：⑴由于放射性同位素有衰變的因素，就使得每次試驗時，標記抗原或抗體必須同時作標準曲線，這樣在短時間內發(fā)出報告就比較困難；⑵由于放射性同位素不可避免地污染環(huán)境，使用過程中要具有一定的防護設施。使得該方法也漸漸淡出血清中S100B蛋白含量的檢測。

2.3酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是以免疫學反應為基礎，將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合起來的一種敏感性很高的試驗技術。目前，國內外對于ELISA方法的研究較多。在國外，意大利索靈集團（DiaSorin）、美國亞諾法（Abnova）、美國Fujirebio Diagnostics公司和其子公司CanAg Diagnostics以及歐洲捷克公司BioVendor等生產的血清S100B ELISA檢測較為常用。Dia-Sorin S100 ELISA檢測試劑盒，其檢測標準范圍為0～5μg/ml，檢測極限為0.03μg/ml，批內及批間平均CV分別為3.7%和5.9%。Abnova生產的ELISA檢測試劑盒，其檢測參考值范圍是0.05～2ng/ml，最小檢測值15pg/ml，批內及批間平均差異分別為3.8% 和7.7%?？的烁裨\斷 CanAg S100A1B EIA和CanAg S100BB EIA是到目前為止分別僅用于特異性分析 S100A1B （主要檢測 A1二聚體）和S100BB，檢測范圍0.01～3.5μg/L，檢測極限0.01μg/ L，所需樣本體積為50μl，批內CV＜2.5%，批間CV＜2.5%。Nylen K等［14］人利用三種不同的ELISA方法 （Fujirebio Diagnostics AB，Goteborg，Sweden）研究了S100B，S100A1B，S100BB分別在嚴重創(chuàng)傷性腦損傷的相關性，結果顯示：單獨分析S100A1B或者S100BB與單獨分析S100B相比并沒有優(yōu)勢，說明分析S100B蛋白濃度在疾病的結果預測和后期的預后更具優(yōu)勢。此外，在急性顱內出血患者和糖尿病外圍神經病變患者血清中S100B的檢測用到BioVendor生產的ELISA試劑盒［15，16］，該方法的標準檢測范圍為10～320pg/ml，批內CV=2.0%，批間CV=5.9%，檢測樣本所需體積為25μl/孔。在國內，第四軍醫(yī)大學生理學教研室建立了檢測S100B蛋白的雙抗體夾心ELISA［17］。但此檢測體系中抗S100β mAb可與S100β鏈起反應即與S100A和S100B均可起反應，故不能區(qū)分此兩種蛋白。因此，檢出的S100蛋白應為S100A和S100B的混合物，這是此檢測體系的不足之處。另外，福州總醫(yī)院全軍醫(yī)學檢驗中心也建立了檢測S100B蛋白的雙抗體夾心ELISA法［18］。該法線性范圍廣，靈敏度高，重復性好。血清濃度參考范圍為0.068～0.728μg/L。

總之，ELISA法的優(yōu)點是：線性范圍廣，靈敏度高，重復性好，操作方便，實驗可靠。比較適合用于臨床對于患者疾病的檢測以及預后的判斷，是目前主流的檢測方法之一。

2.4電化學發(fā)光法 （Electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA）是繼放射免疫、酶免疫、熒光免疫、化學發(fā)光免疫測定以后的新一代標記免疫測定技術，是電化學發(fā)光（ECL）和免疫測定相結合的產物。該方法是利用鏈霉親和素包被的磁珠和生物素化的抗體與S100B抗體連接為一體，形成雙抗體夾心，最后通過與抗體偶聯(lián)的發(fā)光劑和電子供體TPA通過氧化還原反應在電極表面周而復始地進行，產生許多光子，光電倍增管檢測光強度，光強度與發(fā)光劑的濃度呈線性關系，故可測出待測抗原的含量。目前，本法對S100B進行檢測主要采用德國羅氏診斷公司ElecsysS100（Roche Diagnostics，Mannheim，Germany）和意大利索靈公司提供的全自動分析儀 Liaison Sangtec100（Dia-Sorin S.P.A.，Saluggia，VC，Italy）及其配套的S100B檢測試劑。Elecsys儀器根據檢測模塊的不同有三種型號：Elecsys 1010，2010和E170，檢測的持續(xù)時間在20min左右，溫度控制37℃，檢測范圍為0.005～2.13μg/L，批間和批內CV＜3%。LiaisionSangtec 100是一種基于化學發(fā)光的全自動的免疫檢測法，批內CV＜6%，批間CV＜10%。檢測范圍為0.02～30μg/L［19］。通過對比Elecsys 1010，2010和E170三種型號，在反應時間、樣品要求以及試劑的體積等上沒有明顯區(qū)別［20］。Yoon SM等［21］利用Elecsys S100 E170模塊系統(tǒng)分析在蛛網膜下腔出血（SAH）和顱內出血（ICH）這兩種疾病血清中S100蛋白的含量，顯示出該方法檢測范圍在0.005～39μg/L，批內的協(xié)同變異系數為 0.7%～1.8%。得出結論：在ICH的病人中血清中S100B的含量認為是一種獨立的病情預后信號，相比之下在SAH疾病中預后不明顯。羅氏診斷Elecsys 2010法在不同分娩模式，急、慢性腦損傷以及急性眩暈等疾?。?2-24］的檢測上也已經得到廣泛應用。

電化學發(fā)光法的優(yōu)點：⑴標記物的再循環(huán)利用，使發(fā)光時間更長、強度更高、易于測定；⑵敏感度高，可達pg/ml水平；⑶線性范圍寬；⑷反應時間短，20min以內可完成測定；⑸試劑穩(wěn)定性好，2～5℃可保持一年以上?？傊?，ECLIA是目前較為常用的檢測方法。

與ELISA法相比其主要優(yōu)勢為其反應動力學較ELISA方法更快，并且具有更大的固相結合表面。分析方法的設計與ELISA方法有很多相似處，但在實驗設計上卻擁有更多的靈活性。該法唯一的不足就是需基于配套的大型儀器來進行檢測，該儀器以及電極的更換價格較貴，導致檢測費用較高，限制了其在基層醫(yī)院的開展。

2.5近年S100B檢測的新方法

2.5.1電化學檢測法（Electrochemical assay）近年由南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院與南京大學生物化學和醫(yī)藥生物技術國家重點實驗室合作建立了一種新的S100B的電化學檢測法［9］。該法是一種不同于傳統(tǒng)利用抗體、抗原相互作用，該法利用肽作為抗體的簡化而且等效的替代品，電化學代替光譜學被用于樣品檢測的一種新方法。檢測極限可達0.1nM，回收率為98.5%～103.7%之間。由于多肽和其他人工合成的配體在蛋白的電化學檢測中的應用已經越來越被人們重視［25，26］，使得該方法也存在自己的優(yōu)勢：多肽代替抗體，可以被合成想要的結構，并可進一步修改后用于檢測蛋白的目標配體［27，28］。

2.5.2磁珠量子點檢測法（Magnetic bead-quantum dot，MB-QD）磁珠（Magnetic bead，MBs）是一種廣泛用于生物醫(yī)學的應用，生物功能化的磁珠常常被用于細胞的分選，生物分離，靶向給藥，免疫測定［29，30］。對于較低濃度的樣品濃度具有很好的捕獲功能。量子點（Quantum dot，QDs）是一種無機的半導體納米粒子，具有廣泛的吸收光譜，很窄的發(fā)射峰，可抵抗光致漂白和高的量子產率等獨特的光學性質。

Kim C等［10］利用表面功能化的量子點與磁珠偶聯(lián)后被用于標記捕獲物，通過抗體與分析物的結合綁定信號轉導探針，從而進行定量的分析。通過這兩種技術的結合研究者建立了一種新的磁珠量子點檢測法（MB-QD），該方法檢測血清中S100B含量具有以下特點：⑴高度特異性的檢測；⑵磁珠的使用可使得實驗快速，樣品的混合和洗滌步驟簡單，縮短實驗時間在1h以內；⑶可迅速偶聯(lián)G蛋白和抗體到QDs，從而確保抗體的穩(wěn)定性與功能性而不需要其他化學試劑和純化步驟；⑷該方法可檢測的臨界值范圍可從10pg/ml～10ng/ml；⑸從MBs復合物上釋放QDs可避免磁珠自體熒光的局限性和磁珠的光散射，從而提高實驗的敏感性。

由于這兩種是近年新建立的S100B檢測方法，雖有明顯的優(yōu)勢，但還缺少更多的臨床檢測研究以及更多文獻的支持和引用，因此還較少有人沿用。

3　常用S100B檢測方法在臨床應用中的比較

S100B蛋白越來越受到醫(yī)學界的關注，該蛋白的檢測方法也得到迅速發(fā)展，一些學者對不同廠家的血清S100B蛋白檢測方法進行了對比研究。

Hallén M 等對比了 Liaison Sangtec100 （DiaSorin S.P.A.，Saluggia，VC，Italy）和ElecsysS100 （Roche Diagnostics，Mannheim，Germany）方法在血清與尿中檢測 S100B的差異。其中，Liaison Sangtec100對于血清S100B的檢測范圍為0.02～2.28μg/L，而ElecsysS100檢測系統(tǒng)的檢測范圍為0.005～2.13μg/L，二者在檢測范圍上存在相關性，相關系數是0.8，兩者均差為0.122μg/L，標準偏差為0.069μg/L；這兩種方法在檢測尿液中S100B時，Liaison Sangtec100檢出率僅為 11.5%，而ElecsysS100檢出率為98.3%，二者無明顯相關性，相關系數為0.6［31］。根據這項研究，在臨床應用中，德國羅氏公司ElecsysS100檢測系統(tǒng)更方便、精確，但對于腦損傷的病人，這兩種方法在檢測尿液和血清中S100B時各有利弊，兩種方法不可互換。

Smit LH等［32］通過選取155例黑色素瘤患者和98例健康對照組，比較了現(xiàn)階段的4種方法，包含兩種全自動法（Liaison Sangtec100和ElecsysS100）和兩種手動方法（Sangtec 100 ELISA和CanAg S100 EIA）在臨床上的參考值和相關性。結果顯示：兩種手動法的功能靈敏度為0.15μg/L。各方法相關系數為0.9，但斜率范圍在0.29～3.36。各方法的線性分析除了Sangtec100 ELISA，其他都是可以接受的。各方法對于黑色素瘤疾病的的總體敏感性從37%（ElecsysS100）到47%（Liaison Sangtec100），并隨著疾病的階段性進展而升高，全自動檢測系統(tǒng)較手動的更為敏感。

2011年Erickson JA等［33］就惡性黑色素瘤和顱腦外傷后的預后結果對三種商業(yè)化的S100B ELISAs檢測方法：CanAgS100 EIA（Fujirebio Diagnostics，AB.，Gothenburg，Sweden），Sangtec100 ELISA（DiaSorin，Inc.，Stillwater，MN），YK150Human S-100B ELISA（Yanaihara Institute，Inc.，Shizuoka，Japan）進行比較分析。得出：Sangtec100 ELISA和CanAgS100B ELISAs方法的配置、程序和性能特征相似，都比YK150的更可信賴。

4　展望

總之，現(xiàn)階段對于血清S100B的檢測方法包括：放射免疫分析法 （RIA）、免疫放射測定法（IRMA）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、電化學發(fā)光法（ECLIA）、電化學檢測法（Electrochemical assay）以及磁珠量子點法（MB-QD）。因為熒光免疫測定法價格較高，不易在基層醫(yī)院普及，RIA與IRMA由于具有放射性，核素半衰期和試劑盒穩(wěn)定期短，操作繁瑣，使之在臨床中應用受到限制。目前臨床上主要采用的是ELISA和ECLIA法，新建立的電化學檢測法（Electrochemical assay）和磁珠量子點檢測法（MB-QD）還缺乏廣泛的臨床應用，后續(xù)有望得到更多關注。

相信隨著對S100B蛋白檢測方法學的不斷改進，更準確、更快速、更方便的檢測方法將會出現(xiàn)，如床旁的快速檢測試紙條等。血清S100B蛋白的檢測將會成為一種有效的工具，有助于臨床醫(yī)師對多種神經系統(tǒng)疾病所致腦損傷進行早期診斷、病情進展評估及預后判斷。

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R446.61

A

1674-1129（2016）04-0461-05

10.3969/j.issn.1674-1129.2016.04.016

陜西省社發(fā)攻關項目（項目編號2012K15-02-02），陜西省自然科學基礎研究計劃項目（項目編號2013JC2-10）。

劉仲仲，男，1984年10月出生，碩士研究生，專業(yè)：微生物學，病原菌，致病機制。

吳松笛，男，1972年11月出生，主任醫(yī)師，主要研究方向：腦損傷蛋白的臨床與基礎；Email：wusongdi@gmail.com。

（2016-03-04；

2016-04-12）