CAR-T 細(xì)胞療法的研究進(jìn)展

陳明月，秦玉花，張 偉，杜鵬強(qiáng)，張亞平

(1.鄭州大學(xué)，河南 鄭州 450003；2.河南省人民醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

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CAR-T 細(xì)胞療法的研究進(jìn)展

陳明月1,2，秦玉花2*，張 偉2，杜鵬強(qiáng)2，張亞平2

(1.鄭州大學(xué)，河南 鄭州 450003；2.河南省人民醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

近年來(lái)，隨著生物技術(shù)研究的進(jìn)展，利用基因工程合成的嵌合抗原受體的 T 細(xì)胞(CAR-T)在血液腫瘤疾病治療方面的療效明顯，成為腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。本文就 CAR-T的治療血液系統(tǒng)腫瘤得試驗(yàn)應(yīng)用及改進(jìn)做一個(gè)簡(jiǎn)要概述，為今后的研究提供參考。

CAR-T；細(xì)胞治療；腫瘤；臨床試驗(yàn)

近年來(lái)，癌癥發(fā)病率呈逐年上升和年輕化趨勢(shì)，癌癥的常規(guī)治療方法包括手術(shù)、放射、化學(xué)藥物治療、介入、氬氦刀、射頻、熱療、中醫(yī)治療等，雖然這些方法對(duì)于減輕腫瘤負(fù)荷見(jiàn)效快，但各有弊端，手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)大，造成機(jī)體損傷；放療時(shí)有些部位不易照射到，對(duì)機(jī)體免疫、造血系統(tǒng)造成損傷；化療毒副作用大，對(duì)機(jī)體免疫、造血系統(tǒng)同樣造成損傷；介入治療會(huì)造成栓塞，由于使用化學(xué)藥物，同時(shí)會(huì)存在副作用；氬氦刀對(duì)較大且不規(guī)則的病灶效果不好；射頻、熱療對(duì)正常組織損傷也較大；中醫(yī)治療常作為一種輔助手段，長(zhǎng)期用藥造成機(jī)體耐藥性。這些常規(guī)治療方法，并不能殺滅全部腫瘤細(xì)胞，這也為日后腫瘤的復(fù)發(fā)埋下了伏筆。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，NK、DC-CIK、TCR-T/CAR-T 等細(xì)胞治療手段如雨后春筍般的出現(xiàn)，生物免疫療法也成為癌癥治療新領(lǐng)域，而CAR-T細(xì)胞療法被研究者們認(rèn)為是最有希望成為治愈腫瘤細(xì)胞的方法。

1 CAR-T技術(shù)的產(chǎn)生

1.1 CAR-T技術(shù)產(chǎn)生的背景

研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織可產(chǎn)生的反映腫瘤自身存在的化學(xué)物質(zhì)，即腫瘤標(biāo)志物，通過(guò)醫(yī)學(xué)檢測(cè)可以證實(shí)，腫瘤標(biāo)志物雖與腫瘤相關(guān)，卻并不能完全用于腫瘤的診斷，腫瘤的最終確診還是病理學(xué)，臨床上發(fā)現(xiàn)的腫瘤時(shí)，大部分為中晚期，此時(shí)患者自身的免疫功能已經(jīng)紊亂，腫瘤周?chē)拿庖咭种莆h(huán)境和腫瘤細(xì)胞不表達(dá)或低表達(dá) MHC分子，使免疫細(xì)胞不能準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)并清除腫瘤細(xì)胞。在治療腫瘤的過(guò)程中，除了常規(guī)治療方法，還需要對(duì)腫瘤細(xì)胞精準(zhǔn)的殺傷或消滅，從而徹底控制微小病灶和轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞，于是，在研究者們不懈的努力下，CAR-T 技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。

1.2 CAR-T治療的步驟

CAR-T即嵌合抗原受體的 T 細(xì)胞，CAR-T的治療主要包括5個(gè)步驟：第一，人工合成CAR；第二，從腫瘤患者體內(nèi)分離獲得淋巴 T 細(xì)胞；第三，利用基因工程的方法把設(shè)計(jì)好的 CAR 轉(zhuǎn)入T細(xì)胞中；第四，體外篩選并擴(kuò)增；第五，檢測(cè)合格后輸注到患者體內(nèi)。

1.3 CAR-T的設(shè)計(jì)合成

CAR的基礎(chǔ)設(shè)計(jì)中包括胞外鉸鏈區(qū)、腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合區(qū)(scFV段)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)。腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合區(qū)的合成對(duì)于CAR的特異性、有效性以及改造后T細(xì)胞的安全性是決定因素；胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)的設(shè)計(jì)對(duì)于 CAR的細(xì)胞活化、細(xì)胞刺激的持久性、細(xì)胞存活時(shí)間起著重要作用。

CAR設(shè)計(jì)完成之后要通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入T細(xì)胞，目前主要使用的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法包括慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、電轉(zhuǎn)導(dǎo)等。應(yīng)用病毒作為載體轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較高，但存在安全風(fēng)險(xiǎn)，使用電轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較低，表達(dá)不穩(wěn)。

在CAR-T設(shè)計(jì)中發(fā)現(xiàn)CAR的關(guān)鍵作用部位在于特異性抗原的選擇和胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)，由于腫瘤細(xì)胞不表達(dá)或低表達(dá)MHC分子，選擇一個(gè)特異性好的腫瘤標(biāo)志物又十分困難，目前對(duì)CAR的優(yōu)化主要集中在胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)上。

1.3.1 第一代CAR-T的設(shè)計(jì)合成 第一代 CAR-T 胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)僅有一個(gè) CD3ζ域，它介導(dǎo)的 T 細(xì)胞激活是通過(guò) CD3ζ鏈或免疫球蛋白 Fc 受體的γ鏈完成。由于 CAR-T 的細(xì)胞表面受體與靶細(xì)胞的表面抗原結(jié)合，與腫瘤 MHC 無(wú)關(guān)，不需要抗原加工處理，缺少與抗原提呈細(xì)胞的相互作用，在體內(nèi)抗腫瘤活性受到了限制[1-3]，腫瘤細(xì)胞的清除還需要 CAR-T 細(xì)胞表面表達(dá)的協(xié)同刺激信號(hào)。

1.3.2 第二代CAR-T的設(shè)計(jì)合成 為克服第一代CAR-T的限制，第二代CAR-T結(jié)合了協(xié)同刺激受體(CD28或 4-1BB)，它來(lái)源于 T 細(xì)胞的激活模型，協(xié)同刺激受體提供了 T 細(xì)胞激活信號(hào)，增強(qiáng)了 T 細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤效應(yīng)[4]，使源自 T 細(xì)胞受體和 CD3復(fù)合體的信號(hào)擴(kuò)大。與第一代 CAR-T 相比，協(xié)同刺激受體的加入能夠促進(jìn) T 細(xì)胞的增殖、分泌細(xì)胞因子、分泌抗凋亡蛋白，另外細(xì)胞作用時(shí)間增長(zhǎng)[5-8]。

1.3.3 第三代CAR-T的設(shè)計(jì)合成 為了進(jìn)一步改良CAR-T的設(shè)計(jì)，第三代CAR-T在胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)加入了多個(gè)信號(hào)結(jié)構(gòu)域(ICOS，4-1BB，OX40，CD27，CD28，DAP10)，用以增強(qiáng)CAR-T的激活與持久性。不同的研究表明第二代CAR和第三代 CAR 的比較結(jié)果并沒(méi)有質(zhì)的變化[4]。目前的研究還不能確定第二代和第三代哪個(gè)更勝一籌，不過(guò)第二代和第三代CAR-T都已有各自的臨床試驗(yàn)。

1.3.4 第四代CAR-T的設(shè)計(jì)合成 由于第二代、第三代CAR-T缺乏對(duì)CAR-T增殖和殺傷的限制，很容易導(dǎo)致腫瘤溶解綜合癥(TLS)和細(xì)胞因子釋放綜合癥(CRS)，第四代CAR-T在特異性抗原的選擇域前端加入了一個(gè)重組抗體的雙功能啟動(dòng)開(kāi)關(guān)，該開(kāi)關(guān)是由一個(gè)腫瘤治療性抗體的Fab片段和一個(gè)多肽抗原表位構(gòu)成，用于控制CAR-T的殺傷和增殖。

2 CAR-T 細(xì)胞的相關(guān)試驗(yàn)及改進(jìn)

2.1 第一代CAR-T細(xì)胞試驗(yàn)

Lamers 等[9]報(bào)道了以 CAIX 為抗原設(shè)計(jì)的一代 CAR-T治療轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌。在接受治療的8名患者中，5名采用直接輸注，出現(xiàn)了肝炎癥狀，其余患者在輸注前注射了抗 CAIX單克隆抗體，這種治療前預(yù)處理沒(méi)有使患者出現(xiàn)肝炎癥狀，分析原因可能是改造的 CAR-T對(duì)自身同樣表達(dá)CAIX抗原的膽管細(xì)胞進(jìn)行了攻擊，注射抗CAIX單克隆抗體可能封閉了膽管細(xì)胞CAIX的表達(dá)，免受了靶向攻擊。另外，第一代設(shè)計(jì)的CAR-T在患者體內(nèi)存活時(shí)間較短沒(méi)有出現(xiàn)客觀的臨床效果。

Jensen 等[10]報(bào)道了以CD19為特異性抗原的 CAR-T治療濾泡性淋巴瘤細(xì)胞和以 CD20為特異性抗原的 CAR-T 治療成熟 B 細(xì)胞淋巴瘤，同樣由于改造 CAR-T 細(xì)胞在體內(nèi)持續(xù)時(shí)間較短沒(méi)有出現(xiàn)客觀的臨床效果。

第一代CAR-T的臨床試驗(yàn)雖然沒(méi)有較好的治療效果，但間接證明了CAR-T設(shè)計(jì)的可行性，為后續(xù)的 CAR-T 改進(jìn)和臨床應(yīng)用積累了寶貴的經(jīng)驗(yàn)。

2.2 第二代CAR-T細(xì)胞試驗(yàn)

Kochenderfer 等[11]報(bào)道了1例非霍奇金淋巴瘤(NHL)使用以CD19為特異性抗原的二代CAR-T配合白細(xì)胞介素-2 進(jìn)行治療，治療前接受了環(huán)磷酰胺和氟達(dá)拉濱的化學(xué)藥物治療，結(jié)果顯示：在 27 周內(nèi)，使用定量 PCR 在患者外周血里一直能檢測(cè)到CAR-T的存在，患者32 周時(shí)淋巴瘤得到了緩解， 29 周時(shí)出現(xiàn) B 細(xì)胞再生障礙性貧血。

Kalos 和 Porter 等[12,13]報(bào)道了使用了加載 4-1BB 以 CD19為特異性抗原的二代 CAR-T 治療3名慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)患者，治療前接受了化學(xué)藥物治療，結(jié)果顯示，改造后的CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增了近萬(wàn)倍，回輸后發(fā)生轉(zhuǎn)移，在6個(gè)月內(nèi)，使用流式和定量 PCR 在病發(fā)位置骨髓檢測(cè)到并呈高表達(dá)，其中2名患者完全緩解，1名患者部分緩解，但是導(dǎo)致了腫瘤溶解綜合癥(TLS)和細(xì)胞因子釋放綜合癥(CRS)，另外，出現(xiàn)了 B 細(xì)胞再生障礙性貧血、漿細(xì)胞數(shù)量減少和低丙種球蛋白血癥。

2.3 第三代CAR-T細(xì)胞試驗(yàn)

Morgan 等[14]報(bào)道了使用同時(shí)加載 CD28和 4-1BB 協(xié)同刺激受體、靶向 ERBB2 的三代 CAR-T 治療1名結(jié)腸癌并伴有肺、肝轉(zhuǎn)移的患者，治療前接受了環(huán)磷酰胺和氟達(dá)拉濱的化學(xué)藥物治療，在輸注了1010 的 CAR-T 細(xì)胞后，過(guò)量的 CAR-T 細(xì)胞攻擊低表達(dá) ERBB2 的肺上皮細(xì)胞，引起肺部毒性，并伴隨細(xì)胞因子釋放綜合癥，導(dǎo)致多器官衰竭，患者在第5天死亡。

傳統(tǒng)的 CAR-T對(duì)表達(dá)CD19抗原的復(fù)發(fā)性B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病已經(jīng)成功臨床應(yīng)用，但是傳統(tǒng)的CAR-T在體內(nèi)激活和擴(kuò)增缺乏控制，CAR-T細(xì)胞快速增殖，這導(dǎo)致腫瘤溶解綜合癥的嚴(yán)重病例(TLS)和細(xì)胞因子釋放綜合癥(CRS)，在患者體內(nèi)遇到抗原陽(yáng)性細(xì)胞時(shí)，引起并發(fā)癥，例如，改造的抗 CD9 CAR-T不加區(qū)分的殺死惡性B細(xì)胞和正常B細(xì)胞，導(dǎo)致長(zhǎng)期的B細(xì)胞發(fā)育不全。目前，第四代CAR-T已被研究者設(shè)計(jì)，重點(diǎn)在于改善 CAR-T的殺傷啟動(dòng)。

2.4 第四代 CAR-T 細(xì)胞試驗(yàn)

David 等[15]報(bào)道了以CD19為特異性抗原在CAR-T的特異性抗原的選擇域前端加入一個(gè)聚合小分子，從而使CAR-T的殺傷活性可調(diào)，并在B細(xì)胞白血病的嚙齒動(dòng)物中成功實(shí)驗(yàn)，防止了CRS和TLS的發(fā)生，報(bào)道表明該方法適用于異質(zhì)性和耐藥腫瘤人群，如血液腫瘤和實(shí)體瘤。

目前報(bào)道的CAR-T細(xì)胞治療成功案例多是在治療血液腫瘤方面，在實(shí)體瘤臨床試驗(yàn)方面卻少有成功[16-18]，主要是多種因素如腫瘤抗原丟失、趨化因子等，阻礙 CAR-T 細(xì)胞進(jìn)入腫瘤區(qū)域，另外，腫瘤周?chē)h(huán)境如pH值、氧化應(yīng)激、免疫抑制抑制細(xì)胞因子、調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞、骨髓源的抑制性細(xì)胞[19]、腫瘤局部氧化應(yīng)激等[20],使腫瘤細(xì)胞增殖[21]，使周?chē)馨图?xì)胞表現(xiàn)出高水平 DNA 氧化[22]，也不利于免疫殺傷。 Ligtenberg MA等[23]報(bào)道了通過(guò)基因工程改造 T 細(xì)胞，使 T 細(xì)胞共表達(dá)過(guò)氧化氫酶和嵌合抗原，從而保護(hù)浸潤(rùn) T 細(xì)胞免受腫瘤周?chē)趸瘧?yīng)激介導(dǎo)的免疫抑制。

CAR-T 細(xì)胞在臨床試驗(yàn)方面的改進(jìn)令人興奮，但CAR-T的研究仍處于初級(jí)階段，目前的 CAR-T 仍受限于固定的抗原特異性，缺乏理想的腫瘤特異性抗原，需要進(jìn)一步克服腫瘤腫瘤周?chē)奈h(huán)境，CAR-T的穩(wěn)定性和安全性還要進(jìn)一步的改進(jìn)驗(yàn)證。相信通過(guò)研究者們前仆后繼的努力，CAR-T細(xì)胞治療會(huì)得到進(jìn)一步的優(yōu)化，期待不久的將來(lái)，CAR-T細(xì)胞治療會(huì)真正成為腫瘤治愈的有效方法。

[1] Jensen MC,Popplewell L,Cooper LJ,et al. Antitransgene rejection responses contribute to attenuated persistence of adoptively transferred CD20/CD19-specific chimeric antigen receptor redirected T cells in humans[J].Biol Blood Marrow Transplant,2010,16(9):1245-1256.

[2] Savoldo B,Ramos CA,Liu E,et al. CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor-modified T cells in lymphoma patients[J].J Clin Invest,2011,121(5):1822-1826.

[3] Till BG,Jensen MC,Wang J,et al. Adoptive immunotherapy for indolent non-Hodgkin lymphoma and mantle cell lymphoma using genetically modified autologous CD20-specific T cells[J].Blood,2008,112(6):2261-2271.

[4] Kochenderfer JN,Feldman SA,Zhao Y,et al.Construction and Pre-clinical Evaluation of an Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor[J]. J Immunother,2009,32(7):689-702.

[5] Kim JS,Smith-Garvin JE,Koretzky GA,et al. The requirements for natural Th17 cell development are distinct from those of conventional Th17 cells[J].J Exp Med,2011,208:2201-2207.

[6] Ellmark P,Mangsbo SM,Furebring C.,et al. Tumor-directed immunotherapy can generate tumor-specific T cell responses through localized co-stimulation[J].Cancer Immunol Immunother,2016, 6 (10):6.

[7] McKague M1,McAnally KI,Skovron M,et al. Source Monitoring and Proneness to Auditory-verbal Hallucinations: a signal detection analysis[J].Cogn Neuropsychiatry,2012,17(6):544-562.

[8] Xu H,Wang X,Malam N,et al. Persistent Simian Immunodeficiency Virus Infection Drives Differentiation, Aberrant Accumulation, and Latent Infection of Germinal Center Follicular T Helper Cells[J].J Virol,2015,90(3):1578-1587.

[9] Lamers CH,Sleijfer S,Vulto AG,et al. Treatment of metastatic renal cell carcinoma with autologous T-lymphocytes genetically retargeted against carbonic anhydrase IX: first clinical experience[J]. J Clin Oncol，2006,24(13): 20-22.

[10] Jensen MC,Popplewell L,Cooper LJ,et al. Antitransgene Rejection Responses Contribute to Attenuated Persistence of Adoptively Transferred CD20/CD19 Specific Chimeric Antigen Receptor Redirected T Cells in Humans[J].Biol Blood Marrow Transplant, 2010,16(9):1245-1256.

[11] Kochenderfer JN,Dudley ME,Kassim SH,et al. Chemotherapy-refractory diffuse large B-cell lymphoma and indolent B-cell malignancies can be effectively treated with autologous T cells expressing an anti-CD19 chimeric antigen receptor[J].J Clin Oncol,2015,33(6):540-549.

[12] Kalos M.Chimeric antigen receptor-engineered T cells in CLL: the next chapter unfolds[J].J Immunother Cancer,2016,6(4):5.

[13] Morgan RA,Yang JC,Kitano M,et al.Case report of a serious adverse event following the administration of T cells transduced with a chimeric antigen receptor recognizing ERBB2[J]. Mol Ther，2010,18(4): 843-851.

[14] David TR, Magdalena M,Eric NH,et al. Switch-mediated activation and retargeting of CAR-T cells for B-cell malignancies[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2016,113(4):459-468.

[15] David TR, Magdalena M, Eric NH, Yu C, Nitya S, et al. Switch-mediated activation and retargeting of CAR-T cells for B-cell malignancies s[J]. PNAS Published Online, 2016,12(1):459-468.

[16] Kershaw MH,Westwood JA,Parker LL,et al.A phase I study on adoptive immunotherapy using gene-modified T cells for ovarian cancer[J].Clin CancerRes,2006,12(20 ):6106-6115.

[17] Long AH,Highfill SL,Cui Y,et al.Reduction of MDSCs with All-trans Retinoic Acid Improves CAR Therapy Efficacy for Sarcomas[J].Cancer Immunol Res,2016,4(10):869-880.

[18] Park JR,Digiusto DL,Slovak M, et al.Adoptive transfer of chimeric antigen receptor re-directed cytolytic T lymphocyte clones in patients with neuroblastoma[J].Mol Ther,2007,15(4):825-833.

[19] Gilham DE,Debets R,Pule M,et al. CART cells and solid tumors: tuning T cells to challenge an inveterate foe[J]. Trends Mol Med,2012,18(7):377-384.

[20] Gackowski D,Banaszkiewicz Z,Rozalski R. et al. Persistent oxidative stress in colorectal carcinoma patients[J].Int J Cancer, 2002,101(4):395-397.

[21] Kang KA,Kim KC,Bae SC,. et al. Oxidative stress induces proliferation of colorectal cancer cells by inhibiting RUNX3 and activating the Akt signaling pathway[J].Int J Oncol,2013,43(5):1511-1516.

[22] Soliman AS,Vulimiri SV,Kleiner HE, et al. High levels of oxidative DNA damage in lymphocyte DNA of premenopausal breast cancer patients from Egypt[J].Int J Environ Health Res,2004,14(2):121-134.

[23] Ligtenberg MA, Mougiakakos D, Mukhopadhyay M, et al. Coexpressed Catalase Protects Chimeric Antigen Receptor Redirected T Cells as well as Bystander Cells from Oxidative Stress-Induced Loss of Antitumor Activity [J].J Immunol,2016,196(2):759-766.

本文編輯：王知平

陳明月，女，藥師，碩士研究生在讀

秦玉花，女，主任藥師，E-mail: cmy19910215@163.com

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