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    重組異種骨對Balb/c小鼠的免疫學影響

    2016-04-05 00:51:07孫曉霞蓋瀟瀟孫立魁王賢美仇士東
    關(guān)鍵詞:小鼠實驗

    孫曉霞,蓋瀟瀟,孫立魁,王賢美,仇士東,侯 麗

    (國家食品藥品監(jiān)督管理局濟南醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心,山東省醫(yī)療器械生物學評價重點實驗室,山東濟南 250101)

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    重組異種骨對Balb/c小鼠的免疫學影響

    孫曉霞,蓋瀟瀟,孫立魁,王賢美,仇士東,侯 麗

    (國家食品藥品監(jiān)督管理局濟南醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心,山東省醫(yī)療器械生物學評價重點實驗室,山東濟南 250101)

    目的 動態(tài)評價小鼠植入重組異種骨后的免疫毒性改變,揭示該重組異種骨的免疫學作用機制。方法 以廣東冠昊生物科技股份有限公司研發(fā)的重組異種骨為材料,進行體外檢測該重組異種骨的淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗;將重組異種骨植入Balb/c小鼠右側(cè)股部肌間隙,分別通過血生化分析儀、ELISA和流式細胞術(shù),于植入后1周、2周、4周動態(tài)監(jiān)測Balb/c小鼠免疫學改變,綜合評價該重組異種骨對機體的免疫學影響。結(jié)果 通過實驗發(fā)現(xiàn),該重組異種骨無明顯的體外淋巴細胞免疫刺激作用;異種骨植入小鼠后,其血清中C3、IgG、IgM、炎性因子(TNF-α、IL-6)水平以及植入物局部堿性磷酸酶(ALP)含量均與陰性對照組(即假手術(shù)組)無明顯差異,且該異種骨植入對小鼠外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)及其淋巴結(jié)淋巴細胞的分群和活化均無顯著影響。結(jié)論 該重組異種骨不能引起體內(nèi)外的免疫毒性反應(yīng),從而為重組異種骨的臨床應(yīng)用提供實驗數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

    重組異種骨;免疫毒性;Balb/c小鼠

    由于事故或疾病等各種原因造成的骨創(chuàng)傷、骨缺損是臨床常見病例。自體骨是目前公認的植骨材料[1],但患者要遭受2次手術(shù)的痛苦,且其數(shù)量有限;此外,異體骨的來源有限且有傳染疾病的危險。重組異種骨因其來源廣泛和獨特的生物學特性作為組織工程骨支架材料,可避免使用異體骨可能發(fā)生的交叉感染,有效解決臨床上自體骨與同種骨不足的問題,具有較好的應(yīng)用前景,但移植后發(fā)生的劇烈免疫排斥阻礙了異種骨移植的發(fā)展[2]。近年來,隨著對異種骨處理方法的不斷改進,市場上出現(xiàn)多種能應(yīng)用于臨床的異種骨[3],但仍缺乏對異種骨植入后介導的免疫毒性研究,其中的免疫學機制尚不清楚。

    本研究以廣東冠昊生物科技股份有限公司采用已獲得專利授權(quán)(US6106555A,US6231614B1)制備的豬源性異種骨為實驗對象,通過體外細胞毒實驗、淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗和體內(nèi)肌肉植入實驗,分別檢測該重組異種骨對體液免疫和細胞免疫的影響,以評價其對機體的免疫安全性,從而為進一步開展臨床實驗提供實驗數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 動物和細胞

    Balb/c小鼠,雌雄各半,6~8周齡,體質(zhì)量18~22 g,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司;L929細胞系購自中科院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

    1.2 試劑和儀器

    刀豆蛋白A Ⅳ型(ConA)、植物血凝素(PHA)、弗氏完全佐劑(Freud’s)和MTT均購自Sigma公司;小牛血清白蛋白(BSA,北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品);RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO公司產(chǎn)品);人外周血淋巴細胞分離液(天津灝洋);ELISA檢測試劑盒(表1);流式細胞術(shù)相關(guān)抗體(表2)。倒置顯微鏡(Olympus TH4-200);全自動酶標儀(Multiskan MK3,熱電儀器有限公司);流式細胞儀(Becton Dickinson, USA);多功能勻質(zhì)儀(Precellys 24,Bertin公司)。

    表1 ELISA檢測試劑盒

    Tab.1 ELISA Detection Kits

    目錄號產(chǎn)品名稱生產(chǎn)商6320MouseIgGELISAKitABI6380MouseIgMELISAKitABI6270MouseComplement3ELISAKitABI16193MouseIL-6ELISAKitABI21926MouseTNF-αELISAKitABI

    1.3 實驗樣品及處理

    重組異種骨由合作單位廣東冠昊生物科技股份有限公司提供,經(jīng)紫外輻照滅菌后,無菌分割成3 mm×3 mm×3 mm大小的骨粒,新鮮牛骨亦由此方法處理成相同大小的骨粒。

    1.4 細胞毒性實驗

    根據(jù)ISO10993-12:2007[4]規(guī)定的原則制備樣品,取重組異種骨和新鮮牛骨經(jīng)多功能勻質(zhì)儀粉碎后精確稱重,以RPMI 1640培養(yǎng)基(含100 mL/L FBS)為浸提介質(zhì),充分吸脹后,按0.1 g/mL的含量在(37±1)℃的條件下浸提(24±2)h,50 g離心5 min,制備試驗液,按ISO10993-5:2009[5]中要求,對重組異種骨和新鮮牛骨的試驗液進行體外細胞毒性試驗。

    表2 流式細胞術(shù)的相關(guān)抗體

    Tab.2 Flow cytometry-related antibodies

    目錄號產(chǎn)品名稱生產(chǎn)商100204FITCanti-mouseCD3antibodyBioLegend400605FITCRatIgG2b,κIsotypeCtrlAntibodyBioLegend100708PEanti-mouseCD8antibodyBioLegend400507PERatIgG2a,κIsotypeCtrlAntibodyBioLegend104508PEanti-mouseCD69antibodyBioLegend400907PEArmenianHamsterIgGIsotypeCtrlAntibodyBioLegend103130PerCPanti-mouseCD45antibodyBioLegend100412APCanti-mouseCD4antibodyBioLegend400611APCRatIgG2b,κIsotypeCtrlAntibodyBioLegend115512APCanti-mouseCD19antibodyBioLegend400511APCRatIgG2a,κIsotypeCtrlAntibodyBioLegend

    1.5 小鼠血清制備

    小鼠摘眼球放血,收集血液,4 ℃靜置30 min,800 g離心15 min,收集上層血清,-20 ℃保存。

    1.6 淋巴細胞制備

    ①人外周血單個核細胞(PBMC)制備:抽取健康志愿者前臂靜脈血10 mL,加至淋巴分離液的上層,按照淋巴細胞分離液說明書,離心取淋巴細胞層加入10 mL無菌1×PBS,離心后收集人PBMC用含100 mL/L FCS的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細胞。②Balb/c小鼠外周血單個核細胞(PBMC)制備:小鼠摘眼球放血,收集血液至抗凝管;離心后棄上清,用紅細胞裂解液裂解紅細胞,離心后收集鼠PBMC用1×PBS重懸細胞。③Balb/c小鼠淋巴結(jié)(lymph node)淋巴細胞制備:脫頸椎處死Balb/c小鼠,無菌摘取淋巴結(jié),用1×PBS溶液200目篩網(wǎng)研磨過濾;離心后收集鼠淋巴結(jié)淋巴細胞用1×PBS重懸細胞。

    1.7 實驗分組

    體外細胞毒性實驗共分為3組:陰性對照組(空白培養(yǎng)基組);重組異種骨組;新鮮牛骨組,體外淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗共分為4組:陰性對照組(空白培養(yǎng)基組),重組異種骨組、新鮮牛骨組和陰性對照組(PHA);體內(nèi)實驗共分為4組:陰性對照組(假手術(shù)組);重組異種骨組;新鮮牛骨組;BSA對照組(BSA和Freuds聯(lián)合免疫)

    1.8 實驗步驟

    1.8.1 MTT實驗 按照ISO10993-5:2009醫(yī)療器械生物學評價第5部分體外細胞毒性試驗MTT法進行。

    1.8.2 淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗 按照ISO10993-20:2006醫(yī)療器械生物學評價第20部分淋巴細胞增殖實驗[6]。將細胞懸液加入96孔板,每孔100 μL,設(shè)6個復孔。陽性對照組加入PHA至終濃度為10 ng/mL,實驗平板在37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后取出,加入MTT,繼續(xù)培養(yǎng)6 h,離心后棄上清,加入DMSO,振蕩平板至甲臜顆粒完全溶解,在酶標儀上于570 nm波長處測吸光度值(A),參照波長為630 nm。各實驗組與陰性對照組的比值作為細胞的相對增殖比例。

    1.8.3 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)實驗 按照試劑盒說明書進行ELISA試驗,檢測血清中的免疫球蛋白(gG,IgM)、補體C3、TNF-α和IL-6水平。

    1.8.4 流式細胞術(shù)(Flow cytometry)檢測淋巴細胞表面分子表達 收集淋巴細胞至離心管內(nèi),500 g離心5 min,棄上清;用適量1×PBS懸起細胞并轉(zhuǎn)移至流式管中(100 μL/管),設(shè)空白對照組、同型對照組、單標組和實驗組,4 ℃,避光標記30 min~1 h;在流式管內(nèi)加滿1×PBS,離心后棄上清,1×PBS重懸細胞,用流式細胞儀檢測。

    1.9 統(tǒng)計學分析

    所有結(jié)果均以平均值±標準差的形式表示,利用Student’st或者ANOV方差檢驗進行統(tǒng)計學分析,與對照組相比,P<0.05時認為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 異種骨浸提液對人淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力的影響

    按細胞毒性實驗分別制備陰性對照組(空白培養(yǎng)基組),重組異種骨組和新鮮牛骨組的試驗液,取各組的試驗液與L929細胞共培養(yǎng)72 h,通過MTT摻入法檢測其細胞毒性。結(jié)果顯示,新鮮牛骨的試驗液能抑制L929細胞增殖,而重組異種骨組未出現(xiàn)增殖抑制作用(圖1)。作為一種異源物質(zhì),由于重組異種骨在臨床使用時可能會觸發(fā)針對該異源成分的免疫應(yīng)答,首先通過體外淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗來驗證是否存在免疫反應(yīng)。與細胞毒性實驗相同的方法獲得各組試驗液,取試驗液與人PBMC共同孵育,結(jié)果如圖1所示,與陰性對照組相比,該異種骨不能引起人PBMC增殖反應(yīng),新鮮牛骨卻對PBMC具有明顯的免疫抑制作用,其相對增殖比例明顯低于陰性對照組(P<0.01)。結(jié)合細胞毒性實驗和淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗的結(jié)果表明,該重組異種骨無明顯的淋巴細胞免疫刺激作用。

    圖1 重組異種骨浸提液不會引起體外培養(yǎng)L929細胞毒性反應(yīng)和人PBMC增殖反應(yīng)

    Fig.1 The extracts of heterogeneous bone did not cause either cytotoxicity of L929 cell nor proliferation of human PBMCsinvitro
    與陰性對照組比較,**P<0.01。

    2.2 重組異種骨植入無明顯一般毒性影響

    一般毒性研究為解釋免疫學反應(yīng)的發(fā)生提供了背景資料,包括一般臨床觀察和局部大體觀察。在本實驗中,臨床觀察:整個實驗周期受試組動物無一死亡。未發(fā)現(xiàn)明顯的毛發(fā)狀態(tài)、步態(tài)、體表孔口排液出現(xiàn)異常情況。局部大體觀察:重組異種骨植入的第1周內(nèi),植入局部可見紅腫,之后紅腫情況逐漸消失,整個實驗周期植入局部均無滲出。處死動物時,可發(fā)現(xiàn)植入部位有囊腔形成,無可見的感染現(xiàn)象,囊腔周圍無小血管生成。新鮮牛骨組在植入部位可見明顯的紅腫,處死動物時,植入部位無囊腔形成。在整個試驗過程中未發(fā)現(xiàn)植入物丟失。

    2.3 重組異種骨植入對小鼠血清補體C3濃度無影響

    補體C3是血清中含量最高的補體成分,本研究通過ELISA法動態(tài)觀察不同植入時間血清中補體C3水平,發(fā)現(xiàn)與陰性對照組(假手術(shù)組)相比,植入重組異種骨后的1、2、4周并不能引起補體C3的改變;而植入新鮮牛骨卻能夠?qū)е卵a體C3的升高(圖2,4周時與陰性對照組比較,P<0.05)。

    圖2 重組異種骨不影響體內(nèi)血清補體C3水平

    Fig.2 Heterogeneous bone did not affect serum C3invivo
    與陰性對照組比較,*P<0.05,**P<0.01。

    2.4 異種骨植入對小鼠血清IgG、IgM濃度的影響

    IgG、IgM是評價體液免疫功能的重要指標。如圖3所示,與陰性對照組相比,隨著植入時間的增加,新鮮牛骨組和BSA對照組ELISA檢測的血清IgG、IgM均維持較高的水平(P<0.01)。而重組異種骨組的血清IgG、IgM僅在術(shù)后1周出現(xiàn)反應(yīng)性升高,第2和4周的抗體水平與陰性對照組相比都無明顯差異。這一結(jié)果顯示,該重組異種骨不會影響B(tài)alb/c小鼠免疫球蛋白分泌水平。

    圖3 異種骨不影響體內(nèi)血清IgG、IgM水平

    Fig.3 Heterogeneous bone did not affect the levels of serum IgG and IgMinvivo
    與陰性對照組比較,*P<0.05,**P<0.01。

    2.5 重組異種骨植入小鼠后對植入物局部堿性磷酸酶(ALP)含量的影響

    本實驗通過免疫比濁法檢測了不同植入時間的小鼠植入部位的ALP水平,結(jié)果顯示,植入了重組異種骨并未引起植入的肌肉中ALP明顯改變;而新鮮牛骨和BSA對照組,同陰性對照組相比,卻均能導致局部ALP持續(xù)增加,至植入4周后ALP高達約300 U/L(圖4)。

    圖4 異種骨不影響植入局部ALP水平

    Fig.4 Heterogeneous bone did not affect the level of ALP at implantation site
    與陰性對照組比較,*P<0.05,**P<0.01。

    2.6 重組異種骨植入對小鼠血清中炎性因子(TNF-α、IL-6)水平的影響

    通過ELISA法分別檢測了小鼠血清中TNF-α和IL-6水平,發(fā)現(xiàn)同陰性對照組相比,除了植入重組異種骨1周后TNF-α出現(xiàn)短暫的升高(可能與手術(shù)引起的生理性炎癥反應(yīng)有關(guān),P<0.05),此重組異種骨不會引起TNF-α和IL-6明顯改變;而新鮮牛骨和BSA對照組卻導致了TNF-α和IL-6持續(xù)高表達(與陰性對照組比較,P<0.01),提示炎癥的持續(xù)狀態(tài)(圖5)。此結(jié)果也與上述補體C3和ALP水平相一致。本研究所用異種骨材料不會導致小鼠的炎癥反應(yīng)。

    2.7 重組異種骨植入對小鼠外周血單個核細胞(PBMC)分群和活化的影響

    在不同處理時間(植入后第1、2、4周),用流式細胞術(shù)檢測了Balb/c小鼠PBMC中各類淋巴細胞亞群,結(jié)果如圖6所示,與陰性對照組相比,重組異種骨植入組CD3+PBMC、CD4+PBMC、CD8+PBMC的百分比無明顯差異。同時,分析這些淋巴細胞的活化發(fā)現(xiàn),植入新鮮牛骨能上調(diào)PBMC中各T細胞亞群CD69表達(與陰性對照組比較,P<0.05),促進T細胞活化;而重組異種骨則不會影響T細胞活化(圖7)。繼而,通過CD19分子分析了Balb/c小鼠外周血中B細胞,發(fā)現(xiàn)重組異種骨不會影響B(tài)細胞的表達水平;而植入新鮮牛骨能顯著促進B細胞(CD19+PBMC)百分比(圖8,與陰性對照組比較,P<0.05)。且B細胞的檢測結(jié)果也與上述血清中IgG、IgM含量相一致。通過檢測PBMC中T、B細胞的比例活化,說明該異種骨材料不能引起B(yǎng)alb/c小鼠的細胞和體液免疫反應(yīng)。

    圖5 重組異種骨不影響體內(nèi)血清TNF-α和IL-6水平

    Fig.5 Heterogeneous bone did not affect the levels of serum TNF-α and IL-6invivo
    與陰性對照組比較,*P<0.05,**P<0.01。

    圖6 重組異種骨不影響B(tài)alb/c小鼠體內(nèi)PBMC分群Fig.6HeterogeneousbonedidnotaffecttheproportionofPBMCsfromBalb/cmiceinvivo與陰性對照組比較,*P<0.05,**P<0.01。

    圖7 重組異種骨不影響B(tài)alb/c小鼠體內(nèi)PBMC活化Fig.7HeterogeneousbonedidnotaffecttheactivationofPBMCsfromBalb/cmiceinvivo與陰性對照組比較,*P<0.05,**P<0.01。

    圖8 重組異種骨不影響B(tài)alb/c小鼠體內(nèi)外周血CD19+PBMC表達

    Fig.8 Heterogeneous bone did not affect the expression of CD19+PBMCs from Balb/c miceinvivo
    與陰性對照組比較,*P<0.05,**P<0.01。

    2.8 重組異種骨植入對小鼠淋巴結(jié)(LN)中淋巴細胞分群的影響

    進一步分析了植入部位引流淋巴結(jié)中相應(yīng)的淋巴細胞表型,結(jié)果如圖9所示。植入重組異種骨4周后,淋巴結(jié)中CD3+、CD4+、CD8+T細胞占總淋巴細胞的比例與陰性對照組相比無明顯差異;但新鮮牛骨組和BSA對照組CD3+、CD4+T細胞的比例顯著低于陰性對照組。此外,植入重組異種骨不會影響淋巴結(jié)中B細胞的表達水平,而新鮮牛骨和BSA處理能促進B細胞比例的持續(xù)增多(與陰性對照組比較,P<0.01)。

    3 討 論

    異種骨因有著與人骨相似的結(jié)構(gòu),且其來源范圍廣,經(jīng)適當處理可作為骨移植替代材料,故異種骨已越來越多的作為骨缺損替代物和椎間融合器等在臨床上使用,有效地避免了2次手術(shù)所帶來的創(chuàng)傷和感染風險。目前常采用的異種骨處理方法又深低溫冷凍、反復凍融、煅燒、交聯(lián)、脫蛋白、輻照或多種方法聯(lián)合運用,不同的處理方法對其生物學特性存在不同的影響[7],如目前已上市的異種骨Kiel骨、Bio-OSS等,抗原性低,非常疏松易碎,缺乏力學強度及骨誘導活性,僅作為骨缺損填充材料用于牙周外科發(fā)揮傳導成骨作用[3]。但實際應(yīng)用過程中,由于大量存在的異種骨主要組織相容性復合物(major histocompatibility complex, MHC)[2]、α-半乳糖基抗原(α-Gal抗原)[8-9]等抗原物質(zhì),能夠活化T細胞和B細胞,引起細胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答,由此產(chǎn)生的抗體和細胞均能介導細胞毒作用并溶解靶細胞,最終導致免疫排斥反應(yīng)[10]。因此,異種骨的使用,必須在消除其免疫原性的前提下,使其具有與同種骨相似的效果,從而避免其免疫毒性作用而廣泛用于臨床治療。

    圖9 重組異種骨不影響B(tài)alb/c小鼠體內(nèi)淋巴結(jié)中淋巴細胞分群

    Fig.9 Heterogeneous bone did not affect the proportion of lymphocytes in lymph node from Balb/c miceinvivo
    與陰性對照組比較,*P<0.05,**P<0.01。

    廣東冠昊生物科技股份有限公司研發(fā)的重組異種骨,已在中國藥品生物制品檢定所完成產(chǎn)品的注冊檢驗工作,試驗已證實:該異種骨無免疫原排斥反應(yīng),生物相容性較好,具有良好的生物安全性[10-13],且不會對神經(jīng)系統(tǒng)的生長和功能等產(chǎn)生影響[14]。本研究通過細胞毒性實驗,免疫毒性的功能性檢測如淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗,非功能性檢測如Balb/c小鼠的血清補體C3、免疫球蛋白(IgG、IgM)含量,炎癥因子(TNF-α,IL-6)水平以及外周血PBMC分群(CD4+T細胞、CD3+T細胞、B細胞)活化等一系列體外、體內(nèi)實驗動態(tài)審視該異種骨植入介導的全身免疫毒性;此外,還憑借植入局部的肌肉ALP水平測定和植入部位臨近的引流淋巴結(jié)中淋巴細胞分群和活化的分析,進一步明確該異種骨參與的局部免疫應(yīng)答。

    細胞毒性實驗結(jié)果表明,重組異種骨的試驗液對小鼠成纖維細胞(L929)無細胞毒性,對人PBMC亦無免疫刺激作用。動物實驗數(shù)據(jù)顯示,與陰性對照組相比,新鮮牛骨組的血清中補體C3明顯升高(圖2),這一結(jié)果也與圖3、圖5中血清免疫球蛋白(IgG、IgM)和炎癥因子(TNF-α、IL-6)水平升高相一致,說明植入新鮮牛骨可引起明顯的炎癥反應(yīng);而重組異種骨植入未引起上述炎癥表現(xiàn)。免疫球蛋白和炎癥因子的含量與PBMC的比例和活化水平密不可分。如圖3、圖8所示,與陰性對照組相比,新鮮牛骨組的血清IgG、IgM與外周血B淋巴細胞含量一致,均在較高水平;圖5~7提示,新鮮牛骨組的血清TNF-α、IL-6與外周血T淋巴細胞的含量、活化水平密切相關(guān),均較陰性對照組相比明顯升高;而重組異種骨組的血清IgG、IgM、TNF-α、IL-6,外周血T、B淋巴細胞的含量均與陰性對照組相比無明顯差異,表明該重組異種骨不能引起B(yǎng)alb/c小鼠的細胞和體液免疫反應(yīng)。

    植入局部免疫反應(yīng)的結(jié)果顯示,與陰性對照組相比,新鮮牛骨組的肌肉局部ALP高表達,且ALP與成骨、炎癥和惡性腫瘤等密切相關(guān)[15],而重組異種骨植入未能引起ALP的異常改變(圖4);同時,新鮮牛骨組的淋巴結(jié)B淋巴細胞亦顯著增加,而重組異種骨組淋巴結(jié)淋巴細胞與陰性對照組相比均無明顯差異(圖9),表明重組異種骨不會造成Balb/c 小鼠的局部免疫毒性反應(yīng),進一步證實該重組異種骨對機體的免疫系統(tǒng)不會造成毒性反應(yīng),具有良好的免疫安全性,說明此重組異種骨有望成為一種理想的骨缺損修補材料。

    然而,本研究還存在一些不足之處,比如,在天然免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用的自然殺傷細胞(NK)細胞,其是否參與了重組異種骨介導的免疫毒性反應(yīng);我們雖然發(fā)現(xiàn)重組異種骨植入不會引起血清補體C3的改變,但是否會影響其活化型C3a或C3b的水平;IgE,介導急性和超急性抑制排斥反應(yīng)的抗體,是否也參與了重組異種骨介導的免疫毒性反應(yīng)等一系列問題有待進一步的試驗來揭示。

    綜上所述,本文從免疫學角度,從功能性和非功能性兩個方面檢測了重組異種骨介導的小鼠免疫毒性反應(yīng)。實驗結(jié)果表明,重組異種骨肌肉植入4周后,外周血中淋巴細胞分群活化,炎性因子、血清補體C3及IgG、IgM水平與對照組無明顯差異。此外,肉眼觀察植入部位無紅腫、可見囊腔形成,肌肉中ALP含量與對照組無明顯差異,且植入部位引流淋巴結(jié)中淋巴細胞分群也與對照組無明顯差異。由此說明,該重組異種骨不能引起小鼠免疫毒性反應(yīng),從而為重組異種骨材料的臨床應(yīng)用提供實驗數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

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    (編輯 卓選鵬)

    Effect of heterogeneous bone on the immune system of Balb/c mice

    SUN Xiao-xia, GAI Xiao-xiao, SUN Li-kui, WANG Xian-mei, QIU Shi-dong, HOU Li

    (Jinan Quality Supervision and Inspection Center for Medical Devices,State Food and Drug Administration; Key Laboratory of Biological Evaluation of Medical Devices of Shandong Province, Jinan 250101, China)

    Objective To make a dynamic evaluation of the immunotoxicology caused by heterogeneous bone implantation and reveal its immunological mechanisms. Methods Heterogeneous bone was provided by Guangdong Grandhope Biotech Co., Ltd. Immunology of Balb/c mice by blood biochemical analysis, ELISA and flow cytometry after the test of lymphocyte transformationinvitro. We dynamically monitored the immunological changes Balb/c mice after 1 week, 2 weeks and 4 weeks of muscle implantation to evaluate the immunological effect of the heterogeneous bone on the body. Results Our experiments showed that the heterogeneous bone did not cause immune stimulation of lymphocytesinvitro, and there were no differences between implantation of heterogeneous bone and the sham operation in the levels of C3, IgG, IgM, inflammatory factors (TNF-α and IL-6) in serum and ALP in implantation site. Moreover, heterogeneous bone implantation did not affect the proportion or activation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and lymphocytes in the lymph node. Conclusion The heterogeneous bone cannot mediate immunotoxicologyinvivo, which may provide experimental data and theoretical basis for clinical application of heterogeneous bone.

    heterogeneous bone; immunotoxicology; Balb/c mouse

    2014-10-31

    2015-09-29

    山東省自然科學基金青年基金項目(No.ZR2014CQ041);再生型醫(yī)用置入器械國家工程實驗室PI項目(No.2012NELRMD007) Supported by the Youth Project of Natural Science Foundation of Shandong Province (No.ZR2014CQ041) and the State Engineering Laboratory PI Project of Renewable Medicinal Implantation Devices (No.2012NELRMD007)

    孫曉霞. E-mail: sun2x@163.com

    R318.08

    A

    10.7652/jdyxb201601004

    優(yōu)先出版:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20151216.1843.002.html(2015-12-16)

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