負(fù)向調(diào)節(jié)因子重編程誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島內(nèi)分泌細(xì)胞分化的研究

李宏圖，林學(xué)文，李彩虹，龐希寧

（1.中國醫(yī)科大學(xué)國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)教研室，沈陽110013；2.遼寧省計(jì)劃生育科學(xué)研究院，國家生和計(jì)劃生育委員會遺傳與生殖健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽110031）

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負(fù)向調(diào)節(jié)因子重編程誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島內(nèi)分泌細(xì)胞分化的研究

李宏圖1，2，林學(xué)文1，李彩虹1，龐希寧1

（1.中國醫(yī)科大學(xué)國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)教研室，沈陽110013；2.遼寧省計(jì)劃生育科學(xué)研究院，國家生和計(jì)劃生育委員會遺傳與生殖健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽110031）

摘要目的重編程誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）向胰島內(nèi)分泌細(xì)胞分化并探討其可能的分化機(jī)制。方法原代培養(yǎng)的大鼠骨髓MSCs經(jīng)分離、培養(yǎng)至第3代后，用負(fù)向調(diào)節(jié)因子Rest/Nrsf、Shh慢病毒干擾載體轉(zhuǎn)染并培養(yǎng)10 d，通過實(shí)時定量RT?PCR和免疫熒光檢測胰島細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果MSCs慢病毒轉(zhuǎn)染后，胰島素、胰高血糖素及生長抑素的表達(dá)明顯升高，并表達(dá)胰島內(nèi)分泌細(xì)胞分化的相關(guān)基因。結(jié)論通過轉(zhuǎn)染shRest/Nrsf、shShh慢病毒載體能夠誘導(dǎo)大鼠MSCs向胰島內(nèi)分泌細(xì)胞分化，EGFR、ERK1、MMP以及PI3K等參與這一分化過程。

關(guān)鍵詞骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；負(fù)向調(diào)節(jié)因子；慢病毒載體；胰島內(nèi)分泌細(xì)胞

網(wǎng)絡(luò)出版地址

Invitro Reprogrammingof Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cellsinto Pancreatic Endocrine Cellsby Negative Regulators

LIHong?tu1，2，LINXue?wen1，LICai?hong1，PANGXi?ning1

（1.Kdy Laboratoryof Cell Bilolgy，National Healthand Family Planming Commission，Departmentof Stem Cellsand Regenerative Medicine，China Medical University，Shenyang 110013，China；2.Liaoning Province Research Institute of Family Planning，Key Laboratory of Reproductive Health and Medical Genetics，National Health and Family Planning Commission，of Liaoning Province，Shenyang110031，China）

Abstract Objective To induce insulin?producing cells from rat bone marrow?derived mesenchymal stem cells（MSCs）in vitro by suppressing two repressor genes repressor element?1 silencing transcription factor/neuron?restrictive silencer factor（Rest/Nrsf）and sonic hedgehog（Shh），and discuss the possible mechanism.Methods Rat bone marrow?derived MSCs were separated and cultured to the third generation，and then transfect?ed with the shRest/Nrsf and shShhlentivirus vectors and cultured for another ten days.Real?time quantitative RT?PCR and immunofluorescent assay were employed to detect related gene expression of islet cell differentiation.Results Insulin，glucagon and somatostatin increased significantly after lentivirus transfection，and pancreas islet endocrine cell differentiation related genes were expressed .Conclusion Rat MSCs can be induced to is?let endocrine cell differentiation by cotransfection of shRest/Nrsf and shShh lentivirus vectors.ERK1，MMP，EGFR，PI3K are involved in this pro?cessofdifferentiation.

Keywords mesenchymal stem cells；negative regulators；lentivirus vector；pancreatic endocrine lineage cells

糖尿病是世界范圍內(nèi)的常見病、多發(fā)病，嚴(yán)重威脅人類健康。徹底治愈的最佳方法是胰島或胰腺移植，但是供體不足和免疫排斥反應(yīng)限制了其廣泛應(yīng)用［1］。作為干細(xì)胞治療的重要細(xì)胞來源之一，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有易于體外擴(kuò)增和基因修飾等優(yōu)點(diǎn)［2］，同時具有多項(xiàng)分化潛能［2～4］。目前，有報道MSCs可誘導(dǎo)分化為胰島細(xì)胞［5～7］，但誘導(dǎo)帶有一定的盲目性。也有文獻(xiàn)［8～10］報道重編程可誘導(dǎo)MSCs分化為胰島細(xì)胞，但通常關(guān)注的都是正向調(diào)節(jié)因子的作用，而負(fù)向調(diào)節(jié)因子在其中的作用并未受到應(yīng)有的重視。前期研究中，本研究組通過轉(zhuǎn)染shRest/Nrsf、shShh慢病毒載體干擾負(fù)向調(diào)節(jié)子Rest/Nrsf和Shh（sonic hedge?hog）的表達(dá)，并轉(zhuǎn)染胰腺十二指腸同源框基因1（pancreatic duodenal homeobox 1，Pdx1）過表達(dá)載體誘導(dǎo)大鼠骨髓MSCs分化為胰島素分泌細(xì)胞［11］。本研究擬嘗試僅通過共轉(zhuǎn)染shRest/Nrsf、shShh慢病毒載體解除胰島分化信號通路的抑制，觀察大鼠MSCs向胰島內(nèi)分泌細(xì)胞分化的情況。

1　材料與方法

1.1材料

低糖DMEM培養(yǎng)基（Gibco BRL公司，美國），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（Hyclone公司，美國），SYBR（R）PrimescriptTMRT?PCR Kit（DRR063M）（TaKaRa公司，日本），Lipofectamine 2000和Trizol試劑盒（Invitrogen公司，美國）；Rest/Nrsf、Shh慢病毒干擾載體包裝系統(tǒng)由pFU?GW?RNAi、pGC?FU重組載體、pHelper 1.0、pHelper 2.0質(zhì)粒組成（上海吉凱生物公司）；胰島素（insulin）、胰高血糖素（glucagon，Gcg）和生長抑素（somatostatin，Sst）抗體（Santa cruz公司，美國）。

Wistar大鼠若干，體質(zhì)量180～220 g，雌雄不限，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部提供。

1.2方法

1.2.1大鼠MSCs的分離培養(yǎng)和鑒定：取2～4月齡Wistar大鼠，頸椎脫位法處死。75%乙醇中浸泡5 min，無菌取出股骨并洗凈。除去股骨兩端，暴露骨髓腔，從股骨一端用5 mL無血清低糖DMEM注射，以離心管收集另一端流出液體。800 r/min離心5 min，棄上清，加入1 mL含10% FBS的低糖DMEM，吹打成單細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第2天棄去未貼壁的細(xì)胞，以后每2 d更換1次培養(yǎng)液，約10 d形成比較大的克隆群，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%融合時繼續(xù)傳代。1.2.2質(zhì)粒構(gòu)建：采用Ambion公司的設(shè)計(jì)軟件，針對大鼠Rest/Nrsf和Shh基因的mRNA序列（Gen?Bank Accession Number：NM_031788，NM_017221）分別設(shè)計(jì)合成3對shRNA序列。通過BLAST同源性分析，排除非特異性抑制其他基因的可能。經(jīng)干擾預(yù)實(shí)驗(yàn)，篩選有效靶序列，最終確定用于構(gòu)建Rest/Nrsf和Shh基因shRNA的靶序列分別為5′?GAAGTGAGAGGCCTGTAAA?3′，5′?GAGGTGCAA AGACAAGTTA?3′。根據(jù)慢病毒干擾載體pFU?GW?RNAi的要求，設(shè)計(jì)正義鏈5′?T（N19）TTCAAGAGA（19N）TTTTTTC?3′，反義鏈5′?TCGAGAAAAAA（N19）TTCAAGAGA（19N）A?3′。其中N19是長度為19 bp的RNA干擾序列，19N為其反向互補(bǔ)序列。經(jīng)退火后連接到慢病毒干擾載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌，挑取陽性克隆并提取質(zhì)粒，經(jīng)HpaⅠ和XhoⅠ雙酶切行PCR及測序鑒定。PCR鑒定陽性克隆的引物序列，上游5′?GCCCCGGTTAATTTGCATAT?3′，下游5′?GAGGCCAGATCTTGGGTG?3′。將這2個質(zhì)粒分別稱為shRest/Nrsf和shShh。

1.2.3慢病毒包裝：將構(gòu)建好的shRest/Nrsf和shShh質(zhì)粒載體分別與2種輔助包裝原件質(zhì)粒載體，按Li?pofectamine 2000說明書共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后8 h更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，制高滴度慢病毒濃縮液，在293T細(xì)胞中測定并標(biāo)定病毒滴度。

1.2.4shRest/Nrsf、shShh慢病毒載體轉(zhuǎn)染骨髓MSCs及誘導(dǎo)分化：將生長狀態(tài)良好的第3代MSCs 以4×104/孔濃度接種于6孔板中，每孔加2 mL培養(yǎng)液，24 h后待細(xì)胞融合度達(dá)30%～50%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染前更換1 mL新鮮培養(yǎng)液，添加polybrene 5 μg/mL，分別加入shRest/Nrsf和shShh慢病毒載體，感染復(fù)數(shù)（multipe of infection，MOI）為80。對照組加入相同量的陰性對照病毒。轉(zhuǎn)染24 h后更換含10%FBS的低糖DMEM，以后每2 d更換1次培養(yǎng)液。48 h后觀察熒光表達(dá)情況。

1.2.5實(shí)時定量RT?PCR檢測相關(guān)基因：用ABI7500型全自動熒光實(shí)時定量PCR系統(tǒng)檢測相關(guān)基因的表達(dá)。選擇管家基因GAPDH進(jìn)行RNA量校正的相對定量法。提取陰性對照組和實(shí)驗(yàn)組第10天的細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。采用相對定量法比較對照組和實(shí)驗(yàn)組基因表達(dá)的變化。引物設(shè)計(jì)序列見表1。反應(yīng)條件：95℃10s；95℃5 s，60℃34 s，40個循環(huán)；95℃15 s；60℃1 min；95℃15 s。

1.2.6免疫細(xì)熒光鑒定：4%多聚甲醛固定MSCs空病毒對照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞爬片，用PBS洗滌（5 min× 2次）。0.3%TritonX?100室溫孵育10 min，PBS洗滌（5 min×3次），5%牛血清白蛋白封閉30 min，分別加入相應(yīng)的insulin、Gcg和Sst一抗，4℃孵育過夜；PBS洗滌（5 min×3次），加入熒光素標(biāo)記的二抗孵育30 min，PBS洗滌（5 min×3次），DAPI核染色，PBS洗滌后進(jìn)行間接熒光檢測。

2　結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)染shRest/Nrsf和shShh慢病毒載體誘導(dǎo)大鼠MSCs形態(tài)發(fā)生明顯改變

原代培養(yǎng)的大鼠骨髓細(xì)胞接種后24 h可見大部分單核細(xì)胞貼壁，原代MSCs呈集落樣生長，10 d左右細(xì)胞達(dá)90%融合，通過不斷地?fù)Q液、傳代，MSCs自然純化，傳至第3代，細(xì)胞形態(tài)基本一致，與成纖維細(xì)胞形態(tài)相似，大部分呈長梭形，排列規(guī)則，呈水草樣（圖1A）。前期研究［11］發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)胞不表達(dá)造血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的典型標(biāo)志分子CD34、CD45和CD14，而主要表達(dá)CD73、CD44和CD90；表明所分離的MSCs不包含造血干/祖細(xì)胞及成熟的造血細(xì)胞，并不屬于內(nèi)皮細(xì)胞，是一群高表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞表面分子的細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后倒置熒光顯微鏡下即可見微弱熒光，表明慢病毒已經(jīng)整合到細(xì)胞基因組并開始表達(dá)綠色熒光蛋白（green fluorescent potein，GFP），隨后熒光表達(dá)越來越強(qiáng)，至96 h后表達(dá)趨于穩(wěn)定，當(dāng)MOI值為80時，感染效率近100%（圖1B）。實(shí)驗(yàn)組MSCs在轉(zhuǎn)染第4天起開始出現(xiàn)明顯的形態(tài)變化，細(xì)胞逐漸由單個散在的長梭形開始收縮，呈片狀生長，隨著突起逐漸收縮、細(xì)胞變圓，核大而圓，核漿比逐漸增加，細(xì)胞折光性強(qiáng)（圖1C、1D）。

表1　實(shí)時定量RT?PCR引物Tab.1 Primers for real time RT?PCR analysis

2.2分化后細(xì)胞的鑒定

實(shí)時定量RT?PCR檢測結(jié)果顯示：Rest/Nrsf和Shh在實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)明顯降低，干擾效率分別為81%和75%。重編程誘導(dǎo)后的細(xì)胞insulin、Gcg和Sst的表達(dá)量均升高（圖2）。免疫熒光結(jié)果也顯示：實(shí)驗(yàn)組中insulin、Gcg和Sst的表達(dá)呈陽性（圖3B），而對照組的表達(dá)則為陰性（圖3A）。胰島細(xì)胞分化相關(guān)基因Slc2a2、Nkx6.1、NeuroD1、ngn3的表達(dá)水平均有不同程度的升高，而成熟的胰島β細(xì)胞的標(biāo)志性基因Pdx1和Mafa未見升高（圖2）。

The phase contrast（A）and fluorescence images（B）of negative control group were captured under a fluorescence microscope.Likewise，the phase con?trast（C）and fluorescence images（D）of genetically manipulated group were captured under the same fluorescence microscope.圖1　轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的形態(tài)×100Fig.1 Morphology of the transfected MSCs×100

圖2　胰島細(xì)胞分化相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的檢測Fig.2　Real?time quantitative RT?PCR analysis of genetically manipulated MSCs for expression genes specific of islet cell development

2.3MSCs向胰島細(xì)胞分化相關(guān)信號分子的表達(dá)

實(shí)時定量RT?PCR檢測結(jié)果顯示：通過轉(zhuǎn)染shRest/Nrsf和shShh慢病毒載體重編程MSCs分化為胰島內(nèi)分泌細(xì)胞的過程中，表皮生長因子（epider?mal growth factor receptor，EGFR）、磷酸肌醇3激酶催化劑γ多肽（phosphoinositide?3?kinase catalytic gamma polypeptide，Pik3cg）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（ma?trix metallopeptidase 2，MMP2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metallopeptidase 9，MMP9）、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal?regulated kinase 1，ERK1）等信號分子的表達(dá)均有升高，與對照組相比，升高倍數(shù)依次為1.6、11.5、92.3、1.9、1.8（圖4）。

3　討論

作為一種新型的病毒載體，慢病毒載體獲得病毒周期短、滴度高，能感染分裂和非分裂的宿主細(xì)胞，還可整合入宿主染色體，實(shí)現(xiàn)外源基因穩(wěn)定長效表達(dá)，同時還具有感染效率高，容納外源性目的基因的片段大，免疫原性小，生物安全性好等優(yōu)點(diǎn)［12］。為了觀察shRest/Nrsf和shShh慢病毒載體轉(zhuǎn)染大鼠骨髓MSCs后的表達(dá)情況，本研究選用了特異性高、易于識別、容易在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行定位觀察及對活細(xì)胞功能沒有不良影響的GFP［13］作為可靠的示蹤標(biāo)記。從而確保了shRest/Nrsf和shShh載體的高效轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定表達(dá)。

本研究中，通過轉(zhuǎn)染shRest/Nrsf和shShh慢病毒載體重編程MSCs，使MSCs形態(tài)發(fā)生明顯的改變，并表達(dá)insulin、Gcg和Sst，說明MSCs經(jīng)重編程被成功誘導(dǎo)向胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞分化；與胰島分化相關(guān)的部分基因表達(dá)升高。其中，Ngn3、NeuroD1表達(dá)于胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞［14］，前者是所有類型胰島內(nèi)分泌細(xì)胞的特化所需要的；而后者則促進(jìn)胰島β細(xì)胞成熟，其缺失將導(dǎo)致胰島β細(xì)胞數(shù)量的減少以及胰島結(jié)構(gòu)的改變。提示shRest/Nrsf和shShh慢病毒載體轉(zhuǎn)染能促使MSCs向胰島內(nèi)分泌細(xì)胞分化。同時，胰島素分泌細(xì)胞的標(biāo)志性基因Nkx6.1、Slc2a2［15］的表達(dá)也有不同程度的提高，表明重編程后的細(xì)胞也有了胰島素分泌細(xì)胞的特征。但相對于Gcg和Sst，insulin的表達(dá)量并不高，這可能與Pdx1、Mafa的不表達(dá)有關(guān)。Pdx1、Mafa是胰島素基因的重要轉(zhuǎn)錄因子，也是胰島β細(xì)胞的標(biāo)志性基因。研究表明，在胰島β細(xì)胞分化成熟過程中，胰島素分泌細(xì)胞需要經(jīng)歷一個由Mafa不表達(dá)到表達(dá)的過渡，且在這一過程中伴隨著Pdx1的高表達(dá)［16］。本研究組在前期研究中通過轉(zhuǎn)染shRest/Nrsf、shShh慢病毒載體和Pdx1過表達(dá)載體使胰島素的分泌明顯增加［11］。本研究中雖然胰島內(nèi)分泌激素表達(dá)升高，但并未檢測到分泌胰島素的明顯升高（數(shù)據(jù)未顯示）。由此推斷，胰島素表達(dá)量低且未分泌胰島素可能與胰島細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Pdx1的未正常表達(dá)有關(guān)。

Immunofluorescence analysis of genetically manipulated rat bone marrow?derived mesenchymal stem cells without（A）or with（B）a combined transfec?tion of shRest/Nrsf and shShh.The manipulated cells at day 10 were fixed and stained with antibodies against insulin，glucagon and somatostatin and vi?sualized with secondary antibody.4′，6?diamidino?2?phenylindole（DAPI）was used to counterstain DNA（blue）.Microphotographs were taken with a fluo?rescence microscope.圖3　免疫熒光檢測陰性對照和被轉(zhuǎn)染的MSCs中胰島素、胰高血糖素及生長抑素的表達(dá)×100 Fig.3 Immunofluorescence analysis of genetically manipulated MSCs×100

本研究為探討MSCs重編程誘導(dǎo)胰島內(nèi)分泌細(xì)胞分化的可能機(jī)制，對可能相關(guān)的信號分子進(jìn)行了檢測。EGFR在整個胰島的發(fā)育過程中都有表達(dá)，是胰島細(xì)胞的增殖、分化及遷移所必需的［17］。在對EGFR敲出轉(zhuǎn)基因小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，EGFR敲出后不僅影響到胰島細(xì)胞的遷移、分化，而且MMP2和MMP9的表達(dá)也降低［18］。本研究中，EGFR、MMP2 和MMP9的表達(dá)均增加，與Miralles等［19］的研究結(jié)果一致。有研究［20］認(rèn)為MMP2和MMP9不是體內(nèi)胰島形成所必需，但可能有其他的MMP替代了MMP2和MMP9的作用。另有研究［21］表明，Pi3k通路參與了胚胎干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞的分化。本研究中，Pik3cg表達(dá)明顯升高，表明在重編程MSCs向胰島內(nèi)分泌細(xì)胞的分化過程中也需要Pi3k信號通路的參與。研究［22］表明，纖連蛋白和層黏連蛋白誘導(dǎo)人MSCs向胰島素分泌細(xì)胞的分化與ERK的激活有關(guān)，本研究中ERK1的表達(dá)水平升高也證實(shí)了這一點(diǎn)。

總之，通過轉(zhuǎn)染shRest/Nrsf和shShh慢病毒載體能夠成功重編程MSCs向胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞分化，此過程涉及多個信號通路和相關(guān)基因。本研究結(jié)果有助于進(jìn)一步了解胰島相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，并為研究胰島細(xì)胞分化的可能機(jī)制提供了新的線索。

圖4　相關(guān)通路信號分子mRNA表達(dá)水平的檢測Fig.4 Real?time quantitative RT?PCR analysis of expression genes specific of related signaling pathways

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（編輯王又冬）

·論著·

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（81370883）；國家基礎(chǔ)研究資助項(xiàng)目（2012CB518 103）；教育部博士基金（20132104110020）；遼寧省科技廳博士啟動基金（2014010534?301）

作者簡介：李宏圖（1977-），男，研究員，博士.通信作者：龐希寧，E-mail：pangxining@126.com

收稿日期：2015-04-03網(wǎng)絡(luò)出版時間：

Doi：10.12007/j.issn.0258-4646.2016.01.001

中圖分類號Q2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號0258-4646（2016）01-0001-06