結(jié)核分枝桿菌mpt64基因突變研究

毛欣茹，張詩蒙，尹小毛

(1、南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，廣東廣州510515；2、深圳市蛇口人民醫(yī)院，廣東深圳518067；3、南方醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院，廣東廣州510900)

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結(jié)核分枝桿菌mpt64基因突變研究

毛欣茹1，張詩蒙2，尹小毛3

(1、南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，廣東廣州510515；2、深圳市蛇口人民醫(yī)院，廣東深圳518067；3、南方醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院，廣東廣州510900)

摘要:目的分析結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）mpt64基因突變情況。方法提取MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv 和45株MTB臨床株的DNA，擴(kuò)增mpt64基因并進(jìn)行序列分析。結(jié)果MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv和44株MTB臨床株的mpt64基因無突變，1株MTB臨床分離株的mpt64基因存在63個堿基的缺失突變。結(jié)論結(jié)核分枝桿菌mpt64基因突變頻率低。

關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌；mpt64基因；突變分析；非結(jié)核分枝桿菌

結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）在生長早期會分泌一些特異蛋白，其中包括分泌量較大的MPT64蛋白[1，2]。近年來，該蛋白作為MTB的生長指示蛋白在分枝桿菌的鑒別中發(fā)揮了重要作用，目前臨床實驗室通過檢測培養(yǎng)基中是否存在該靶蛋白就能輕松實現(xiàn)MTB的快速鑒定[3，4]。此外，MTB分泌的MPT64蛋白可刺激被感染者產(chǎn)生針對該蛋白的特異性抗體，實驗人員通過檢測患者血清中的抗MPT64抗體即可為臨床結(jié)核病的診斷提供參考依據(jù)[5]。mpt64基因為MPT64蛋白的編碼基因，該基因突變后表達(dá)的突變型蛋白與野生型蛋白在抗原特性上存在較大差異，從而可導(dǎo)致MTB的鑒定和抗MPT64抗體的檢測出現(xiàn)假陰性結(jié)果。基于上述背景，本研究對MTB臨床菌株的mpt64基因突變情況進(jìn)行了初步分析，現(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1菌株MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv由深圳市慢性病防治中心惠贈，45株MTB臨床株分離自結(jié)核病患者的痰液或支氣管肺泡灌洗液，均通過生化反應(yīng)和分子鑒定相結(jié)合的方法鑒定為MTB。

1.2試劑DNA提取液購自德國QIAGEN公司，Capilia TB assay MPT64檢測試劑盒購自杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司，Takara TaqTM普通PCR試劑購自大連寶生生物公司。

1.3 DNA的提取刮取少許菌落于滅菌水中并配制成1個麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?，接著?ml菌懸液至1.5ml微量離心管中，然后10000g離心5min。離心后棄掉上清液并加入40μl DNA提取液，振蕩混勻后置100℃裂解15min，取出冷卻后于13000g離心10min。離心結(jié)束后吸取上清液至另一去核酸的1.5ml微量離心管中，放置于-20℃處保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 mpt64基因序列分析參照文獻(xiàn)[6]合成PCR上下游擴(kuò)增引物，上游引物為5'-CAGGCATCGTCGT CAGCAGC-3'，下游引物為5'-GTCCTCGCGAGTC TAGG CCA-3'。PCR反應(yīng)總體積為50μl，包括5μl10×PCR Taq Buffer、4μl 2.5mM dNTP溶液、50μM引物各0.5μl、1.25U Taq DNA聚合酶和2μl模板溶液。PCR反應(yīng)管置于Mastercycler ep gradient thermocycler中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2min，94℃變性15s、60℃退火15s、72℃延伸30s共30個循環(huán)，72℃補(bǔ)齊1min。擴(kuò)增結(jié)束后采用1%的瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，然后將片段大小符合且亮度高的PCR產(chǎn)物送華大基因公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果采用Chromas 2軟件進(jìn)行觀察，DNA序列采用DNAMAN軟件進(jìn)行比對分析。

1.5 MPT64蛋白檢測于無菌試管中加入0.2ml滅菌生理鹽水，用一次性接種環(huán)在轉(zhuǎn)種培養(yǎng)基上刮取少許菌落并轉(zhuǎn)移至生理鹽水中。將菌落研磨均勻后配制成1個麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?，靜置3～5min備用。拆開已恢復(fù)至常溫的Capilia TB assay MPT64檢測試劑盒，取出檢測板并進(jìn)行編號。吸取100μl菌懸液加入到檢測板的圓形加樣孔中，靜置15min后觀察結(jié)果。觀察孔的控制線處出現(xiàn)紫紅色條帶后判讀結(jié)果，否則需更換檢測板后重新進(jìn)行檢測。檢測線處出現(xiàn)紅色或紫紅色條帶表明MPT64蛋白檢測陽性，檢測線處無紫紅色條帶出現(xiàn)表明菌懸液中不含MPT64蛋白。

2　結(jié)果

MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv和44株MTB臨床株的mpt64基因無突變，其擴(kuò)增片段長度為817bp。1株MTB臨床分離株的mpt64基因存在63個堿基的缺失突變（66位到86位氨基酸），故其擴(kuò)增出的片段長度只有731bp；當(dāng)用MPT64蛋白檢測試劑對該株MTB的生長濾液進(jìn)行檢測時，其測定結(jié)果為陰性。

3　討論

MPT64蛋白是MTB特異性分泌蛋白，在非結(jié)核分枝桿菌（nontuberculous mycobacteria，NTM）的培養(yǎng)濾液中沒有被發(fā)現(xiàn)或含量很低，故該蛋白被視為一種理想的可用于MTC和NTM鑒別的蛋白標(biāo)志物。上世紀(jì)末研究人員應(yīng)用膠體金標(biāo)記的抗MPT64單克隆抗體開發(fā)了一種用于MPT64蛋白檢測的膠體金免疫層析試劑盒，并將其用于分枝桿菌培養(yǎng)物的檢測，實現(xiàn)了MTC與NTM的快速鑒別[1]。此后十多年間大量的研究證實，這種檢測試劑盒在鑒別MTC與NTM方面都具有很好的靈敏度和特異度，可替代傳統(tǒng)方法用于臨床實驗室中分枝桿菌的快速鑒別[7－11]。

另一方面，膠體金免疫層析法鑒別MTC和 NTM時產(chǎn)生的假陰性結(jié)果也逐漸引起研究人員和臨床實驗室專家的注意[12]。其主要原因是對mpt64基因存在突變的MTC菌株缺乏準(zhǔn)確鑒別的能力，因基因突變導(dǎo)致表達(dá)的MPT64蛋白發(fā)生序列和結(jié)構(gòu)改變，從而不能被特異結(jié)合野生型MPT64蛋白的單克隆抗體所識別，最終導(dǎo)致MPT64檢測產(chǎn)生假陰性結(jié)果。因而在鑒別MTC和NTM時，一些分泌突變型MPT64蛋白的MTC菌株就會因假陰性結(jié)果而被錯誤鑒別為NTM[13]。

本研究采用測序方法對45株MTB臨床株的mpt64基因進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)該基因在絕大多數(shù)MTB臨床菌株中均未發(fā)生突變，這說明mpt64基因的突變頻率很低，該基因突變不會對臨床應(yīng)用MPT64蛋白檢測來鑒別分枝桿菌產(chǎn)生影響。另一方面，1株MTB的mpt64基因存在43位到63位氨基酸共63個堿基的缺失，這種缺失突變在之前的文獻(xiàn)中已有報道[13]。已有研究對MPT64檢測陰性的MTB菌株進(jìn)行mpt64基因突變分析，除發(fā)現(xiàn)上述的缺失突變外，還發(fā)現(xiàn)了一些其它突變類型，包括堿基插入、堿基替換和其它位點的堿基缺失等[14，15]。這些突變均可導(dǎo)致表達(dá)的MPT64分泌蛋白與野生型MPT64蛋白在結(jié)構(gòu)上出現(xiàn)差異，從而使突變型MPT64蛋白不能被膠體金免疫層析試劑中的抗MPT64單克隆抗體識別，最終導(dǎo)致MPT64檢測假陰性結(jié)果的出現(xiàn)[16]。

綜上所述，現(xiàn)有研究表明mpt64基因突變的MTB菌株比例較低，因此不會影響到膠體金免疫層析法鑒別MTC和NTM的性能和其在臨床實驗室的應(yīng)用價值。但是，臨床實驗室在應(yīng)用該方法的同時，需嚴(yán)密監(jiān)測mpt64基因突變MTB菌株比例的上升幅度，如果該類菌株的比例升高到一定程度并對膠體金免疫層析法的鑒別性能產(chǎn)生明顯影響時，臨床實驗室必須對該方法重新進(jìn)行性能評價并決定是否繼續(xù)使用。

參考文獻(xiàn)

[1]Abe C，Hirano K，Tomiyama T. Simple and rapid identification of the Mycobacterium tuberculosis complex by immunochromatographic assay using anti－MPB64 monoclonal antibodies [J]. J Clin Microbiol，1999，37(11)：3693－3697.

[2]尹小毛，謝貝，羅春明，等.應(yīng)用MPT64檢測建立結(jié)核分枝桿菌藥敏新方法的初步探索[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué)，2011，29(4)：371－372.

[3]Yin X，Zheng L，Lin L，et al. Commercial MPT64－based tests for rapid identification of Mycobacterium tuberculosis complex：a meta－analysis[J]. J Infection，2013，67(5)：369－377.

[4]Gaillard T，F(xiàn)abre M，Martinaud C，et al. Assessment of the SD Bioline Ag MPT64 Rapid and the MGIT TBc identification tests for the diagnosis of tuberculosis[J]. Diagn Micr Infec Dis，2011，70(1)：154-156.

[5]Bekmurzayeva A，Sypabekova M，Kanayeva D. Tuberculosis diagnosis using immunodominant，secreted antigens of Mycobacterium tuberculosis[J]. Tuberculosis，2013，93(4)：381-388.

[6]Li H，Ulstrup JC，Jonassen TO，et al. Evidence for absence of the MPB64 gene in some substrains of Mycobacterium bovis BCG[J]. Infec Immun，1993，61(5)：1730-1734.

[7]Brent AJ，Mugo D，Musyimi R，et al. Performance of the MGIT TBc identification test and meta-analysis of MPT64 assays for identification of the Mycobacterium tuberculosis complex in liquid culture [J]. J Clin Microbiol，2011，49(12)：4343-4346.

[8]Muyoyeta M，de Haas PEW，Mueller DH，et al. Evaluation of the Capilia TB Assay for Culture Confirmation of Mycobacterium tuberculosis Infections in Zambia and South Africa[J]. J Clin Microbiol，2010，48(10)：3773-3775.

[9]Hillemann D，Rusch -Gerdes S，Richter E. Application of the Capilia TB assay for culture confirmation of Mycobacterium tuberculosis complex isolates [J]. Int J Tuberc Lung Dis，2005，9(12)：1409-1411.

[10]Martin A，Bombeeck D，Mulders W，et al. Evaluation of the TB Ag MPT64 Rapid test for the identification of Mycobacterium tuberculosis complex[J]. Int J Tuberc Lung Dis，2011，15(5)：703-705.

[11]Park MY，Kim YJ，Hwang SH，et al. Evaluation of an immunochromatographic assay kit for rapid identification of Mycobacterium tuberculosis complex in clinical isolates[J]. J Clin Microbiol，2009，47(2)：481-484.

[12]Hasegawa N，Miura T，Ishii K，et al. New simple and rapid test for culture confirmation of Mycobacterium tuberculosis complex：a multicenter study[J]. J Clin Microbiol，2002，40(3)：908-912.

[13]Hirano K，Aono A，Takahashi M，et al. Mutations including IS6110 insertion in the gene encoding the MPB64 protein of Capilia TB-negative Mycobacterium tuberculosis isolates[J]. J Clin Microbiol，2004，42(1)：390-392.

[14]Yu MC，Chen HY，Wu MH，et al. Evaluation of the rapid MGIT TBc identification test for culture confirmation of Mycobacterium tuberculosis complex strain detection[J]. J Clin Microbiol，2011，49 (3)：802-807.

[15]Lu PL，Yang YC，Huang SC，et al. Evaluation of the Bactec MGIT 960 system in combination with the MGIT TBc identification test for detection of Mycobacterium tuberculosis complex in respiratory specimens[J]. J Clin Microbiol，2011，49(6)：2290-2292.

[16]Martin A，Bombeeck D，F(xiàn)issette K，et al. Evaluation of the BD MGIT TBc Identification Test (TBc ID)，a rapid chromatographic immunoassay for the detection of Mycobacterium tuberculosis complex from liquid culture [J]. J Microbiol Meth，2011，84 (2)：255-257.

Study on mpt64 gene mutation of Mycobacterium tuberculosis

MAO Xinru1，ZHANG Shimeng2，YIN Xiaomao3. 1.Nanfang Hospital of Southern Medical University，Guangzhou 510515，China；2.Shenzhen Shekou People’s Hospital，Shenzhen Guangdong 518067，China；3.The Fifth Affiliated Hospital of Southern Medical University，Guangzhou 510900，China.

Abstract：Objective To investigate the mpt64 gene mutation situation of Mycobacterium tuberculosis (MTB). Methods DNA extraction was performed from reference strain H37Rv and 45 clinical MTB isolation strains. Then the amplification and sequencing of mpt64 gene were accomplished. Results No mution of mpt64 gene was found in H37Rv and clinical isolation strains except for one clinical MTB strain had a deletion of 63 nucleotides. Conclusion The mutation prevalence of mpt64 gene of MTB is low.

Key words:Mycobacterium tuberculosis；mpt64 gene；Mutation analysis；Nontuberculous mycobacteria

(收稿日期2016-01-07；修回日期2016-03-22)

通信作者：尹小毛，男，1981年10月出生，主管技師，博士研究生，主要研究方向為感染性疾病的快速診斷。

作者簡介：毛欣茹，女，1989年2月出生，技師，碩士研究生，主要研究方向為感染性疾病的快速診斷。

基金項目：廣東省省級科技計劃項目（2014A020212173），南方醫(yī)科大學(xué)科研啟動計劃項目（C1031780）

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.02.003

中圖分類號：R378.91，Q523

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1674-1129(2016)02-0137-03