松樹(shù)響應(yīng)松材線蟲(chóng)侵染的分子特征

徐亮，劉振宇，李中新，理永霞，呂全，張星耀*

1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所，北京1000912.南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京2100373.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山東泰安2710184.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)編輯部，山東泰安721018

松樹(shù)響應(yīng)松材線蟲(chóng)侵染的分子特征

徐亮1，2，劉振宇2，3*，李中新4，理永霞1，2，呂全1，2，張星耀1，2*

1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所，北京100091
2.南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京210037
3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山東泰安271018
4.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)編輯部，山東泰安721018

松材線蟲(chóng)病是松屬樹(shù)種的重大病害之一，“松樹(shù)-松材線蟲(chóng)”互作的分子機(jī)制是病害監(jiān)測(cè)與防控的基礎(chǔ)。近年來(lái)，隨著新發(fā)展分子研究技術(shù)的介入，學(xué)者們揭示了松樹(shù)應(yīng)答松材線蟲(chóng)侵染的系列分子特征，主要包括氧化脅迫、解毒、病程相關(guān)、次生代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等方面。本文對(duì)此進(jìn)行綜合評(píng)述，以期為“松樹(shù)-松材線蟲(chóng)”互作的分子機(jī)制研究提供重要參考。

松材線蟲(chóng)；侵染；分子特征

松材線蟲(chóng)病由松材線蟲(chóng)［Bursaphelenchus xylophilus（Steiner et Buhrer）Nickle］侵染引起的世界性病害，是以病原松材線蟲(chóng)為主導(dǎo)，寄主松樹(shù)、媒介天牛傳播、人為參與等因素綜合的復(fù)雜病害系統(tǒng)［1，2］。1905年在日本首次發(fā)現(xiàn)，目前主要分布在中國(guó)、日本、韓國(guó)、墨西哥、葡萄牙、加拿大、美國(guó)等國(guó)家［1-5］，尤其在東亞地區(qū)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)損失。在日本曾造成每年1，000，000m3松樹(shù)死亡［6］，截止2005年已在韓國(guó)造成7，811 ha松樹(shù)死亡［7］，在中國(guó)其引起的經(jīng)濟(jì)損失約合2.5億人民幣［1，2］。

松材線蟲(chóng)病是我國(guó)一種重要的外來(lái)入侵有害生物，自1982年傳入以來(lái)，其擴(kuò)散速度和范圍越來(lái)越大。至2016年，我國(guó)的江蘇、浙江、江西、山東、安徽、福建、河南、湖南、湖北、廣東、廣西、重慶、貴州、四川和陜西15個(gè)省的多個(gè)區(qū)縣都被列為松材線蟲(chóng)病疫區(qū)；較2015年，有25個(gè)縣區(qū)新發(fā)生松材線蟲(chóng)?。▏?guó)家林業(yè)局2016年第6號(hào)公告）。擴(kuò)散蔓延趨勢(shì)依然存在，防控形勢(shì)嚴(yán)峻，迄需行之有效的防控策略與技術(shù)的形成。

科學(xué)家給予松材線蟲(chóng)病廣泛的關(guān)注。大量研究揭示了松材線蟲(chóng)侵染后松樹(shù)的結(jié)構(gòu)和生理生化響應(yīng)，近年來(lái)，松樹(shù)響應(yīng)松材線蟲(chóng)侵染的分子特征也逐步被闡釋。本文即圍繞松樹(shù)響應(yīng)松材線蟲(chóng)侵染所發(fā)生的分子事件，對(duì)國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究進(jìn)行綜合論述，以期為理解“松樹(shù)-松材線蟲(chóng)”互作機(jī)制，及為下一步從分子水平上深入開(kāi)展“松樹(shù)-松材線蟲(chóng)”互作機(jī)制研究提供參考。

1　感染松材線蟲(chóng)侵染的主要樹(shù)種

松材線蟲(chóng)寄主范圍廣，研究揭示，松材線蟲(chóng)能夠侵染包括松屬（Pinus spp.）、落葉松屬（Larix spp.）、云杉屬（Picea spp.）、雪松屬（Cedrus spp.）等多屬植物。其中松屬植物是最主要的寄主，包括馬尾松（P.massoniana）、日本黑松（P.thunbergii）、日本赤松（P.densiflora）、濕地松（P.elliottii）、白皮松（P.bungeana）、華南五針?biāo)桑≒.kwuangtungensis）、琉球松（P.luchuensis）、歐洲黑松（P. nigra）、海岸松（P.pinaster）、歐洲赤松（P.sylvestris）和意大利松（P.pinea）等［1-5］。

松樹(shù)感染松材線蟲(chóng)侵染后，其發(fā)病過(guò)程分為早期、晚期兩個(gè)階段。早期階段，在接種點(diǎn)附近出現(xiàn)典型癥狀，皮層韌皮組織和形成層壞死，皮層樹(shù)脂道破壞，樹(shù)脂道周?chē)钠颖”诩?xì)胞創(chuàng)傷周邊形成以及乙烯釋放。晚期階段，乙烯大量產(chǎn)生，形成層破壞以及木栓化增加，最終導(dǎo)致針葉枯萎，樹(shù)木死亡［8］。伴隨著主要癥狀的發(fā)展，過(guò)敏反應(yīng)啟動(dòng)，導(dǎo)致酚的釋放，毒素和植物抗毒素的合成以及木質(zhì)部和其他組織的分離，最后管胞充滿(mǎn)樹(shù)脂油和毒性物質(zhì)［9，10］。隨著這些特征的揭示，其分子機(jī)制也逐步被發(fā)現(xiàn)。

2　松樹(shù)響應(yīng)松材線蟲(chóng)侵染分子特征研究的主要方法

松樹(shù)響應(yīng)松材線蟲(chóng)侵染的分子特征研究，早期主要采用單基因克隆與功能鑒定的研究策略與方法，發(fā)現(xiàn)了與松樹(shù)抗、感病特征相關(guān)的部分基因及其功能。近年來(lái)，隨著研究技術(shù)的發(fā)展，更多的分子手段用于松樹(shù)響應(yīng)松材線蟲(chóng)侵染的研究。

Shin等［11］采用引物退火控制技術(shù)（Annealing Control Primer System，ACP）以及差異消減雜交技術(shù)（Suppression Subtractive Hybridization，SSH）研究了松材線蟲(chóng)侵染的日本紅松在發(fā)病過(guò)程中的相關(guān)基因表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)一些涉及防衛(wèi)反應(yīng)、次生代謝以及轉(zhuǎn)錄相關(guān)的基因誘導(dǎo)表達(dá)。Santos等［12］采用SSH技術(shù)在松材線蟲(chóng)侵染的意大利松和海岸松鑒定了表達(dá)序列標(biāo)簽，發(fā)現(xiàn)松樹(shù)在分子水平上啟動(dòng)了防衛(wèi)反應(yīng)，涉及氧脅迫、木質(zhì)素和乙烯合成、核酸的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。Santos等［13］進(jìn)一步采用高通量篩選（High ThroughputScreening）發(fā)現(xiàn)在感病海岸松品種中，蘋(píng)果酸脫氫酶、ABA、水分脅迫相關(guān)蛋白以及PAR1等基因高水平表達(dá)，而在不感病意大利松品種中蓖麻蛋白質(zhì)B凝集素、SNARE蛋白以及高遷移率族蛋白等基因高水平表達(dá)。Hirao等［14］構(gòu)建了松材線蟲(chóng)侵染日本黑松的7個(gè)SSH cDNA數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)抗菌肽和病程相關(guān)蛋白等基因的差異表達(dá)特征。Xu等［15］基于SSH技術(shù)，發(fā)現(xiàn)松材線蟲(chóng)侵染早期，馬尾松中參與防衛(wèi)反應(yīng)、ROS積累以及防衛(wèi)信號(hào)誘導(dǎo)產(chǎn)生、增強(qiáng)植物細(xì)胞壁的基因等基因顯著上調(diào)表達(dá)。此外，Kuroda等［16］基于Megasort的珠分離技術(shù)（MegasortBeads Technology）發(fā)現(xiàn)從抗病黑松品種中篩選獲得的差異表達(dá)的EST數(shù)量是感病品種的3倍，認(rèn)為抗病品種在線蟲(chóng)侵染時(shí)啟動(dòng)了防衛(wèi)反應(yīng)，而感病品種防衛(wèi)反應(yīng)基因表達(dá)可能受限制。Nose等［17］使用修飾的長(zhǎng)基因表達(dá)序列標(biāo)簽技術(shù)（Modified Long SAGETechnique）發(fā)現(xiàn)在抗、感病黑松品種中，病程相關(guān)蛋白基因及次生代謝相關(guān)基因表現(xiàn)出響應(yīng)松材線蟲(chóng)侵染的典型特征。這些研究方法與技術(shù)對(duì)系統(tǒng)揭示松樹(shù)響應(yīng)松材線蟲(chóng)侵染的分子特征給予了良好技術(shù)支撐。

3　松樹(shù)響應(yīng)松材線蟲(chóng)侵染的分子特征

3.1氧化脅迫和解毒相關(guān)的分子特征

在松材線蟲(chóng)侵染過(guò)程中，線蟲(chóng)分泌的酶及毒素作用，以及寄主自身的次生代謝物，通常局限在特殊細(xì)胞或亞細(xì)胞位置，進(jìn)而導(dǎo)致了植物細(xì)胞遭受高毒性的氧脅迫［18，19］。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)一些上調(diào)表達(dá)的氧脅迫相關(guān)蛋白在維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡以及環(huán)境脅迫/忍受方面發(fā)揮了重要的作用，并且這些氧脅迫相關(guān)蛋白基因的誘導(dǎo)表達(dá)揭示了活性氧（ROS）的積累以及防衛(wèi)信號(hào)在線蟲(chóng)侵染早期的松樹(shù)體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)而能夠快速誘導(dǎo)防衛(wèi)反應(yīng)基因的表達(dá)［13］。

膜NADPH氧化酶（NOX）系統(tǒng)是H2O2產(chǎn)生的主要來(lái)源之一［20，21］。研究發(fā)現(xiàn)松材線蟲(chóng)侵染松樹(shù)早期（24 h）就會(huì)導(dǎo)致活性氧和丙二醛積累，膜脂過(guò)氧化作用加劇［22］。在松材線蟲(chóng)侵染24 h的海岸松中發(fā)現(xiàn)醛酮還原酶基因誘導(dǎo)表達(dá)，該酶可催化還原松材線蟲(chóng)侵染的松樹(shù)中由于膜脂過(guò)氧化產(chǎn)生的活性碳［13，20，21］；Shin等［11］在線蟲(chóng)侵染7 d的日本紅松中發(fā)現(xiàn)了氧脅迫誘導(dǎo)的NADP依賴(lài)的氧化還原酶上調(diào)表達(dá)。抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）參與了還原H2O2生成H2O的過(guò)程，是植物參與氧化脅迫響應(yīng)的重要分子［23，24］，APX被證實(shí)在線蟲(chóng)侵染的日本紅松里誘導(dǎo)表達(dá)［11］，何龍喜等［25］發(fā)現(xiàn)松材線蟲(chóng)侵染松樹(shù)早期（24 h），APX活性顯著升高。APX的積累進(jìn)一步提供了松材線蟲(chóng)侵染早期松樹(shù)參與活性氧代謝的功能基因響應(yīng)特征。此外，氧化脅迫相關(guān)的黃素單核苷酸還原酶、硫氧還蛋白家族在先前的研究中被證實(shí)與松材線蟲(chóng)侵染相關(guān)，而一個(gè)phox/Bem1（PB1）結(jié)構(gòu)域在線蟲(chóng)侵染的意大利松也高表達(dá)，并且這個(gè)機(jī)構(gòu)域通常在信號(hào)蛋白包括氧化酶、胞質(zhì)因子中被發(fā)現(xiàn)［13，26］。Shin等［11］在松材線蟲(chóng)侵染24 h的日本紅松上發(fā)現(xiàn)金屬硫因蛋白和重金屬相關(guān)蛋白等在松材線蟲(chóng)侵染的松樹(shù)體內(nèi)強(qiáng)烈的誘導(dǎo)表達(dá)，尤其在氧脅迫的組織中高表達(dá)，而Hirao等［14］揭示編碼金屬硫因蛋白的EST序列響應(yīng)松材線蟲(chóng)侵染，在1 d、3 d的敏感黑松體內(nèi)顯著下調(diào)表達(dá)。這些基因它們涉及在金屬的動(dòng)態(tài)平衡以及重金屬的解毒，具有高的活性氧清除能力。

3.2病程相關(guān)蛋白特征

病程相關(guān)蛋白（PR）是寄主植物響應(yīng)病原侵染誘導(dǎo)表達(dá)的一類(lèi)防衛(wèi)相關(guān)蛋白，它們通常積累于侵染處，也被誘導(dǎo)系統(tǒng)表達(dá)［27，28］。研究表明PRs參與了松樹(shù)和松材線蟲(chóng)互作，包括PR-2（β-1，3-葡聚糖酶），PR-3（幾丁質(zhì)酶），PR-4（幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白）以及PR-5（類(lèi)甜蛋白）。Shin等［11］在松材線蟲(chóng)侵染24 h的日本紅松上，發(fā)現(xiàn)編碼PR-2，PR-3以及PR-4的基因表達(dá)上調(diào)。Hirao等［14］在接種松材線蟲(chóng)的感病黑松品種上同樣也發(fā)現(xiàn)PR-5基因高表達(dá)；Nose等［17］研究發(fā)現(xiàn)PR-1和PR-3基因的表達(dá)僅在接種松材線蟲(chóng)的非抗性日本黑松樹(shù)種中檢測(cè)到，PR-2基因在非抗性黑松中的表達(dá)量高于接種的抗性黑松中的表達(dá)量。Hirao等［14］觀察到在感病日本黑松樹(shù)種中，PR-9（過(guò)氧化物酶）基因在松材線蟲(chóng)侵染1 d、3 d高表達(dá)，在抗性黑松樹(shù)種7 d、14 d高表達(dá)。PR-10（類(lèi)核糖核酸酶）基因在松材線蟲(chóng)侵染21 h的日本紅松上發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)［11］，同樣，Hirao等［14］在線蟲(chóng)侵染7 d抗性黑松品種中，也發(fā)現(xiàn)PR-10基因明顯上調(diào)表達(dá)。分析認(rèn)為，PR10可能起到了抵抗松材線蟲(chóng)分泌的纖維素酶、β-1，3-葡聚糖酶以及果膠酸脂裂解酶的作用［29，30］。此外，Santos等［12，13］先后在松材線蟲(chóng)侵染3 h和24 h的海岸松上發(fā)現(xiàn)PR-14（脂轉(zhuǎn)移酶）基因表達(dá)上調(diào)。PR-14作為抗菌肽，除了通過(guò)可能的信號(hào)途徑以及參于角質(zhì)屏障的形成來(lái)增強(qiáng)植物的防御功能外，自身也能通過(guò)改變病原細(xì)菌或真菌細(xì)胞膜的通透性來(lái)殺死或限制病原菌的生長(zhǎng)［31］。

3.3次生代謝相關(guān)分子特征

次生代謝物是針葉物種防衛(wèi)反應(yīng)的重要物質(zhì)，越來(lái)越多的次生代謝相關(guān)基因被發(fā)現(xiàn)在松材線蟲(chóng)侵染松樹(shù)過(guò)程中差異表達(dá)［32-36］。陳玉惠等［22］研究發(fā)現(xiàn)馬尾松植株接種松材線蟲(chóng)早期，苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonialyase，PAL）的活性水平高于對(duì)照；Shin等［11］在線蟲(chóng)侵染24 h的日本紅松上同時(shí)檢測(cè)到查爾酮合酶（Chalcone and stilbene synthase fam ily Protein，CHS）和苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）表達(dá)上調(diào)。苯丙氨酸解氨酶（PAL）位于初生代謝和次生代謝分界處，因此被定位為是苯丙烷類(lèi)化合物代謝的中心酶，該途徑可形成包括植保素、木質(zhì)素和酚類(lèi)化合物等在內(nèi)的抗病次生物質(zhì)；查爾酮合酶則是將苯丙烷類(lèi)代謝途徑引向黃酮類(lèi)合成的第一個(gè)酶。細(xì)胞色素P450涉及在針葉植物樹(shù)脂油的一系列二萜樹(shù)脂酸形成過(guò)程［37，38］，編碼CYP450的基因在線蟲(chóng)侵染1 d、3 d的抗性樹(shù)種被發(fā)現(xiàn)顯著下調(diào)，其下調(diào)表達(dá)可能引起線蟲(chóng)侵染的松樹(shù)內(nèi)二萜樹(shù)脂酸的減少［17］。Abrahams等［39］在非抗性松樹(shù)樹(shù)種發(fā)現(xiàn)線蟲(chóng)侵染引起的活性氧的增加能夠加強(qiáng)編碼無(wú)色花色素加雙氧酶（LDOX）基因的表達(dá)，無(wú)色花色素加雙氧酶（LDOX）在產(chǎn)生凝縮類(lèi)丹寧前體即表兒茶酸的途徑中起作用。Santos等［13］發(fā)現(xiàn)（E）-4-hydroxy-3-methylbut-2-enyldiphosphate（HMB-PP）還原酶以及類(lèi)硫解酶蛋白的編碼基因在松材線蟲(chóng)侵染的海岸松中差異表達(dá)，它們參與了松樹(shù)萜烯次生代謝途徑。此外，Wei等［40］研究發(fā)現(xiàn)，松材線蟲(chóng)侵染30 d時(shí)，抗性馬尾松ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)顯著上調(diào)，揭示了不斷分泌的樹(shù)脂限制了松材線蟲(chóng)的遷移和繁殖。

3.4細(xì)胞壁相關(guān)蛋白特征

細(xì)胞壁相關(guān)蛋白是植物防衛(wèi)病原菌的第一道防線，它們能夠限制線蟲(chóng)的遷移［41，42，43］。木質(zhì)素不僅可以增強(qiáng)細(xì)胞的機(jī)械支持力或抗壓強(qiáng)度，而且與富含羥脯氨酸糖蛋白（HRGP）一起作為結(jié)構(gòu)屏障物保護(hù)細(xì)胞免受病原菌的侵害［14，44，45］。木質(zhì)素被發(fā)現(xiàn)在松材線蟲(chóng)侵染的松樹(shù)中較多形成［45］，Shin等［11］在線蟲(chóng)侵染1 d的日本紅松中發(fā)現(xiàn)咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因上調(diào)表達(dá)，其參與了木質(zhì)素單體的甲基化過(guò)程；而Hirao等［14］觀察到在感病日本黑松樹(shù)種中，羥脯氨酸糖蛋白（HRGPs）、伸展蛋白基因高表達(dá)，其高表達(dá)特征，在感病樹(shù)種中發(fā)生在松材線蟲(chóng)侵染1 d、3 d，但在抗性樹(shù)種中則在7 d、14 d高表達(dá)。Nose等［17］也發(fā)現(xiàn)伸展蛋白家族的編碼基因在松材線蟲(chóng)侵染的非抗性日本黑松樹(shù)種中上調(diào)表達(dá)。Nose等［17］還發(fā)現(xiàn)在線蟲(chóng)侵染1 d的抗、感病樹(shù)種中，木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶（XET）基因表達(dá)下調(diào)。木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶（XET）的作用涉及在纖維素-微纖維素間的葡聚糖交聯(lián)重排引起的細(xì)胞膨脹過(guò)程中調(diào)節(jié)細(xì)胞壁松弛，揭示了線蟲(chóng)侵染過(guò)程中，木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶（XET）下調(diào)表達(dá)限制了木質(zhì)部、韌皮部的膨脹，或者細(xì)胞壁被羥脯氨酸糖蛋白（HRGPs）和伸展蛋白的交聯(lián)作用所固定。

3.5轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的特征

轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子是特異基因表達(dá)的關(guān)鍵因子，并且保證了細(xì)胞響應(yīng)胞內(nèi)、胞外的刺激［46，47］。上述松樹(shù)響應(yīng)松材線蟲(chóng)侵染的差異表達(dá)基因，包括涉及松樹(shù)防衛(wèi)反應(yīng)、氧化脅迫應(yīng)答、次生代謝物形成等基因，這些基因都具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控特征。研究發(fā)現(xiàn)，部分轉(zhuǎn)錄因子在松材線蟲(chóng)侵染的松樹(shù)中發(fā)現(xiàn)特異表達(dá)。在線蟲(chóng)侵染1 d的松樹(shù)中，檢測(cè)到編碼同源域轉(zhuǎn)錄因子、類(lèi)bZIP蛋白以及推測(cè)的包含AP2結(jié)構(gòu)域蛋白的基因特異表達(dá)，而編碼轉(zhuǎn)錄起始因子和推測(cè)的螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子基因在線蟲(chóng)侵染7 d的松樹(shù)中被檢測(cè)到［11］。這些調(diào)節(jié)子在松材線蟲(chóng)侵染的松樹(shù)體內(nèi)的差異表達(dá)，顯示了在松樹(shù)響應(yīng)松材線蟲(chóng)侵染中表現(xiàn)出的轉(zhuǎn)錄調(diào)控特征。當(dāng)然，松樹(shù)響應(yīng)松材線蟲(chóng)侵染的復(fù)雜生理學(xué)和生物化學(xué)反應(yīng)背后，必然有更為復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，因此松樹(shù)體內(nèi)與松材線蟲(chóng)侵染相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子以及它們對(duì)下游基因的調(diào)節(jié)模式在以后的研究中將被更加重視。

4　結(jié)語(yǔ)和展望

松材線蟲(chóng)病是世界性森林重大生物災(zāi)害，松材線蟲(chóng)是重要的外來(lái)入侵有害生物，研究者圍繞“松樹(shù)-松材線蟲(chóng)”互作展開(kāi)了系列研究工作，并取得了長(zhǎng)足進(jìn)展，對(duì)于了解松樹(shù)和松材線蟲(chóng)互作的分子機(jī)制提供了重要信息，對(duì)推動(dòng)松材線蟲(chóng)病的控制具有重要的基礎(chǔ)性意義。松樹(shù)響應(yīng)線蟲(chóng)侵染的分子特征研究，目前，更多的集中在松樹(shù)響應(yīng)松材線蟲(chóng)侵染的基因鑒定上，獲得了跟松樹(shù)抗、感病反應(yīng)相關(guān)的若干基因或者基因的EST。進(jìn)一步，研究者應(yīng)加強(qiáng)這些基因的功能鑒定，深入探討其在松樹(shù)響應(yīng)松材線蟲(chóng)侵染所發(fā)揮的作用。隨著基因組學(xué)、后基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等組學(xué)理論與技術(shù)的不斷發(fā)展，松樹(shù)響應(yīng)松材線蟲(chóng)侵染的分子特征，將會(huì)更多地向系統(tǒng)的水平發(fā)展，基因的功能研究不僅僅局限于單個(gè)基因的作用，單個(gè)路徑中多個(gè)基因的功能的互作，以及多個(gè)路徑的基因功能的交叉，都是值得發(fā)展的研究方向，也是目前松樹(shù)響應(yīng)松材線蟲(chóng)侵染的重要研究?jī)?nèi)容。同時(shí)，在基因功能的深入分析基礎(chǔ)上，開(kāi)展基因在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控研究，對(duì)于了解松樹(shù)響應(yīng)線蟲(chóng)侵染的復(fù)雜機(jī)制具有重要意義。

［1］張星耀，駱有慶.中國(guó)重大森林生物災(zāi)害［M］.北京：中國(guó)林業(yè)出版社，2003：1-46

［2］Jones JT，MoensM，Mota M，etal.Bursaphelenchus xylophilus：opportunities in comparative genomicsandmolecular host-parasite interactions［J］.Mol.PlantPathol.，2008，9：357-368

［3］Yano S.Investigation on pine death in Nagasakiprefecture（in Japanese）［J］.Sanrin-Kouhou，1913，4：1-14

［4］Mamiya Y，Kiyohara T.Description of Bursaphelenchus lignicolus n.sp.（Nematoda：Aphelenchoididae）from pine wood and histopathology ofnematode-infested trees［J］.Nematol.，1972，18：120-124

［5］Huang L，Ye J，Wu X，et al.Detection of pine wood nematode using a real-time PCR assay to target the DNA topoisomerase Igene［J］.Eur.J.PlantPathol.，2010，127：89-98

［6］Forestry Agency.Annual Reporton Trends of Forestand Forestry-Fiscal Year 2003［R］.Forestry Agency：The M inistry of Agriculture，F(xiàn)orestry and Fisheriesof Japan，2004

［7］Shin SC，Han HR.Current status on research and management of pine w ilt disease in Korea.In：Proceedings of the international symposium on current status on research and management of pine w ilt disease［R］.Seoul，Korea，2006：31-40

［8］Fukuda K.Physiologicalprocess of the symptom developmentand resistancemechanism in pinew iltdisease［J］.J.For. Res.，1997，2：171-181

［9］Myers RF.Pathogenesis in pine wilt caused by pinewood nematode，Bursaphelenchus xylophilus［J］.J.Nematol.，1988，20：236-244

［10］Schiffer R，G?rg R，Jarosch B，et al.Tissue dependence and differential cordycepin sensitivity of race-specific resistance responses in thebarley-powderymildew interaction［J］.Mol.PlantM icrobe In.，1997，10：830-839

［11］Shin H，Lee H，Woo KS，etal.Identification of genes upregulated by pinewood nematode inoculation in Japanese red pine［J］.Tree Physiol.，2009，29：411-421

［12］Santos CSS，VasconcelosMW.Identification of genes differentially expressed in Pinus pinaster and Pinus pinea after infectionw ith the pinewood nematode［J］.Eur.J.PlantPathol.，2012，132：407-418

［13］Santos CSS，Pinheiro M，Silva AI，et al.Searching for resistance genes to Bursaphelenchus xylophilus using high throughputscreening［J］.BMCGenomics，2012，13：599-613

［14］Hirao T，F(xiàn)ukatsu E，Watanabe A.Characterization of resistance to pine wood nematode infection in Pinus thunbergii using suppression subtractive hybridization［J］.BMC PlantBiol.，2012，12：13-26

［15］Xu L，Liu ZY，Zhang K，etal.Characterization of the Pinusmassoniana transcriptional Response to Bursaphelenchus xylophilus infectionusing suppression subtractive hybridization［J］.Int.J.Mol.Sci.，2013，14（6）：11356-11375

［16］Kuroda H，Goto S，Kazum i E，et al.The expressed genes of Japanese red pine（Pinus densiflora）involved in the pine wiltdisease severity［J］.BMCProc.，2011，5（Suppl7）：92

［17］Nose M，Shiraishi S.Comparison of the gene expression profiles of resistant and non-resistant Japanese black pine inoculated w ith pinewood nematode using amodified LongSAGE technique［J］.For.Path.，2011，41：143-155

［18］Zhang Q，Bai G，Yang W，et al.Pathogenic cellulase assay of pine w ilt disease and immunological localization［J］. Biosci.Biotechnol.Biochem.，2006，70：2727-2732

［19］Ralph S，Park JY，Bohlmann J，et al.Dirigent proteins in conifer defense：gene discovery，phylogeny，and differential wound-and insect-induced expression of a family of DIR and DIR-likegenes in spruce（Picea spp.）［J］.PlantMol.Biol.，2006，60：21-40

［20］Bedard K，Lardy B，Krause KH.NOX fam ily NADPH oxidases：not just inmammals［J］.Biochim ie，2007，89：1107-1112

［21］Yamauchi Y，Hasegawa A，Taninaka A，etal.NADPH-dependent reductases involved in the detoxification of reactive carbonyls in plants［J］.J.Biol.Chem.，2011，286：6999-7009

［22］陳玉惠.松材線蟲(chóng)與寄主植物互作中的生理生化研究［D］.南京：南京林業(yè)大學(xué)，2002

［23］?akir B，Agasse A，Gaillard C，etal.A grape ASR protein involved in sugar and abscisic acid signaling［J］.PlantCell，2003，15（9）：2165-2180

［24］Van Breusegem F，VranováE，Dat JF，etal.The role of active oxygen species in plantsignal transduction［J］.Plant Sci.，2001，161：405-414

［25］何龍喜，吳小芹，俞祿珍，等.不同抗性松樹(shù)與松材線蟲(chóng)互作中H2O2及其氧化酶活性的差異［J］.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，34（6）：13-17

［26］Hirano Y，Yoshinaga S，Takeya R，etal.Structure of a cell polarity regulator，a complex between atypical PKC and Par 6 PB1 domains［J］.J.Biol.Chem.，2005，280：9653-9661

［27］Scherer NM，Thompson CE，F(xiàn)reitas LB，et al.Patterns of molecular evolution in pathogenesis-related proteins［J］. Genet.Mol.Biol.，2005，28：645-653

［28］Osmond RIW，Hrmova M，F(xiàn)ontaine F，et al.Binding interactions between barley thaumatin-like proteins and （1，3）-β-D-glucans［J］.Eur.J.Biochem.，2001，268：4190-4199

［29］Kikuchi T，Jones JT，Aikawa T，et al.A family of glycosyl hydrolase family 45 cellulases from the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophilus［J］.FEBSLett.，2004，572：201-205

［30］Kikuchi T，Shibuya H，Jones JT.Molecular and biochem ical characterization of an endo-beta-1，3-glucanase from the pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus acquired by horizontal gene transfer from bacteria［J］.Biochem.J.，2005，389：117-125

［31］Kikuchi T，Shibuya H，Aikawa T，et al.Cloning and characterization of pectate lyases expressed in the esophagealgland of the pinewood nematode Bursaphelenchusxylophilus［J］.Mol.PlantM icrobe.Interact.，2006，19：280-287

［32］Kusumoto D，Yonemichi T，Murata M，etal.Histological observations on host responses and nematode distribution in resistantpine trees infected with pinewood nematode，Bursaphelenchus xylophilus（in Japanese）［J］.Tree ForestHealth，2010，14：98-100

［33］Keeling CJ，Bohlmann J.Diterpene resin acids in conifers［J］.Phytochem istry，2006b，67：2415-2423

［34］Ro DK，Bohlmann J.Diterpene resin acid biosynthesis in loblolly pine（Pinus taeda）：Functional characterization of abietadiene/levopimaradiene synthase（PtTPS-LAS）cDNA and subcellular targeting of PtTPS-LAS and abietadienol/ abietadienaloxidase（PtAO，CYP720B1）［J］.Phytochem istry，2006，67：1572-1578

［35］Futai K.Tannin accumulation in the stems of pine seedlings infected with Bursaphelenchus xylophilus or B. mucronatus［M］.Trans.95thAnn.Meet.Jpn.For.Soc.，1984：473-474

［36］FutaiK.Abnormalmetabolites in pinewood nematode-inoculated Japaneseblack pine［J］.Jpn.J.Nematol.，2003，33：45-56

［37］Funk C，Croetau R.Diterpenoid resin acid biosynthesis in conifers：characterization of two cytochrome P450-dependent monooxygenasesandanaldehydedehydrogenaseinvolved inabieticacidbiosynthesis［J］.Arch.Biochem.Biophys.，1994，308：258-266

［38］Ro DK，Arimura GI，Lau SYW，et al.Loblolly pine abietadienol/abietadienal oxidase PtAO（CYP702B1）is a multifunctional，multisubstrate cytochrome P450monooxygenase［J］.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2005，102：8060-8065

［39］Abrahams S，Lee E，Walker AR，etal.The Arabidopsis TDS4 gene encodes leucoanthocyanidin dioxygenase（LDOX）and isessential for proanthocyanidin synthesisand vacuole development［J］.Plant J.，2003，35：624-636

［40］Wei Y，Liu Q，Dong H，et al.Selection of reference genes for real-time quantitative PCR in Pinusmassoniana post nematode inoculation［J］.PLoSOne，2016，11（1）：e0147224

［41］Yamada T.Biochemical responses in pine trees affected by pine w ilt disease.In：Pine W ilt Disease［M］.Tokyo：Springer，2008：223-234

［42］Regente MC，GiudiciAM，Villalaín J，etal.The cytotoxic properties of a plant lipid transfer protein involvemembrane permeabilization of target cells［J］.Lett.Appl.M icrobiol.，2005，40：183-189

［43］Fukuda K，Utsuzawa S，Sakaue D.Correlation between acoustic emission，water status and xylem embolism in pine w iltdisease［J］.Tree Physiol.，2007，27：969-976

［44］Hückelhoven R.Cellwall-associated mechanisms of disease resistance and susceptibility［J］.Annu.Rev.Phytopathol.，2007，45：101-127

［45］Ishida K，Hogetsu T，F(xiàn)ukuda K，etal.Cortical responses in Japanese black pine to attack by the pinewood nematode［J］. Can.J.Bot.，1993，71：1399-1405

［46］ChenW，Provart NJ，Glazebrook J，etal.Expression profilematrix of Arabidopsis transcription factor genes suggests theirputative functions in response to environmental stresses［J］.PlantCell，2002，14：559-574

［47］Ulker B，Somssich IE.WRKY transcription factors：from DNA binding towards biological function［J］.Curr.Opin. PlantBiol.，2004，7：491-498

Molecular Characterization of Pinus spp. Response to the Infection of Bursaphelenchus xylophilus

XU Liang1，2，LIU Zhen-yu2，3*，LIZhong-xin4，LIYong-xia1，2，LV Quan1，2，ZHANG Xing-yao1，2*
1.Research Institute ofForestEcology，Environmentand Protection/Chinese Academy ofForestry，Beijing 100091，China
2.Co-Innovation Centerfor Sustainable Forestry in Sourthern China，Nanjing 210037，China
3.College ofPlantProtection/Shandong AgriculturalUniversity，Tai'an 271018，China
4.EditorialDepartmentofShandong AgriculturalUniversity，Tai'an 271018，China

Pinus pinew ilt disease is one of the key diseases of pines，which is infected by Bursaphelenchus xylophilus.The discorvery of molecular mechanism of pine-B.xylophilus interaction is the basis of disease management.With the developmentof new molecular techniques，a series ofmolecular characteristics of pine responding to B.xylophilus infection have been revealed，including oxidative stress，detoxification，pathogenesis-related proteins，secondary metabolism，transcription regulation，and so on.We discussed these researches in the paper to provide a reference for pine-B.xylophilus interaction studies.

Bursaphelenchus xylophilus；infection；molecular characterization

S763

A

1000-2324（2016）04-0525-06

2013-09-12

2016-05-20

國(guó)家林業(yè)局行業(yè)重點(diǎn)項(xiàng)目資助（項(xiàng)目編號(hào)：200904061）

徐亮（1982-），男，山東煙臺(tái)蓬萊人，博士，主要從事森林病理研究.Xuliang19824@163.com

Author for correspondence.E-mail：cosmosliuchina@gmail.com；E-Mail：zhangxingyao@126.com