羅非魚胰島素樣生長因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)的生物信息學(xué)分析

王偉偉

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院, 山西 太谷 030801)

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羅非魚胰島素樣生長因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)的生物信息學(xué)分析

王偉偉

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院, 山西 太谷 030801)

摘要：為進(jìn)一步研究羅非魚胰島素樣生長因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)的生物學(xué)特征，根據(jù)NCBI上登錄的尼羅羅非魚的IGF-Ⅰ氨基酸序列，利用相關(guān)的軟件對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示，羅非魚IGF-Ⅰ蛋白含有182個(gè)氨基酸，pI為9.65，脂溶指數(shù)為51.98，是不穩(wěn)定的脂溶性親水蛋白。二級(jí)結(jié)構(gòu)中，60.99%為環(huán)，31.32%為螺旋。IGF-Ⅰ蛋白具有信號(hào)肽，含有4個(gè)二硫鍵，具有一個(gè)跨膜區(qū)。IGF-Ⅰ蛋白具有13個(gè)磷酸化、16個(gè)糖基化和12個(gè)泛素化等蛋白質(zhì)翻譯后修飾位點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：羅非魚； IGF-Ⅰ； 生物信息學(xué)

胰島素樣生長因子Ⅰ(Insulin- like growth factor I，IGF-Ⅰ)結(jié)構(gòu)與胰島素很相近，屬于激素家族，主要由肝臟合成，由垂體中的生長激素刺激其在肝臟中合成和釋放，促進(jìn)有絲分裂，可以在不同的靶器官誘導(dǎo)生長和分化[1]。IGF-Ⅰ是一種重要的生長調(diào)節(jié)因子，介導(dǎo)生長激素(Growth hormone，GH)的促生長作用。IGF-l 作為重要的內(nèi)分泌軸GH/IGF的中心[2,3]，可以選擇性地與胰島素樣生長因子受體(insulin-like growth factor-1 receptor，IGF-lR)結(jié)合，作用于生長、分化和繁殖等過程。在硬骨魚類，注射生長激素可以提高肝臟IGF-Ⅰ基因的表達(dá)[4]。IGF-l經(jīng)證實(shí)在許多魚類的性腺細(xì)胞中存在，可能參與了性母細(xì)胞減數(shù)分裂的啟動(dòng)，可以促進(jìn)性腺組織的體細(xì)胞生長。

魚類IGF-l在調(diào)節(jié)生長[5,6]、發(fā)育[7]、繁殖[8]、免疫[9]和代謝[10]等方面發(fā)揮著重要作用，然而IGF-l活性也受到眾多因素的調(diào)節(jié)，蛋白質(zhì)翻譯后修飾就是很重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。本研究擬通過預(yù)測羅非魚蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，為進(jìn)一步研究IGF-l的功能提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1羅非魚IGF-Ⅰ氨基酸序列的獲取

羅非魚IGF-Ⅰ氨基酸序列(AAC17494.1)來源于NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫。

1.2羅非魚IGF-Ⅰ序列的生物學(xué)信息分析

通過表1網(wǎng)站提供的在線軟件對(duì)羅非魚IGF-Ⅰ蛋白的理化性質(zhì)、跨膜區(qū)、信號(hào)肽、蛋白質(zhì)翻譯后修飾、二級(jí)結(jié)構(gòu)、二硫鍵進(jìn)行預(yù)測。

2結(jié)果與分析

2.1IGF-Ⅰ蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)分析

羅非魚IGF-Ⅰ蛋白的基本理化性質(zhì)見表2。由該表可知，IGF-Ⅰ蛋白由182個(gè)氨基酸組成，不穩(wěn)定系數(shù)為63.46，大于40，為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。預(yù)測的羅非魚的等電點(diǎn)為9.65，處于堿性氨基酸的范圍(7.6～11.0)，說明IGF-Ⅰ為堿性蛋白。羅非魚IGF-Ⅰ的總平均親水性為-0.582，脂溶指數(shù)為51.98，說明其為親水性的脂溶蛋白。

2.2IGF-Ⅰ蛋白信號(hào)肽預(yù)測

運(yùn)用SignalP軟件，運(yùn)用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(NN)的算法預(yù)測IGF-Ⅰ蛋白質(zhì)中的信號(hào)肽，結(jié)果如圖1所示，IGF-1信號(hào)肽位點(diǎn)位于第44和45號(hào)氨基酸，即第1至44號(hào)氨基酸為信號(hào)肽。

2.3IGF-Ⅰ蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

PredictProtein預(yù)測結(jié)果如圖2顯示，IGF-Ⅰ的二級(jí)結(jié)構(gòu)中有31.32%的螺旋(Helix)，7.69%的直鏈(Strand)和60.99%的環(huán)(Loop)。

2.4IGF-Ⅰ蛋白二硫鍵預(yù)測

SCRATCH預(yù)測結(jié)果顯示，IGF-Ⅰ蛋白含有11個(gè)半胱氨酸，其中8個(gè)可以形成4個(gè)二硫鍵。參與形成二硫鍵的每對(duì)半胱氨酸的具體位置見表3。

2.5IGF-Ⅰ蛋白跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測

IGF-Ⅰ蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)如圖1所示。經(jīng)HMMTOP 2.0預(yù)測，IGF-Ⅰ蛋白在23～40位氨基酸間具有跨膜性。經(jīng)TMHMM預(yù)測，結(jié)果如圖3，IGF-Ⅰ的20～40位的氨基酸是跨膜區(qū)。

2.6IGF-Ⅰ蛋白的翻譯后修飾

2.6.1O-糖基化位點(diǎn)

通過NetOGlyc 4.0 Server可以得出在羅非魚IGF-Ⅰ氨基酸序列中36、38、40、42、112、114、121、130、131、137、141、148、155、159、170、171這16個(gè)位點(diǎn)均是潛在的O-糖基化位點(diǎn)。

2.6.2N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測

N-連接糖基化就是肽鏈氨基端糖基化，如圖4所示，臨界值是0.5，這個(gè)序列中沒有預(yù)測到N-糖基化位點(diǎn)。

2.6.3磷酸化位點(diǎn)預(yù)測

如圖5所示，預(yù)測共有19個(gè)磷酸化位點(diǎn)，13個(gè)絲氨酸(Ser)，4個(gè)蘇氨酸(Thr)和2個(gè)酪氨酸(Tyr)。

2.6.4泛素化位點(diǎn)位

UbPred對(duì)羅非魚IGF-Ⅰ蛋白泛素化位點(diǎn)的預(yù)測結(jié)果見表4，灰色陰影部分就是潛在的泛素化點(diǎn)賴氨酸(Lys，K)。羅非魚IGF-Ⅰ蛋白有12個(gè)泛素化位點(diǎn)。

2.7三級(jí)結(jié)構(gòu)

在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中沒有找到與尼羅羅非魚IGF-Ⅰ蛋白同源且完整結(jié)構(gòu)的三級(jí)結(jié)構(gòu)模板，通過SWISS-MODEL只預(yù)測出45～112氨基酸的空間結(jié)構(gòu)。如圖6所示，主要由為數(shù)不多的自由卷尺和α-螺旋組成。

3討論與結(jié)論

3.1IGF-Ⅰ蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)和功能

魚類IGF-Ⅰ蛋白不僅與生長有關(guān)，而且參與代謝、發(fā)育、繁殖、滲透調(diào)節(jié)以及免疫過程。IGF-Ⅰ蛋白包含B、C、A、D、E 5個(gè)區(qū)域和信號(hào)肽[2]： B區(qū)域包含29個(gè)氨基酸，C區(qū)域包含10個(gè)氨基酸，A區(qū)域包含21個(gè)氨基酸，D 區(qū)域包含8個(gè)氨基酸，E區(qū)域包含69個(gè)氨基酸，信號(hào)肽包含44個(gè)氨基酸[20]。引導(dǎo)新合成肽鏈轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的一段多肽為信號(hào)肽，信號(hào)肽和E區(qū)域會(huì)被水解酶除去以產(chǎn)生68個(gè)氨基酸的成熟的IGF-Ⅰ，成熟的IGF-Ⅰ被釋放到血液里去發(fā)揮作用[21]。B和A區(qū)域在物種間保守性很強(qiáng)[22]，有助于這些區(qū)域的功能發(fā)揮，如參與IGF-Ⅰ[23]和它的受體以及IGFBP[24]的綁定。IGF-Ⅰ蛋白包含有4個(gè)二硫鍵，二硫鍵是一種比較穩(wěn)定的共價(jià)鍵，由兩個(gè)半胱氨酸(Cys)殘基的2個(gè)硫原子形成，有助于蛋白質(zhì)分子的立體結(jié)構(gòu)的形成。在成熟的肽鏈上有6個(gè)保守的半胱氨酸殘基，2個(gè)在B區(qū)域，4個(gè)在A區(qū)域，在所有的脊椎動(dòng)物上都可以觀察到，它們負(fù)責(zé)維持蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)[21]。

3.2蛋白質(zhì)的翻譯后修飾和IGF-Ⅰ的功能

糖基化是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中上糖基轉(zhuǎn)移酶的控制下進(jìn)行的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，主要蛋白質(zhì)特定氨基酸殘基上結(jié)合糖鏈[25]，是翻譯后修飾最重要的內(nèi)容，在生物體存在糖基化現(xiàn)象的蛋白質(zhì)占到50%以上[26]，包括N-糖基化和O-糖基化兩種形式。O-連接的糖基化是在糖基轉(zhuǎn)移酶催化作用下，在多肽鏈的羥基的氧原子上結(jié)合糖鏈。N-糖基化是在蛋白質(zhì)的天冬酰胺的自由NH2端連接糖鏈。蛋白質(zhì)的糖基化會(huì)影響蛋白質(zhì)的運(yùn)輸、折疊、定位和構(gòu)象的穩(wěn)定性，蛋白質(zhì)經(jīng)糖基化后熱力學(xué)穩(wěn)定性增強(qiáng)，溶解性增加，蛋白質(zhì)受到糖基的保護(hù)，從而免受蛋白酶的降解，蛋白的聚集作用也被抑制。IGF-Ⅰ蛋白沒有N-糖基化位點(diǎn)的存在，有16個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，該蛋白可以通過糖基化改變多態(tài)鏈的結(jié)構(gòu)，增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。

磷酸化是最重要也是最常見的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，在蛋白質(zhì)特定的氨基酸殘基上在磷酸轉(zhuǎn)移酶的作用下加入一個(gè)帶有強(qiáng)負(fù)電的磷酸基團(tuán)，改變了蛋白質(zhì)的構(gòu)型，影響其活性和穩(wěn)定性，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)和信號(hào)傳導(dǎo)等生物學(xué)過程。蛋白質(zhì)磷酸化在絲氨酸(Serine，Ser)上發(fā)生的最多，其次蘇氨酸(Threonine，Thr)，酪氨酸(Tyrosine，Tyr)上發(fā)生的相對(duì)較少[27]。羅非魚的IGF-Ⅰ含有13個(gè)絲氨酸(Ser)，4個(gè)蘇氨酸(Thr)和2個(gè)酪氨酸(Tyr)，該蛋白可以通過在這些位點(diǎn)發(fā)生磷酸化來改變蛋白活性，從而調(diào)控生物學(xué)過程。

泛素化是泛素分子在泛素激活酶、連結(jié)酶和結(jié)合酶等酶作用下將細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)分類，再篩選出靶蛋白分子進(jìn)行特異性修飾，有利于蛋白質(zhì)的定位、代謝、調(diào)節(jié)、降解等功能的發(fā)揮[28]。在羅非魚IGF-Ⅰ蛋白中預(yù)測到有12個(gè)泛素化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)可能影響IGF-Ⅰ蛋白的功能或者改變蛋白的活性，使其生物學(xué)效應(yīng)發(fā)生改變。

本研究分析尼羅羅非魚IGF-Ⅰ蛋白的特征為：loop環(huán)和α螺旋是主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)，是一次跨膜的蛋白，也是親水性的脂溶蛋白，有多個(gè)O-糖基化和磷酸化的蛋白質(zhì)翻譯后修飾位點(diǎn)，為進(jìn)行IGF-Ⅰ蛋白的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]Reinecke M, Collet C. The phylogeny of the insulin-like growth factors [J]. Int Rev Cytol, 1998, 183:1-94.

[2]Moriyama S, Ayson FG, Kawauchi H. Growth regulation by insulin-like growth factor-I in fish [J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2000, 64(8):1553-1562.

[3]Peterson BC, Waldbieser GC, Bilodeau L. IGF-I and IGF-II mRNA expression in slow and fast growing families of USDA103 channel catfish (Ictaluruspunctatus) [J]. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol, 2004, 139(3):317-323.

[4]Reinecke M, Bj?rnsson BT, Dickhoff WW, et al. Growth hormone and insulin-like growth factors in fish: where we are and where to go [J]. Gen Comp Endocrinol, 2005, 142(1-2): 20-24.

[5]Zhang H, Tong FD, Lu QE. Molecular cloning of Insulin-like Growth Factor-I from triangular bream (Megalobramaterminalis) [J]. Appl Biochem Biotechnol, 2008, 150(1):15-24.

[6]Degger B, Upton Z, Soole K. Comparison of recombinant barramundi and human insulin-like growth factor (IGF)-I in juvenile barramundi (Latescalcarifer): in vivo metabolic effects, association with circulating IGF-binding proteins, and tissue localization [J]. Gen Comp Endocrinol, 2000,117:395-403.

[7]Pozios KC, Ding J, Degger B, et al. IGFs stimulate zebrafish cell proliferation by activating MAP kinase and PI3-kinase-signaling pathways [J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2001, 280(4):1230-1239.

[8]Weber GM, Sullivan CV. Effects of insulin-like growth factor-I on in vitro final oocyte maturation and ovarian steroidogenesis in striped bass,Moronesaxatilis[J]. Biol Reprod, 2000, 63(4):1049-1057.

[9]Deane EE, Woo NY. Modulation of beta-actin, insulin-like growth factor 1 and glucose-6-phosphate dehydrogenase gene expression during vibriosis of sea bream, Sparus (Rhabdosargus) sarba Forssk?l [J]. J Fish Dis, 2005, 28(10):593-601.

[10]Castillo J, Codina M, Martínez ML, et al. Metabolic and mitogenic effects of IGF-I and insulin on muscle cells of rainbow trout [J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2004, 286(5): 935-941.

[11]Wilkins MR, Gasteiger E, Bairoch A, et al. Protein identification and analysis tools in the ExPASy server [J]. Methods Mol Biol, 1999,112:531-552.

[12]K?ll L, Krogh A, Sonnhammer EL. A combined transmembrane topology and signal peptide prediction method [J]. J Mol Biol, 2004, 338(5):1027-1036.

[13]K?ll L1, Krogh A, Sonnhammer EL. A combined transmembrane topology and signal peptide prediction method [J]. J Mol Biol, 2004, 338(5):1027-1036.

[14]Petersen TN, Brunak S, Heijne G, et al. SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions [J]. Nat Methods, 2011, 8(10): 785-786.

[15]Julenius K, M?lgaard A, Gupta R, et al. Prediction, conservation analysis, and structural characterization of mammalian mucin-type O-glycosylation sites [J]. Glycobiology, 2005, 15(2): 153-164.

[16]Lam PV, Goldman R, Karagiannis K, et al. Structure-based comparative analysis and prediction of N-linked glycosylation sites in evolutionarily distant eukaryotes [J]. Genomics Proteomics Bioinformatics, 2013, 11(2):96-104.

[17]Blom N, Gammeltoft S, Brunak S. Sequence and structure-based prediction of eukaryotic protein phosphorylation sites [J]. J MolBiol, 1999, 294(5): 1351-1362.

[18]Rost B, Yachdav G, Liu J. The PredictProtein server [J]. Nucleic Acids Res, 2004, 32 (Web Server issue): W321-326.

[19]Cheng J, Saigo H, Bldi P. Large-scale prediction of disulphide bridges using kernel methods, two-dimensional recursive neural networks, and weighted graph matching [J]. Proteins, 2006, 62(3):617-629.

[20]黃建峰，廖志勇. 胰島素樣生長因子結(jié)構(gòu)與生理功能[J]. 科協(xié)論壇, 2011(3):59-60.

[21]Zhang DC, Huang YQ, Shao YQ, et al. Molecular cloning, recombinant expression, and growth-promoting effect of mud carp (Cirrhinusmolitorella) insulin-like growth factor-I [J]. Gen Comp Endocrinol, 2006, 148(2):203-212.

[22]Escobar S, Fuentes EN, Poblete E, et al. Molecular cloning of IGF-1 and IGF-1 receptor and their expression pattern in the Chilean flounder (Paralichthysadspersus) [J].Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol, 2011,159(3):140-147.

[23]Bayne ML, Applebaum J, Chicchi GG, et al. The roles of tyrosines 24, 31, and 60 in the high affinity binding of insulin-like growth factor-I to the type 1 insulin-like growth factor receptor [J]. J Biol Chem, 1990, 265(26):15648-15652.

[24]Clemmons DR, Dehoff ML, Busby WH, et al. Competition for binding to insulin-like growth factor (IGF) binding protein-2, 3, 4, and 5 by the IGFs and IGF [J]. Endocrinology, 1992, 131(2):890-895.

[25]Furukawa K, Kobata A. Protein glycosylation [J]. Curr Opin Biotechnol, 1992, 3(5):554-559.

[26]Ohtsubo K, Marth JD. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease [J]. Cell, 2006, 126(5):855-867.

[27]Kim JH, Lee J, Oh B, et al. Prediction of phosphorylation sites using SVMs[J]. Bioinformatics, 2004, 20(17):3179-3184.

[28]盧亮, 李棟, 賀福初. 蛋白質(zhì)泛素化修飾的生物信息學(xué)研究進(jìn)展[J]. 遺傳, 2013, 35(1): 17-26.

(編輯：武英耀)

Bioinformatics analysis of insulin-like growth factor-Ⅰ (IGF-Ⅰ) in nile tilapia

Wang Weiwei

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China)

Key words:Nile tilapia; IGF-Ⅰ; Bioinformatics analysis

Abstract:In order to study the biological characteristics of IGF-Ⅰin tilapia, bioinformatics were analyzed using biology softwares, according to amino acid sequence of tilapia IGF-Ⅰfrom NCBI. IGF-Ⅰof tilapia was composed of 182 amino acid residues. The theoretical Pi and aliphatic index was 9.65 and 51.98, respectively. IGF-Ⅰwas basic, fat-soluble and unstable protein. There were 60.99% loop and 31.32% in IGF-Ⅰ secondary structure. There were a signal peptide and four disulfide bonds in IGF-Ⅰ. It had one transmembrane. There were some post-translation modified sites in IGF-Ⅰ, including 16 O-glycosylation site, 13 phosphorylation sites and 12 ubiquitination sites.

收稿日期：2016-03-23 修回日期：2016-04-06

作者簡介：王偉偉(1979-), 女(漢), 碩士， 講師, 研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物遺傳與育種

基金項(xiàng)目：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)新基金(2010025)

中圖分類號(hào)：S937.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1671-8151(2016)06-0422-06