雁門苦蕎黃酮的分離提取、穩(wěn)定性及抗氧化活性研究

付麗紅，李曉斌，董正中，薛亮

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院，山西 太谷 030801)

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雁門苦蕎黃酮的分離提取、穩(wěn)定性及抗氧化活性研究

付麗紅1，李曉斌2，董正中1，薛亮1

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院，山西 太谷 030801)

摘要：以雁門苦蕎為研究對(duì)象，采用Box-Behnken響應(yīng)面分析法，對(duì)苦蕎黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并探索其穩(wěn)定性和抗氧化活性。結(jié)果表明：苦蕎黃酮提取最佳工藝參數(shù)為乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)77%、料液比40∶1、溫度50 ℃和浸提液pH值5.6，總黃酮提取率為93.342%。同時(shí)，苦蕎黃酮在pH 3～7范圍內(nèi)能穩(wěn)定存在，溫度、光照和金屬離子(K+、Na+、Fe2+、Fe3+和Mg2+)對(duì)其影響作用小。當(dāng)黃酮濃度為0.4 g·L-1時(shí)，對(duì)·DPPH和·OH清除率分別為83.70%和82.49%，并且其還原性隨著濃度的增加而提高，表明雁門苦蕎黃酮具有好的抗氧化活性。

關(guān)鍵詞：雁門苦蕎； 黃酮； 穩(wěn)定性； 抗氧化

苦蕎(Fagopyrumtataricum(L.) Gaertn)學(xué)名韃靼蕎麥，屬蓼科(Polygonaceae)蕎麥屬(Fagopyrum)，為一年生植物，是稀有的藥食兩用作物，在《本草綱目》和《千金要方》均有記載。2008年，Ishii等[1]將苦蕎乙醇提取物作用于脂多糖誘導(dǎo)小鼠，顯著提高了小鼠脾臟和肝臟中炎性細(xì)胞因子IL-6和TNF-α表達(dá)水平，表明苦蕎具有抗炎癥作用。Wang[2]等用苦蕎提取物灌胃高血脂大鼠，發(fā)現(xiàn)其能顯著降低大鼠血清和肝臟中甘油三酯和膽固醇水平，提高血清中抗氧化酶活性，抑制脂質(zhì)過氧化。同時(shí)，苦蕎又具有抑菌[3]、調(diào)節(jié)血脂[4]和降低膽固醇[5]等作用。研究發(fā)現(xiàn)苦蕎主要的功能化合物是黃酮類化合物，如蘆丁、槲皮素、異槲皮素、山奈酚和山奈酚-3-O-蕓香糖苷[6～8]。因此，黃酮提取和功能活性研究成為苦蕎研究的熱點(diǎn)。

我國(guó)是世界苦蕎第一生產(chǎn)和出口大國(guó)，其產(chǎn)量占世界總量的90%以上。山西是全國(guó)為數(shù)不多的苦蕎種植區(qū)之一，僅次于云南、四川、貴州和陜西，常年苦蕎種植面積達(dá)1.3萬(wàn)公頃，產(chǎn)量約5萬(wàn)噸，占全國(guó)苦蕎總量的1/10。山西省苦蕎種植雖規(guī)模不大，但產(chǎn)區(qū)集中，雁北地區(qū)是苦蕎重要種植地之一，雁門苦蕎是其特色雜糧[9]。本研究以生長(zhǎng)在海拔1 400 m的雁門苦蕎為原料，采用醇提法分離純化苦蕎中黃酮類化合物，研究其穩(wěn)定性和抗氧化活性，為雁門苦蕎的綜合利用和深度開發(fā)提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與儀器

以山西右玉縣出產(chǎn)的雁門苦蕎為研究對(duì)象，由山西臣豐食品有限公司提供。蘆丁、無(wú)水乙醇、DPPH、NaNO2、TBA、Al(NO3)3、FeSO4、α-脫氧核糖等均為分析純。

所用儀器設(shè)備主要有：FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，蘇州江東精密儀器公司；85-2A數(shù)顯磁力攪拌器，江蘇金怡儀器有限公司；SHA-C恒溫水浴振蕩器，上海華鄰實(shí)業(yè)有限公司；FA1204B電子分析天平，上海精科天貿(mào)公司；SHZ-III型循環(huán)式真空泵，鄭州紫拓儀器公司；SP-752/752PC紫外分光光度計(jì)，上海光譜公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1黃酮提取工藝

雁門苦蕎顆粒經(jīng)高速粉碎機(jī)磨成粉，過100目篩子，稱取2 g于200 mL三角瓶中，按照不同料液比加入一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，用0.1 mol·L-1HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH后，置于一定溫度的恒溫?fù)u床中，100 r·min-1浸提1 h，真空抽濾獲得上清液，采用NaNO2-Al(NO3)3比色法于510 nm下測(cè)吸光值。

1.2.2響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為獲得理想的黃酮提取條件，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以乙醇體積分?jǐn)?shù)/%、料液比(w/v)、浸提溫度/℃和pH值4個(gè)因素為自變量，苦蕎黃酮提取率為響應(yīng)值。

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別取0.25 g·L-1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1、2、3、4、5、6 mL于25 mL比色管中，加蒸餾水至6 mL，加5%的NaNO21 mL，搖勻放置6 min，10%的Al(NO3)31 mL，搖勻后，靜置6 min，4% NaOH試劑10 mL，加水至刻度，搖勻，放置15 min，于510 nm測(cè)其吸光度。以吸光值橫坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)建立標(biāo)注曲線。

1.2.4黃酮提取率

黃酮提取率計(jì)算公式：

式中：c為黃酮含量/g·L-1；v提取液體積/mL；n為稀釋倍數(shù)；m為采用乙醇回流提取，NaNO2-Al(NO3)3法測(cè)得苦蕎總黃酮質(zhì)量453 mg·g-1。

1.2.5穩(wěn)定性測(cè)定

配置0.5 g·L-1苦蕎黃酮待測(cè)溶液分別在溫度、光照、pH和金屬離子4個(gè)因素下觀察其穩(wěn)定性。各因素水平梯度設(shè)置如下：

(1)溫度4、20、40、60、80和100 ℃，黃酮溶液在不同溫度下靜置30 min后測(cè)其吸光度；

(2)在日光下連續(xù)放置1周，每天測(cè)黃酮溶液吸光度；

(3)調(diào)制黃酮溶液pH值1、2、3、5、7和11，靜置30 min后測(cè)其吸光度；

(4)黃酮溶液中分別添加0.05%的KCl、NaCl、MgCl2、FeCl2、FeCl3和CaCl2，反應(yīng)1 h后測(cè)吸光度，觀察金屬離子對(duì)黃酮穩(wěn)定性的影響。

1.2.6抗氧化活性測(cè)定

雁門苦蕎黃酮抗氧化分析包括·DPPH自由基清除[10]、·OH自由基清除[11]和還原性檢測(cè)[12]，具體方法見參考文獻(xiàn)。

1.3數(shù)據(jù)分析

采用Design Expert 8.05b進(jìn)行響應(yīng)面分析，單因素采用SAS統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以mean±SD表示，每個(gè)試驗(yàn)均進(jìn)行3次平行測(cè)定。

2結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)物，NaNO2-Al(NO3)3比色法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：A=0.523 8C+0.000 1，R2=0.999 7。其中，A為吸光值，C為蘆丁質(zhì)量濃度。

2.2響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。根據(jù)表1的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行雁門苦蕎黃酮提取優(yōu)化，從試驗(yàn)結(jié)果可知，通過控制乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比、溫度和時(shí)間4個(gè)因素，黃酮提取率范圍在33.098%～92.872%，波動(dòng)范圍大，表明設(shè)定的4個(gè)因素對(duì)苦蕎黃酮的提取起關(guān)鍵性的影響。

注：A、B、C、D分別表示乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%、料液比(w/v)、溫度/℃和pH值。

Notes: A ethanol volume fraction/%, B solid-liquid ratio, C temperature/℃, D pH.

2.3方差分析結(jié)果

方差分析結(jié)果如表2所示。

由方差分析結(jié)果可知，在一次項(xiàng)中，A為顯著影響(p=0.013 4)；在二次項(xiàng)中，B2和BD(p=0.022 9)為顯著影響，C2和D2為極顯著影響(p<0.01)。模型F=4.82，p=0.002 9，表明該模型顯著，決定系數(shù)R2=0.828 1，說明模型具有較高的擬合精度。

采用Design-Expert 8.05b軟件進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸分析，得到苦蕎黃酮提取率回歸方程為：

Y=-185.715+2.058A+4.004B+2.036C+24.434D-0.069AD+0.169BD+0.021CD-0.012A2-0.039B2-0.0268C2-1.181D2

依據(jù)模型預(yù)測(cè)分析可知，當(dāng)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為77.26%、料液比40.72∶1、溫度49.37℃、pH值5.62時(shí)，黃酮提取率為94.24%。根據(jù)實(shí)際條件，確定乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為77%、料液比40∶1、溫度50℃、pH值5.6，此時(shí)測(cè)得黃酮提取率為93.342%，與理論誤差為0.953%，表明該模型可以很好的預(yù)測(cè)黃酮提取率。

由圖2可看出，當(dāng)溶液pH值和溫度一定時(shí)，較高水平的乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)和中等水平料液比可以獲得較高的黃酮提取率。同理，當(dāng)溶液pH值和乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時(shí)，較高水平的料液比和中等水平溫度可以獲得較高的黃酮提取率(圖3)；當(dāng)溶液料液比和乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時(shí)，較高水平的溫度和中等水平pH值可以獲得較高的黃酮提取率(圖4)。

2.4溫度對(duì)黃酮穩(wěn)定性的影響

如圖5所示，在4～100 ℃范圍內(nèi)，苦蕎黃酮吸光度都在一個(gè)穩(wěn)定區(qū)間0.309～0.337，6個(gè)溫度之間無(wú)顯著差異。SAS統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，模型F值=1.61，顯著性檢驗(yàn)概率p=0.259 5，p值大于0.05，因此，溫度對(duì)黃酮穩(wěn)定性無(wú)影響，雁門苦蕎黃酮可以在室溫或低溫下保存。

2.5光照對(duì)黃酮穩(wěn)定性的影響

光照對(duì)雁門苦蕎黃酮穩(wěn)定性的影響見圖6。由圖6可知，苦蕎黃酮溶液在自然光照下連續(xù)放置7 d，其吸光值穩(wěn)定在0.340～0.347，SAS統(tǒng)計(jì)分析表明，模型F值=0.45，p=0.834，表明該模型不顯著，即光照對(duì)苦蕎黃酮無(wú)顯著性影響。同時(shí)，不同時(shí)間段差異不顯著。因此，雁門苦蕎黃酮可以在日常環(huán)境中保存，無(wú)需避光。

2.6pH對(duì)黃酮穩(wěn)定性的影響

pH對(duì)雁門苦蕎黃酮穩(wěn)定性影響如圖7所示。結(jié)果表明，F(xiàn)值=196.97，p<0.000 1，說明該模型顯著，溶液pH對(duì)苦蕎黃酮穩(wěn)定性有顯著性影響。黃酮溶液pH值在3～7之間，其OD值在0.316～0.324范圍內(nèi)波動(dòng)，彼此間差異不顯著，當(dāng)溶液的pH>9和pH<3時(shí)，OD值出現(xiàn)逐漸降低趨勢(shì)。分析原因可能是黃酮類化合物分子中的酚羥基顯示弱酸性，在堿性環(huán)境中，使黃酮化合物結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。另外，黃酮類化合物可能含有γ-吡喃環(huán)，含未共用電子對(duì)，在強(qiáng)酸條件下會(huì)生產(chǎn)鹽類化合物，導(dǎo)致測(cè)定的OD值降低。因此，苦蕎黃酮應(yīng)保存在中性或弱酸環(huán)境中。

2.7金屬離子對(duì)黃酮穩(wěn)定性的影響

不同金屬離子對(duì)雁門苦蕎黃酮穩(wěn)定性的影響見圖8。SAS分析可知，F(xiàn)值=134.25，顯著性檢驗(yàn)概率p<0.001，表明該模型顯著。當(dāng)溶液中存在K+、Na+、Fe2+、Fe3+和Mg2+時(shí)，OD值在0.343～0.359之間，與空白相比，差異不顯著。當(dāng)加入Ca2+時(shí)，其OD值顯著性提高為0.672，與其它組之間存在顯著差異(P<0.05)，可能是因?yàn)樘崛〉幕衔镏泻朽彾恿u基與鈣反應(yīng)生成不溶性絡(luò)合物，影響反應(yīng)溶液的吸光度。

2.8黃酮對(duì)·DPPH和·OH自由基清除率的檢測(cè)

雁門苦蕎黃酮對(duì)·DPPH和·OH自由基清除能力的影響詳見圖9。從圖9可見，隨著苦蕎黃酮濃度的增加，對(duì)·DPPH和·OH自由基清除率逐漸增加，當(dāng)黃酮濃度為0.4 g·L-1時(shí)，對(duì)兩種自由基清除率達(dá)到穩(wěn)定值，此時(shí)·DPPH清除率為83.70%，·OH自由基清除率為82.49%。分析原因是雁門苦蕎黃酮類化合物既能與·DPPH自由基中的單電子配對(duì)，又能與·OH自由基作用減弱·OH對(duì)Fe2+的氧化，從而影響最終反應(yīng)體系的吸光值。因此，苦蕎黃酮能夠很好的清除·DPPH和·OH自由基，具有抗氧化活性。

2.9還原能力檢測(cè)

雁門苦蕎黃酮還原性測(cè)定結(jié)果見圖10。由圖7可知，苦蕎黃酮樣品濃度從0.05 g·L-1到1.6 g·L-1，700 nm下測(cè)得吸光度由0.120逐漸增加到2.733，即隨著樣品濃度增加，還原性逐漸增強(qiáng)。分析原因，苦蕎中的黃酮化合物可將K3[Fe(CN)6]還原成K4[Fe(CN)6]，再與Fe3+生成普魯士藍(lán)，通過測(cè)定其生成量反映苦蕎黃酮類化合物的還原性。

3討論

苦蕎又名韃韃蕎麥，雙子葉廖科蕎麥屬，是富含生物類黃酮的雜糧作物。目前，我國(guó)苦蕎種植面積和產(chǎn)量均居世界首位?？嗍w品種資源豐富，收錄在《中國(guó)蕎麥品種資源目錄》的苦蕎有879份，不同地區(qū)都有自己的特色品種。秦培友[13]對(duì)21種苦蕎品種的黃酮化合物含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，貴州的梅花山苦蕎品種總黃酮含量最高，為22.74 mg·g-1。本研究測(cè)得雁門苦蕎總黃酮含量是該品種的20倍，含量差異主要與苦蕎品種和種植環(huán)境有著密切關(guān)系。有機(jī)溶劑(乙醇)提取黃酮類化合物是一種簡(jiǎn)便有效的方法，其基本原理為利用黃酮類化合物分子結(jié)構(gòu)-OH與雜質(zhì)極性不同，進(jìn)行黃酮類物質(zhì)提取。本實(shí)驗(yàn)通過有機(jī)溶劑提取法，獲得雁門苦蕎黃酮提取率為93.342%。根據(jù)顯著性檢驗(yàn)概率p值，影響黃酮提取率的次序?yàn)椋阂掖假|(zhì)量分?jǐn)?shù)>pH>料液比>浸提溫度。目前，從苦蕎中分離出20多種黃酮類化合物，主要為蘆丁、槲皮素、兒茶素、槲皮苷和槲皮素-3-蕓香糖葡萄糖苷等，但雁門苦蕎黃酮類化合物的成分尚未清楚，需要進(jìn)一步深入探討。

研究顯示，雁門苦蕎耐熱性好，可在光照的環(huán)境中存放，金屬離子K+、Na+、Fe2+、Fe3+和Mg2+對(duì)其無(wú)影響，但要注意環(huán)境的酸堿度，不宜在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿條件下儲(chǔ)存。許明等對(duì)2種苦蕎黃酮粗提物進(jìn)行研究，同樣證明黃酮溶液耐高溫[14]。因此，根據(jù)耐高溫特性，可以將苦蕎加工成各種食品，如苦蕎茶和苦蕎方便面等。

生物體呼吸代謝形成能源分子ATP維持機(jī)體生命活動(dòng)，同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物活性氧(Reactive oxygen species，ROS)。正常條件下，體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)會(huì)清除這些ROS，氧化和抗氧化系統(tǒng)處于平衡狀態(tài)，但機(jī)體受到外界刺激后，處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，過量的ROS會(huì)攻擊體內(nèi)的生物大分子如核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，造成難以修復(fù)的細(xì)胞和組織損傷，形成各種疾病，如腫瘤、糖尿病、動(dòng)脈硬化、心肌缺血等。因此，尋找高效的天然抗氧化物成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。研究顯示，雁門苦蕎黃酮具有很好的抗氧化能力，因此，可以通過日常食用苦蕎或開發(fā)苦蕎黃酮類產(chǎn)品發(fā)揮其抗氧化功效。

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(編輯：馬榮博)

Study on extraction, stability and antioxidant activity of flavonoids from YanmenFagopyrumtataricum

Fu Lihong1, Li Xiaobin2, Dong Zhengzhong1, Xue Liang1

(1.CollegeofFoodScienceandEngineering,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801China; 2.CollegeofEngineering,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801China)

Key words:YanmenFagopyrumtataricum; Flavonoids; Stability; Antioxidant

Abstract:The extraction technology of total flavonoids from YanmenFagopyrumtataricumwas studied by box behnken response surface methodology. And the stability and antioxidant activity of extracts were also detected. The processing parameters of extracting total flavonoids were as following: ethanol mass fraction 77%, solid-liquid ratio 40∶1, temperature of 50 ℃, pH value of 5.6. Finally, the total flavonoid rate was 93.342%. The flavonoid ofFagopyrumtataricumwas stable at pH from three to seven. Several factors weren’t effect on flavonoids including temperature, illumination, K+, Na+, Fe2+, Fe3+and Mg2+. When the concentration of flavonoids was 0.4 g·L-1, scavenging rate of ·DPPH and ·OH respectively were 82.49% and 83.70%. And the reducibility increases with the concentration increase of flavonoids. The results showed that flavonoids of YanmenFagopyrumtataricumhad antioxidant activity.

收稿日期：2016-02-19 修回日期：2016-03-09

作者簡(jiǎn)介：付麗紅(1984-)，女(漢)，山西晉中人，講師，博士，研究方向：糧油加工

基金項(xiàng)目：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)博士啟動(dòng)基金(2013YJ32)，?？萍紕?chuàng)新基金(20142-13)

中圖分類號(hào)：TS201.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1671-8151(2016)06-0439-06