前列靈膠囊對CP大鼠前列腺組織中凋亡因子BAX、BCL-2蛋白的影響*

吳天浪 畢明帥 俞旭君 王飛 任飛強 常德貴**

1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院（成都 610072）；2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)；3. 四川省第二中醫(yī)院

前列靈膠囊對CP大鼠前列腺組織中凋亡因子BAX、BCL-2蛋白的影響*

吳天浪1畢明帥1俞旭君2王飛3任飛強2常德貴2**

1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院（成都 610072）；2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)；3. 四川省第二中醫(yī)院

目的探討前列靈膠囊對慢性前列腺炎（Chronic prostatitis，CP）大鼠前列腺BAX 蛋白、BCL-2 蛋白表達的影響。方法以60只SPF級SD大鼠為觀察對象，消痔靈注射液進行前列腺內(nèi)注射制作CP模型，以前列靈膠囊高、中、低劑量以及前列通瘀膠囊灌胃作為干預(yù)方法，觀察大鼠前列腺組織中凋亡因子BAX、BCL-2蛋白表達變化。結(jié)果前列通瘀、前列靈膠囊高劑量能使CP大鼠前列腺組織中促進凋亡因子BAX蛋白表達減少（P＜0.05），抑制凋亡因子BCL-2蛋白表達增加（P＜0.05）。結(jié)論細胞凋亡因子BAX、BCL-2與CP密切相關(guān)，前列靈膠囊能通過調(diào)節(jié)細胞凋亡情況而改善前列腺炎癥反應(yīng)。

前列腺炎；前列靈膠囊；BCL-2相關(guān)X蛋白質(zhì)；細胞凋亡

慢性前列腺炎（CP）是指前列腺的非特異性感染。在我國，CP約占男科、泌尿科門診患者總數(shù)的1/3［1］，但發(fā)病機制尚未完全清楚。前列靈膠囊為我院使用多年的院內(nèi)制劑，在前期臨床研究中［2,3］，對CP的療效確切，未見不良反應(yīng)。本實驗擬探討前列靈膠囊對CP大鼠前列腺組織中BAX蛋白、BCL-2蛋白表達的影響，以進一步揭示其治療CP的作用機制。

資料與方法

一、資料

（一）實驗動物

動物 SPF級SD大鼠60只，15月齡，雄性，體重250-350g，由成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供（川實動管227號）。

（二）藥物與試劑

對照藥物：前列通瘀膠囊由珠海星光制藥有限公司制造，規(guī)格0.4g/粒，國藥準(zhǔn)字Z19990060，產(chǎn)品編號：C1400000763。

消痔靈注射液：每支10mL，北京萬輝藥業(yè)集團第四制藥廠生產(chǎn)，京衛(wèi)藥準(zhǔn)字（1998）第104094號。

BAX抗體（BAX），兔抗，多克隆抗體，批號：bs-0127R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司。BCL-2抗體（BCL-2），兔抗，多克隆抗體，批號：bs-0032R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司。二抗：生物素化山羊抗兔IgG（H+L）, SP-9001批號：13152A11，北京中山金橋生物有限公司。

Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)，美國Media Cybernetics公司。

二、造模與分組

大鼠經(jīng)環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周后，參照文獻［4,5］將大鼠按體質(zhì)量隨機分為6組：空白組、模型對照組、前列通瘀組及前列靈膠囊高、中、低劑量組，各組均用25%烏拉坦1g/kg，經(jīng)腹腔注射麻醉，無菌條件下取下腹正中切口，打開腹腔，提出膀胱及兩側(cè)精囊，暴露附睪及精囊兩側(cè)的前列腺背葉，其中空白組注入無菌注射用水0.1mL，其余各組分別注入25%消痔靈注射液0.1mL，縫合后恢復(fù)一周。

三、干預(yù)方法

實驗動物給藥用量根據(jù)實驗動物與人體體質(zhì)量等效劑量換算公式［5］換算，且每天測大鼠體質(zhì)量一次，及時調(diào)整給藥劑量。均采取每日晨09：00灌胃一次，連續(xù)30d?？瞻捉M和模型對照組：生理鹽水10ml/kg；前列通瘀組：前列通瘀膠囊混懸液劑量10ml/kg，相當(dāng)于60kg成人用量20倍（生藥含量為：6.6mg/kg）；前列靈膠囊高、中、低劑量組：前列靈膠囊混懸液劑量10ml/kg，分別相當(dāng)于60kg成人用量20倍、10倍、5倍（生藥含量為：6.6mg/kg、3.3mg/kg、1.65mg/kg）。

首先，要想有效地實行“翻轉(zhuǎn)課堂”，學(xué)校應(yīng)該完善信息技術(shù)軟硬件設(shè)備，學(xué)校機房應(yīng)該在課余時間隨時向?qū)W生開放，以方便學(xué)生觀看視頻錄像自主學(xué)習(xí)。

四、觀察指標(biāo)

末次給藥結(jié)束后2d，稱大鼠體質(zhì)量，斷頭處死，經(jīng)下腹正中切口進腹，于膀胱下方切除前列腺腹側(cè)葉，摘除前列腺組織，用4%甲醛固定液固定，二甲苯脫水，常規(guī)石蠟包埋、切片，免疫組織化學(xué)方法觀察大鼠前列腺組織中前列腺凋亡因子BAX、BCL-2蛋白表達的變化。

五、統(tǒng)計方法

實驗數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件包進行處理：各項指標(biāo)結(jié)果滿足正態(tài)分布時，各組間比較用單因素方差分析，如不滿足正態(tài)分布時選用非參數(shù)檢驗，各項指標(biāo)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般情況

試驗入組60例，符合方案分析58例，其中空白組10只，模型對照組9只，前列通瘀組9只，前列靈高組10只，前列靈中組10只，前列靈低組10只。其年齡分布、治療前后BCL-2蛋白和BAX蛋白，根據(jù)卡方檢驗統(tǒng)計分析，得出各組之間相關(guān)指標(biāo)分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.005），具有可比性。

二、前列靈膠囊對大鼠前列腺組織中BAX、BCL-2的OD值影響

從表1可以看出，模型對照組與空白組相比：大鼠前列腺BCL-2蛋白表達降低、BAX表達升高（P＜0.05）。前列通瘀組、前列靈高劑量組能明顯上調(diào)大鼠前列腺組織BCL-2蛋白表達，下調(diào)BAX蛋白表達，與模型對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。提示前列靈膠囊可通過對凋亡因子的調(diào)節(jié)來改善前列腺炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為下調(diào)BAX、上調(diào)BCL-2蛋白的表達。

表1 各組大鼠前列腺組織 BCL-2 、BAX平均光密度表達情況（±s）

表1 各組大鼠前列腺組織 BCL-2 、BAX平均光密度表達情況（±s）

與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05

空白組模型對照組前列通瘀組前列靈高組中組低組OD（BCL-2）0.2482±0.01390.2344±0.0082*0.2501±0.0124▲0.2618±0.0058▲0.2390±0.01330.2349±0.0109 OD（BAX）0.2325±0.01380.2589±0.0189*0.2367±0.0099▲0.2285±0.0147▲0.2423±0.00580.2528±0.0131

討 論

一、動物模型分析

CP的動物模型有慢性細菌性前列腺炎模型、慢性非細菌性前列腺炎模型、免疫因素導(dǎo)致前列腺炎模型及其他慢性前列腺炎模型［6］。消痔靈注射液（內(nèi)含硫酸鋁鉀、五倍子鞣質(zhì)等）可形成大鼠非細菌性前列腺炎模型，相關(guān)文獻報道［7,8］消痔靈對前列腺組織的損害病理結(jié)果與人類一致，表現(xiàn)為前列腺間質(zhì)纖維細胞增生及炎癥細胞浸潤。如果造模劑量和造模時間合適則可用藥物逆轉(zhuǎn)，模型具有可重復(fù)性。本次實驗觀察到消痔靈注射后前列腺間質(zhì)大多有不同程度的炎癥細胞浸潤及纖維化，且BCL-2、BAX表達模型組與空白組相比有明顯差異（P＜0.05），表明大鼠CP模型建立成功。

二、前列靈膠囊對前列腺組織中凋亡因子的影響

細胞的死亡主要方式為細胞凋亡和壞死，炎癥因子在其中起到巨大的作用，自身免疫細胞反應(yīng)及細胞因子介導(dǎo)的局部免疫反應(yīng)是身體修復(fù)的一種基本途徑，其中有大量的證據(jù)都說明細胞凋亡在炎癥過程中存在重要作用，凋亡是由相關(guān)基因調(diào)控完成的細胞主動性死亡過程，受多種基因調(diào)節(jié)，目前已知有Bcl-2、Bax、p53、Fas等［9］，其中Bax和Bcl-2基因與凋亡的調(diào)控關(guān)系更為密切［10,11］，Bcl-2和Bax作為一對關(guān)系密切的凋亡相關(guān)基因，抗凋亡因子 BCL-2與促凋亡因子BAX的比例不同對前列腺炎癥細胞凋亡的影響也不同，本次實驗數(shù)據(jù)也證實其作用，BCL-2＞BAX細胞趨于存活，BAX＞BCL-2則細胞趨于凋亡，Bcl-2基因有促進細胞周期和細胞增殖的能力，其過度表達可特異性抑制細胞凋亡。Bax基因的過度表達能加速IL-3細胞株在細胞因子缺失時發(fā)生細胞凋亡，并對抗BCL-2對細胞凋亡的抑制作用，從而促進細胞凋亡［12］。CP病理表現(xiàn)為局灶性前列腺導(dǎo)管和腺體及其周圍腺上皮增生或者破壞［1］，乃至纖維化。一般認為BCL-2 主要在凋亡上游事件中起保護作用［13］，同時本次實驗也證實這個觀點，因此，增強組織中BCL-2的表達，降低BAX的表達，對治療CP的價值重大。本次實驗顯示：模型對照組大鼠較空白組BCL-2蛋白的表達降低，而 BAX的表達卻相對增多，提示消痔靈具有促進前列腺組織正常細胞凋亡的作用；前列靈高劑量組與模型對照組相比，BCL-2蛋白的表達增多，而 BAX的表達卻明顯降低，表示前列靈膠囊有抑制CP正常前列腺細胞凋亡、改善前列腺功能的作用。與前列通瘀組相比，BCL-2 蛋白的表達增加及BAX的表達降低幅度具有一致性，本結(jié)果在一定程度上揭示了前列靈膠囊通過抑制前列腺正常組織細胞凋亡進而改善前列腺組織的修復(fù)功能、改善炎癥狀態(tài)的作用機制。

三、藥物分析

前列靈膠囊由黃柏、水蛭、益母草為主組成，以黃柏為君，水蛭為臣。黃柏苦寒，入腎、膀胱二經(jīng)，專治濕熱在腎、膀胱二經(jīng)者。水蛭咸、苦、平，入肝經(jīng)，破血逐瘀，對下焦?jié)裥岸嗯c黃柏相伍為用。益母草辛，苦，微寒，歸心、肝、膀胱經(jīng)，活血調(diào)經(jīng)，利水消腫，清熱解毒。三藥合用，常用于下焦?jié)駸狃鲎柚C?，F(xiàn)代藥理研究［14］認為，黃柏可使炎癥局部血管收縮，減輕局部炎癥反應(yīng)，且含鉀量高，有利尿之功，可使?jié)裥皬男”愣?。水蛭能夠擴血管，改善微循環(huán)，促進炎性病變的吸收；降低大鼠全血黏度及紅細胞凝聚指數(shù)，延長凝血時間以及擴血管減少血栓形成，促進毛細血管血流恢復(fù)。總之，應(yīng)用祛濕活血化瘀藥后，促進了血液循環(huán)，氣血通暢，使會陰、少腹及腰的疼痛顯著改善，體現(xiàn)了中醫(yī)學(xué)的“通則不痛”原則。

本次實驗結(jié)果表明，前列靈膠囊可能通過上調(diào)BAX蛋白，下調(diào)BCL-2，改善了前列腺導(dǎo)管及腺上皮增生、凋亡與組織纖維化之間的平衡，進而影響前列腺的炎癥反應(yīng)級別，是CP治療的重要的機制之一。

1 張元芳, 孫穎浩, 王忠主編. 實用泌尿外科學(xué)和男科學(xué).北京: 科學(xué)出版社, 2013: 366-367

2 尹靜, 曲曉偉, 林浩成, 等. 前列靈膠囊對慢性非細菌性前列腺炎患者EPS中IL-8和TNF-α的影響. 遼寧中醫(yī)雜志 2009；36（1）: 4-5

3 吳天浪, 琚杰昌, 張培海, 等. 前列靈膠囊治療濕熱瘀阻型慢性前列腺炎31例臨床觀察. 新中醫(yī) 2009；41（4）: 55-56

4 徐淑云主編. 藥理實驗方法學(xué)（第三版）. 北京: 人民衛(wèi)生出版社,2002: 262-263

5 黃繼漢, 黃曉暉, 陳志揚. 藥理試驗中動物間和動物與人見的等效劑量換算. 中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué) 2004；9（9）: 1069-1070

6 李天賦, 李衛(wèi)巍. 慢性前列腺炎動物模型研究進展. 中華男科學(xué)雜志 2013；19（12）: 1124-1128

7 張亞強. 中藥前列腺湯對實驗性前列腺炎病理模型的影響. 中西醫(yī)結(jié)合雜志 1991；11（8）: 480-4818 夏立營, 劉維佳, 葛文津, 等. 苦豆腎茶方對消痔靈所致大鼠慢性非細菌性前列腺炎的治療作用. 中華中醫(yī)藥雜志 2012；22（7）:1898-1900

9 傅洪軍, 董勝璋, 任鐵玲, 等. 氯化鋁對大鼠皮層神經(jīng)元凋亡及bcl-2、bax基因表達的影響. 衛(wèi)生毒理學(xué)雜志2003；17（1）: 20-23

10 Yang B, Prayson RA. Expression of Bax, Bcl-2 and P53 in progressive multifocal leukoencephalopathy.Mod Pathol2000；13（10）: 1115-1120

11 Shibata M, Murray M, Tessler A,et al. Single injections of a DNA plasmid that contains the human Bcl-2 gene prevent loss and atrophy of distinct neuronal populations after spinal cord injury in adult rats.Neurorehabil Neural Repair2000；14（4）: 319-330

12 鄭航, 鄭新民, 李世文, 等. Bcl-2/Bax基因表達對隱睪生殖細胞凋亡的影響. 中國男科學(xué)雜志 2000；14（2）: 81-82

13 Lok J, Martin LJ. Rapid sub-cellular redistribution of Bax precedes Caspase- 3 and endonuclease activation during excitotoxic neuronal apoptosis in rat brain.J Neurotrauma2002；19（7）: 815-825

14 張廷模主編. 臨床中藥學(xué). 北京: 中國中醫(yī)藥出版社, 2004: 233-235

（2015-12-18收稿）

Effects of QianLieling capsule on the expression of BAX and BCL-2 in prostate tissue of chronic prostatitis rats

Wu Tianlang1, Bi Mingshuai1,Yu Xujun2, Wang Fei3, Ren Feiqiang2, Chang Degui2*
1. Affiliated Hospital of Chengdu University of TCM, Chengdu 610072, China；
2. Chengdu University of TCM；3. The 2nd Traditional Chinese Medicine Hospital of Sichuan

Objective To study the effects ofQianLielingcapsule on the expression of BAX and BCL-2 in prostate tissue of chronic prostatitis rats.MethodsSixty SD rats of SPF grade were selected, and 50 were injected withXiaoZhiLinginjection into the prostate to prepare the CP model. Equal volume ofQianLieLinghigh, medium, low dose andQianLieTongYucapsule were given by gastrogavage as intervention. The expressions of BAX and BCL-2 in the prostate tissue were tested after intervention.ResultsThe expressions of BAX were decreased inQianLielinghigh dose andQianLieTongYugroups compared with that of model group（P＜0.05）, but BCL-2 expressions were increased（P＜0.05）.ConclusionThe cell apoptosis factors BAX and BCL-2 are closely related with CP.QianLielingcapsule can improve the prostate in flammation reaction by regulating cell apoptosis.

prostatitis；QianLieling capsule；BCL-2-Associated X Protein；apoptosis

10.3969/j.issn.1008-0848.2016.06.006

R697.33

資助：成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院院基金項目資助（項目編號：2008-D-YY-01）

**通訊作者，cdg998@sina.com

Communication author: Chang Degui, E-mail:cdg998@sina.com