人類精子空泡及中心體形態(tài)對ICSI患者胚胎發(fā)育的影響*

孟祥黔 龔 藝 熊 符 何 菲 全 松** 劉 敬**

1. 四川省成都市錦江區(qū)婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心（成都 610066）；

2. 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心；3 南方醫(yī)科大學(xué)遺傳教研室

人類精子空泡及中心體形態(tài)對ICSI患者胚胎發(fā)育的影響*

孟祥黔1龔 藝2熊 符3何 菲3全 松2**劉 敬1**

1. 四川省成都市錦江區(qū)婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心（成都 610066）；

2. 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心；3 南方醫(yī)科大學(xué)遺傳教研室

目的利用精子放大系統(tǒng)將精子放大6 000倍后，觀察精子是否含空泡及精子中段形態(tài)，探討精子空泡及中心體形態(tài)對行卵泡漿內(nèi)單精子顯微注射（ICSI）患者的胚胎發(fā)育的影響。方法 57例來自成都錦江生殖中心因男方因素行ICSI患者，常規(guī)挑選完形態(tài)正常的精子（×200～×400）后，再次利用精子放大系統(tǒng)對精子有無空泡和精子中段形態(tài)進(jìn)行觀察。根據(jù)精子中段形態(tài)將精子分為三類，A類：1≤a/b≤1.2；B類：a/b≥1.5；C類：其他不規(guī)則形態(tài)。有無空泡和精子中段組分為：空泡-A，空泡-B，空泡-C，無空泡-A，無空泡-B，無空泡-C。隨后按照常規(guī)ICSI注射后培養(yǎng)，并觀察胚胎發(fā)育情況和患者臨床結(jié)局。結(jié)果空泡-A、B、C3組在2PN率、D3優(yōu)胚率、可用囊胚率及胚胎冷凍率上均無顯著性差異（P＞0.05）；無空泡-A,B,C三組的可用囊胚率上無顯著性差異（P＞0.05），而2PN率（74.48 % vs 84.62 % vs 57.14%），卵裂率（96.17% vs 97.06% vs 80.95%），D3優(yōu)胚率（35.48% vs 39.39 %vs 9.09%）、D6囊胚形成率（21.05% vs 34.78% vs 0），胚胎冷凍率（31.25 % vs 26.92% vs 0）均有顯著性差異（P＜0.05）。另外A組中有無空泡中，僅僅胚胎冷凍率上具有顯著性差異（P＜0.05），B組中2PN率具有顯著性差異性（P＜0.05），C組中可用囊胚率和胚胎冷凍率具有顯著性差異（P＜0.05），3組中其余指標(biāo)均無顯著性差異（P＞0.0）。結(jié)論精子頭部無空泡和中心體形態(tài)較好的精子注射入卵后，能提高2PN率、D3優(yōu)胚率、胚胎冷凍率。由于樣本量較少，仍然需要較大的樣本量來進(jìn)一步證實(shí)，為精子空泡以及中心體對胚胎發(fā)育影響的相關(guān)研究提供參考。

精子注射, 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；精子；空泡；中心體；胚胎發(fā)育

據(jù)國內(nèi)外研究顯示，不孕不育夫婦中約40%是由男方因素引起，其中50%的不育男性精子形態(tài)表現(xiàn)異常［1］。許多研究者認(rèn)為精子形態(tài)與精子功能密切相關(guān)，精子形態(tài)異常是導(dǎo)致男性不育的重要原因之一［2］。傳統(tǒng)卵泡漿內(nèi)單精子顯微注射（ICSI）在光鏡（×400）下挑選精子可能存在超微結(jié)構(gòu)異常，這些異?？赡苁菍?dǎo)致ICSI周期失敗的原因［3,4］。因此，在顯微注射治療中挑選一條形態(tài)正常的精子是非常關(guān)鍵。MSOME（精子細(xì)胞器形態(tài)學(xué)檢查）［5,6］是由Berkovitz在2002 年提出的一項(xiàng)新技術(shù)，通過高質(zhì)量的光學(xué)系統(tǒng)將精子放大6 000倍，并通過數(shù)字化處理圖像，在電腦顯示器上對精子進(jìn)行實(shí)時(shí)的形態(tài)學(xué)評估，有利于發(fā)現(xiàn)精子微細(xì)胞器（如：頂體、頂體后區(qū)、頸部、尾部、中心體形態(tài)）形態(tài)結(jié)構(gòu)的異常。

精子核的形態(tài)以及精子頭部是否含空泡目前被認(rèn)為是形態(tài)學(xué)判定的關(guān)鍵指標(biāo)，迄今為止，關(guān)于精子空泡出現(xiàn)頻率、起源等仍存在爭議，有研究認(rèn)為空泡的出現(xiàn)是一種正常的生理現(xiàn)象［7-9］，也有研究表明在不育男性精液中含空泡精子的比例高于有生育能力的男性［10］；同時(shí)，也有研究指出空泡的存在與精子內(nèi)部生理功能的異常有關(guān)［11-15］，含有空泡的精子可能通過ICSI技術(shù)突破自然屏障，使卵母細(xì)胞受精，將異常的遺傳物質(zhì)帶入受精卵中，并通過父源性作用影響胚胎的質(zhì)量及發(fā)育潛能。另外精子中心體異常也可能是導(dǎo)致男性不育的因素且扮演著重要的角色［16］，當(dāng)卵母細(xì)胞被精子激活后，排出第二極體，此時(shí)精子近端中心粒降解，以頸部中段的中心粒為中心形成精星體［17,18］，通過精星體的牽引，雌雄原核逐漸靠近融合形成受精卵。中心粒在原核期開始復(fù)制后均分至第一次胚胎分裂的紡錘體兩極，合子的中心體是胚胎、胎兒和成年體細(xì)胞中心體的前身［19］。因此，精子中心體對于卵母細(xì)胞的正常受精、精星體的形成以及雌雄原核的形成起著關(guān)鍵性的作用。行ICSI治療受精失敗可能是中心體功能異常所致［20］。2010年Ugajin［21］的科研小組提出，從形態(tài)學(xué)角度分析，精子段中心體形態(tài)異常涉及到精子中心體功能異常，從而可能會影響ICSI治療結(jié)局。

然而，大多數(shù)研究都是通過動物模型中精星體的形成來研究中心體功能，未見關(guān)于人類精子中心體形態(tài)的相關(guān)研究，本研究低倍鏡觀察后考慮到精子空泡和中心體形態(tài)對于助孕結(jié)局的影響。借助MSOME技術(shù)對ICSI患者的精子放大6 000倍對其按照精子頭部空泡的有無，精子中心體形態(tài)進(jìn)行分組，隨后將不同組別的精子注射入卵母細(xì)胞并單獨(dú)培養(yǎng)，觀察正常受精、胚胎發(fā)育和胚胎著床情況，進(jìn)一步了解空泡及精子中段形態(tài)對胚胎發(fā)育的影響。

資料和方法

一、研究對象

選擇2014年1月至11月在成都錦江婦幼保健院接受輔助生殖治療的患者57例，其中9例患者為重復(fù)周期。所有患者均接受來自同一位醫(yī)生的診治，并且所有患者治療過程中都采用的是常規(guī)促性腺激素釋放激素激動劑長方案控制性卵巢刺激周期促排卵，所有患者行顯微注射。ICSI指征［22］：（1）嚴(yán)重少、弱、畸精子癥；（2）不可逆的梗阻性無精子癥；（3）生精功能障礙（排除遺傳缺陷疾病所致）；（4）男性免疫性不育；（5）體外受精（IVF）失??；精子頂體異常。

二、促排卵方案

控制性超排卵［23］：超排卵為標(biāo)準(zhǔn)長方案或短期方案（根據(jù)患者自身情況決定其方案的選擇，兩種促排方案在MII卵率上均無顯著性差異），B超監(jiān)測卵泡生長發(fā)育狀況，待優(yōu)勢卵泡直徑≥18mm時(shí)肌肉注射HCG 10 000IU，36h后在B超介導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺取卵。

三、研究對象分組

57例研究對象的精子標(biāo)本按照MSOME高倍鏡觀察下中心體形態(tài)以及頭部有無空泡進(jìn)行分組。高倍鏡下觀察到精子的中心體形態(tài)可分為三類［21］：由圖1可見A類為1≤a/b≤1.2，B類為a/b≥1.5，C類為其他形態(tài)不規(guī)則；按照頭部空泡的存在情況可分為：有空泡類精子和無空泡類精子。最后，根據(jù)這兩個(gè)觀察指標(biāo)對所有精子分成6組：空泡-A組（n=79）、空泡-B組（n=7）、空泡-C組（n=17）、無空泡-A組（n=377）、無空泡-B組（n=39）、無空泡-C組（n=35）。

圖1 精子中心體形態(tài)A類、B類示意圖

四、方法

（一）卵母細(xì)胞的采集與處理

所有患者均使用常規(guī)激動劑長方案控制性卵巢刺激周期促排卵：黃體中期予以促性腺激素釋放激素激動劑（GnRH-a ，達(dá)必佳，F(xiàn)ERRING, 瑞士）0.05mg肌注，降調(diào)≥14d時(shí)，測定激素水平（E2、LH、FSH）、子宮內(nèi)膜厚度、竇卵泡直徑，確定達(dá)到降調(diào)標(biāo)準(zhǔn)后予以重組卵泡刺激素（rFSH，果納芬，Merck Serono，德國）150U～300U對卵巢進(jìn)行刺激，并根據(jù)B超監(jiān)測的卵泡情況和血清LH、E2水平調(diào)整重組卵泡刺激素的用量。當(dāng)B超監(jiān)測下有3個(gè)主導(dǎo)卵泡直徑＞18mm后，給予重組人絨毛膜促性腺激素（rHCG, 艾澤, Merck Serono,德國）250mg肌注，36h后在B超介導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺取卵。將獲得的卵母細(xì)胞于透明質(zhì)酸酶（Hyaluronidase, 80U/mL, Sage, 美國）中消化去除顆粒細(xì)胞后，置于含Vitrolife序貫培養(yǎng)液（G-IVF, Vitrolife, 瑞典）的培養(yǎng)皿中放置37℃、6% CO2的培養(yǎng)箱（Thermo Scientific Forma 3110, 美國）培養(yǎng)備用。

（二）精子的準(zhǔn)備

TESA取精患者的精子準(zhǔn)備：采用睪丸細(xì)針抽吸術(shù)獲取睪丸組織,加入含1 0%替代血清白蛋白（SPS,Sage,3010-12）的緩沖培養(yǎng)液（mHTF,Sage,1023）中研磨,經(jīng)洗滌后獲得睪丸精子。新鮮精液的精子準(zhǔn)備：患者取精前禁欲3～7d，取卵日當(dāng)天采用手淫法取精，患者精子采用梯度離心法進(jìn)行洗滌。將洗滌好的精液加入精子緩沖液（mHTF,Sage,1023）中混勻后置于37℃、6% CO2的培養(yǎng)箱中備用。

（三）顯微注射

將處理后的精液吸取少許加入注射皿中的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或緩沖液液滴里，然后在400倍顯微鏡（NIKON TE-2000U，日本）下挑選精子形態(tài)正常的精子（挑選時(shí)主要觀察指標(biāo)：精子頂體形態(tài)、頭部形態(tài)、頸部形態(tài)及頸部液滴、尾部形態(tài)，要盡量挑選前向運(yùn)動的精子，如果死精子較多時(shí)可選微動精子或尾部彎曲的精子），觀察到所要挑選的精子后，用注射針在精子尾部靠近頭部的1/3處迅速制動（當(dāng)看到精子尾部明顯折痕時(shí)，表示制動完成），隨后，從尾部吸入被制動的精子放置在PVP標(biāo)記過的位置，之后把準(zhǔn)備好的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入注射皿的緩沖液滴（G-mops，Vitrolife，瑞典）中，極體位于6點(diǎn)或12點(diǎn)方向進(jìn)行注射。

（四）精子放大系統(tǒng)的使用

本研究使用精子放大系統(tǒng)結(jié)合ICSI（簡稱IMSI）技術(shù)。具體操作如下。用含10%替代血清白蛋白（SPS, Sage, 3010-12）的緩沖培養(yǎng)液（mHTF, Sage,1023）于玻璃底的平皿（Delta T Dish ,USA）中做數(shù)個(gè)液滴，在液滴中加入傳統(tǒng)放大倍數(shù)（400倍）下挑選的形態(tài)正常的精子，用無菌石蠟油（Oil, Sage, 4008P）覆蓋，利用精子放大系統(tǒng)（OCTAX CytoScreenTM, 德國）于6000倍的顯微鏡視野下進(jìn)行放大觀察［24］，并對精子進(jìn)行拍照，然后測量每個(gè)挑選精子的中段形態(tài)并分A、B、C 3類［21］，同時(shí)記錄精子中有無空泡的情況，以及空泡的位置、直徑。最后將全部精子分為空泡-A、空泡-B、空泡-C、無空泡-A、無空泡-B、無空泡-C 6組。在整個(gè)實(shí)時(shí)觀察過程中不會對精子造成任何損傷，觀察結(jié)束后依然按照顯微注射流程進(jìn)行注射，注射時(shí)按照順序一一對應(yīng)的將精子注射入卵，隨后按照注射順序進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)，以便觀察精子形態(tài)對胚胎發(fā)育的影響，見圖2。

圖2 IMSI下觀察精子形態(tài)（×4000）

（五）胚胎培養(yǎng)及質(zhì)量評分

顯微注射后的卵子、受精卵及胚胎均置于IVF序貫培養(yǎng)液（卵裂期胚胎用G-1/囊胚用G-2，Vitrolife,瑞典）中，在37℃、6% CO2的培養(yǎng)箱（Thermo Scientific Forma 3110, USA）中培養(yǎng)。顯微注射16～20h后觀察受精情況，出現(xiàn)兩原核為正常受精。胚胎的評估采用本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)評分法（D3胚胎采用WIH評分法［25］，囊胚采用Gardner評分法［26］）對胚胎進(jìn)行評分。

D3胚胎評分：（1）卵裂球個(gè)數(shù)用阿拉伯?dāng)?shù)字記錄；（2）碎片比例，碎片是在卵裂過程中產(chǎn)生的被細(xì)胞膜包繞但不含細(xì)胞核的細(xì)胞質(zhì)，無碎片記4分，碎片比例占卵裂期胚胎10%以內(nèi)的記3分，10～25%記2分，26～50%記分，大于50%記0分；（3）卵裂球?qū)ΨQ性，卵裂球之間大小接近（對稱）記1分，大小形態(tài)差異明顯（不對稱）記0分；（4）細(xì)胞核個(gè)數(shù)，觀察卵裂球中細(xì)胞核的數(shù)量，正常為一個(gè)卵裂球包含一個(gè)細(xì)胞核，多余的稱為多核現(xiàn)象；（5）胞漿特性，記錄是否有細(xì)胞器聚集、空泡、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)叢；（6）融合現(xiàn)象及桑葚胚，卵裂球個(gè)數(shù)超過16的卵裂期胚胎為桑葚胚，當(dāng)卵裂球之年界限不清晰，形成一個(gè)類似融資一起的整體稱為融合現(xiàn)象，所有卵裂球均參與融合記為融合Ⅰ，50%以上卵裂球參與融合記為融合Ⅱ，低于50%卵裂球發(fā)生融合記為融合Ⅲ；（7）評分體系，依次按照卵裂球個(gè)數(shù)、碎片比例、卵裂球?qū)ΨQ情況三項(xiàng)指標(biāo)構(gòu)成。D3優(yōu)質(zhì)胚胎評定：D1為2PN、D2卵裂球個(gè)數(shù)在3～5，碎片評分3分或以上、D3卵裂球個(gè)數(shù)在7～9，碎片評分在3分或以上、融合I和II、未見多核卵裂球、未見空泡。

D5/6囊胚評分：（1）1期：早期囊胚，囊胚腔小于胚胎體積的一半；2期：囊胚腔大于胚胎體積的一半；3期：囊胚腔幾乎充滿整個(gè)胚胎；4期：擴(kuò)張囊胚，胚腔大于早期囊胚，透明帶變?。?期：正在孵出的囊胚，一部分從透明帶孵出；6期：完全孵出的囊胚；（2）3～6期的囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞評分：內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的評分：A級：細(xì)胞數(shù)多，緊密；B級：細(xì)胞數(shù)少，松散；C級：細(xì)胞數(shù)很少。滋養(yǎng)層細(xì)胞的評分：A級：上皮細(xì)胞層由較多細(xì)胞組成，大于10個(gè)細(xì)胞，排列緊密；B級：上皮細(xì)胞層由少的細(xì)胞組成，排列松散；C級：上皮細(xì)胞層由稀疏細(xì)胞組成；（3）囊胚期胚胎評分體系：依照囊胚的擴(kuò)展和孵化程度、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)、滋養(yǎng)層細(xì)胞，此三項(xiàng)指標(biāo)構(gòu)成評分主要體系。根據(jù)這個(gè)評分方法,第5d最好的囊胚評分應(yīng)該是4AA；（4）囊胚期優(yōu)質(zhì)胚胎評估標(biāo)準(zhǔn)：3～6期囊胚且內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或滋養(yǎng)層細(xì)胞有一個(gè)評為B級及以上的囊胚。（5）可用囊胚：D5移植或達(dá)到冷凍標(biāo)準(zhǔn)的囊胚。

（六）胚胎冷凍標(biāo)準(zhǔn)

卵裂期胚胎冷的標(biāo)準(zhǔn)：D3優(yōu)質(zhì)胚胎或D3卵裂球在6細(xì)胞以上、碎片評分在2分以上；囊胚冷凍標(biāo)準(zhǔn)：囊胚在3期及3期以上，評分在CC及CC以上。

（七）胚胎移植與妊娠結(jié)果判斷

選擇評分最高的胚胎或囊胚1～2個(gè)在B超下移植，移植后12d檢測血hCG水平以確定是否生化妊娠，移植后4周超聲檢查示子宮腔內(nèi)出現(xiàn)孕囊及胎心搏動即確定為臨床妊娠。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以百分率表示，各組受精率、優(yōu)胚率、可用囊胚率、胚胎冷凍率的比較采用R×C表卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、精子中心體形態(tài)對胚胎發(fā)育的影響

比較空泡組中不同中心體形態(tài)的精子注射入卵后的胚胎發(fā)育情況，結(jié)果表明：空泡-ABC 3組2PN率、D3優(yōu)胚率、可用囊胚率、胚胎冷凍率均無顯著性差異（P＞0.05），而D6囊胚形成率有顯著性差異。無空泡組中不同中心體形態(tài)的精子注射入卵后的胚胎發(fā)育情況，結(jié)果表明：無空泡-ABC三組可用囊胚率和D5囊胚形成率無顯著性差異（P＞0.05），2PN率、卵裂率、D3優(yōu)胚率、D6囊胚形成率、胚胎冷凍率均有顯著性差異（P＜0.05）。

二、精子空泡對胚胎發(fā)育的影響

對中心體形態(tài)為B類的精子進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)無空泡精子注射后2PN率明顯高于空泡精子（P＜0.05）；中心體形態(tài)A類、B類的精子中無空泡精子在D3優(yōu)胚率高于空泡精子，但無顯著性差異（P＞0.05），而中心體形態(tài)A類中無空泡精子組的胚胎冷凍率顯著高于空泡組（P＜0.05），而C類中則是空泡組顯著高于無空泡組（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組不同中心體形態(tài)的精子注射入卵后的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 ［n（%）］

討 論

MSOME技術(shù)的出現(xiàn)給了我們一些提示——精子空泡、精子中段形態(tài)與男性不育是否存在某些關(guān)聯(lián)？精子形態(tài)異常是否會影響胚胎發(fā)育？這些問題都值得我們不斷的探索。目前關(guān)于精子空泡的相關(guān)研究較多［8,11-15,27］，而精子中心體形態(tài)與胚胎發(fā)育關(guān)系的研究較少。在胚胎發(fā)育階段，來自父源性的遺傳物質(zhì)對胚胎的影響從受精時(shí)便開始作用，一直持續(xù)整個(gè)胚胎發(fā)育過程。受精卵中mRNA的轉(zhuǎn)錄開始于4～8細(xì)胞階段（mRNA大多來自卵母細(xì)胞的胞質(zhì)），這標(biāo)志著父方基因的開始表達(dá)。當(dāng)精子遺傳物質(zhì)存在缺陷，將會影響父方基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致胚胎在5～8細(xì)胞階段及后續(xù)發(fā)育過程中緩滯，這種現(xiàn)象稱為后期父源性影響［28］。然而，異常精子也可以通過很多機(jī)制影響受精卵基因組轉(zhuǎn)錄前階段的胚胎發(fā)育，例如受精失敗、胚胎碎片的形成以及胚胎早期卵裂發(fā)育阻滯等，這些影響稱為早期父源性影響［29］。由此可見，精子在胚胎發(fā)育過程中的影響是至關(guān)重要的。

Watanabe［30］和Tanaka［8］認(rèn)為無論男性是否具備生育能力，精子空泡大多數(shù)出現(xiàn)在精子頂體區(qū)域或核區(qū)域。精子頭部頂體中出現(xiàn)的微小空泡和頂體的異常及頂體反應(yīng)缺失相關(guān)［31］。精子頭部出現(xiàn)較大空泡時(shí)（空泡占精子頭部體積＞4%），精子染色體發(fā)生異常解聚的比例要高于那些不含空泡的精子［32,33］。2008年，Vanderzwalmen等［34］將精子分為三類，第一類：精子頭部形態(tài)正常，無空泡或者空泡體積＜頭部4%；第二類：精子頭部形態(tài)正常且最多含2個(gè)小空泡；第三類：精子頭部形態(tài)正常伴多個(gè)小空泡或精子頭部形態(tài)異常。比較后發(fā)現(xiàn)三者受精率并無顯著性差異，而第三類精子在形成胚胎后，在D3優(yōu)胚率和囊胚形成率上明顯低于前兩類。精子頭部空泡體積大于4%時(shí)，精子DNA碎片發(fā)生率顯著高于形態(tài)正常的精子，DNA鏈的斷裂會影響卵裂球細(xì)胞基因組的復(fù)制及表達(dá)過程，破壞細(xì)胞的穩(wěn)定性，同時(shí)染色體若發(fā)生非整倍體分裂，則會被細(xì)胞紡錘體監(jiān)控位點(diǎn)識別，使分裂停滯等［35］，進(jìn)而影響4細(xì)胞胚胎以后階段及囊胚階段的發(fā)育。本研究結(jié)果顯示，對比空泡精子與無空泡精子注射入卵后發(fā)現(xiàn)，后者在正常受精率和胚胎冷凍率上均顯著高于空泡組，由于臨床數(shù)據(jù)有限，仍然需要進(jìn)一步的詳細(xì)研究。

近年來，許多研究表明受精卵的中心體來自父源性遺傳，精子中心體在精卵原核形成過程中起著非常重要的作用［36-40］。人類精子的中心體由中心粒和圍繞在他們周圍的高密度蛋白質(zhì)-中心體基質(zhì)組成，精子的中心粒分為近端中心粒和遠(yuǎn)端中心粒。精子只保留近端中心粒，當(dāng)精子進(jìn)入卵母細(xì)胞后，保留的近端中心粒吸引卵母細(xì)胞中的中心體基質(zhì)，重新組成具有復(fù)制功能的中心體，隨后在中心體蛋白和微管蛋白的參與下不斷重組、改編，最終形成精星體，精星體牽引著兩原核使他們靠近，最終使兩配子染色體組融合，完成受精過程。隨后中心體完成復(fù)制并移動到合子細(xì)胞核周圍，參與后期有絲分裂紡錘體的形成［41,42］。精子中心體功能（精星體形成）是受精的關(guān)鍵，這一結(jié)論也得到了許多研究人員的認(rèn)同［21,43］。接受ICSI治療患者受精失敗是由于精星體形成失敗所致，該研究也證實(shí)了這點(diǎn)［44］。本研究結(jié)果顯示，中心體形態(tài)不規(guī)則的精子注射入卵后，正常受精率有所下降，如C組的受精率僅為57.14%顯著性低于其他兩組，本實(shí)驗(yàn)中當(dāng)中心體形態(tài)較好時(shí)（A組），無空泡組的與空泡組的受精率沒有顯著性差異。Yoshinmoto等［45］用不育患者的精子注入牛卵母細(xì)胞中來評估精子中心體功能，發(fā)現(xiàn)早期的胚胎卵裂及后期的種植、妊娠過程與中心體功能也密切相關(guān)。正常情況下胚胎進(jìn)行對等分裂，當(dāng)中心體功能異常時(shí)，胚胎發(fā)生不均等分裂, 可能有1或2個(gè)卵裂球無細(xì)胞核，最終可能導(dǎo)致胚胎早期發(fā)育的阻滯［42,43］，這也表明中心體功能對早期胚胎的分裂發(fā)育是不可缺少的重要因素。對于無空泡精子按照中心體形態(tài)分為A、B、C 3組［21］，結(jié)果顯示三組在正常受精率、D3優(yōu)胚率和胚胎冷凍率上均有顯著性差異。因此研究結(jié)果提示我們，精子中段形態(tài)的變化會影響卵母細(xì)胞的受精以及胚胎發(fā)育，由此推測中心體形態(tài)可能與中心體結(jié)構(gòu)功能相關(guān)。

本研究系統(tǒng)分析了精子空泡以及中心體形態(tài)對精卵受精及受精卵發(fā)育之間的關(guān)系，當(dāng)患者的精液質(zhì)量較差，精子畸形率較高時(shí)，可以考慮使用IMSI技術(shù)，在高倍放大鏡（×6 000）下觀察、挑選無空泡且中心體形態(tài)較好的精子進(jìn)行顯微注射，降低挑選到遺傳物質(zhì)狀態(tài)異常精子的概率，從而提高此類患者的助孕結(jié)局。但樣本量較少仍是本次研究中存在的主要問題，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)過程中，我們?nèi)匀恍枰M(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，更好的驗(yàn)證精子空泡對胚胎發(fā)育的影響以及中心體形態(tài)與受精及卵裂的關(guān)系。

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（2016-03-15收稿）

Impact of the vacuoles and the shape of the spermmidpiece for ICSI on embryos development of patients undergoing ICSI＊

Meng Xiangqian1, Gong Yi2, Xiong Fu3, He Fei3, Quan Song2**, Liu Jing1**
1. Center for Reproductive Medicine, Chengdu Jingjiang Hospital for Maternal and Child Health Care, Chengdu 610066，China；2. Center for Reproductive Medicine, Department of Obstetrics and Gynecology, Nanfang Hospital, Southern Medical University；3. Department of Medical Genetics,Nanfang Hospital, Southern Medical University,

Quan Song, E-mail:quansong@smu.edu.cn；Liu Jing, E-mail:liujing20060402@126.com

Objective To clarify if there are any vacuoles at the head of sperm using the motile sperm organelle morphology examination （MSOME） system , and evaluate whether the morphology of the sperm midpiece and the head vacuoles in fl uence further embryo development.MethodsSperms were obtained from 57 patients undergoing ICSI as a result of male infertility in the Center for Reproductive Medicine, Chengdu Jinjiang Hospital for Maternal and Child HealthCare. Normal morphology of sperms were selected under a magnification of ×200-×400 at first, then the selective sperms were observed under high magnification of 6000×. According to the shape of sperm medpiece ,there were three classes:（A class: 1≤a/b≤1.2；B class: a/b≥1.5；C class: other）. These sperms were divided into six groups based on the shape of the sperm midpiece and existing vacuoles under 6000 magnification.（vacuoles-A group: 1≤a/b≤1.2, there was at least one vacuole exist in the head of sperm；vacuoles-B group：a/b≥1.5 and there was at least one vacuole exist in the head of sperm；vacuoles-C group: other and there was at least one vacuole exist in the head of sperm；vacuole free-A group；vacuole free-B group；vacuole free-C group） at 6000 magnification. The oocytes of 57 ICSI couples were injected with spermatozoa of six groups.ResultsThere were no signif i cant differences between thevacuoles-A group, vacuolesThere were no statistically significant differences between the vacuoles-A group、vacuoles-B group、vacuoles-C group were observed with regard to rates of fertilization, D3 top quality embryo，blastocyst formation,cryopreservation （P＞0.05）. There were no statistically significant differences in rate of blastocyst formation （P＞0.05） between the vacuoles free-A group、vacuole free-B group、vacuole free-C group, the rates of fertilization（74.48 %VS 84.62 %VS 57.14% ）, cleavage（96.17%vs 97.06%vs80.95%）, D3 top quality embryo （35.48% vs 39.39 %vs 9.09%）, D6-blastocyst （21.05%vs34.78%vs0）, cryopreservation（31.25 %vs 26.92% vs 0） were statistically significant different （P＜0.05）. Furthermore, the rate of cryopreservation（14.63 %vs 31.25%）were statistically significant different（P＜0.05）between the vacuoles-A group and vacuoles free-A group. The rate of fertilization（57.14 %vs 84.62%）were statistically signif i cant different （P＜0.05） between the vacuoles-B group and vacuoles free-B group. The rates of blastocyst formation （40.0% vs 0）, cryopreservation （50.00% vs 0） were statistically signif i cant different （P＜0.05） between the vacuoles-C group and vacuoles free-C group. There were no statistically significant difference about other indexes in the three classes sperms.ConclusionA significant improvement in normal fertilization rate and D3 top quality embryo rate and cryopreservation rate was found through selecting sperms based on normal midpiece morphology and no vacuole. This preliminary result need to be further validated by enlarge the sample size

sperm injections, intracytoplasmic；spermatozoa；vacuoles；centrosome；embryonic development

10.3969/j.issn.1008-0848.2016.06.002

R321-33

資助： 國家自然科學(xué)基金（81170575）；四川省科學(xué)廳基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究項(xiàng)目（2012JY0066）；四川省醫(yī)學(xué)科研青年創(chuàng)新課題（Q15056）

**通訊作者：全松, E-mail:quansong@smu.edu.cn；劉敬, E-mail:liujing20060402@126.com