蛋白質(zhì)水解酶和樣品預(yù)處理優(yōu)化技術(shù)在蛋白質(zhì)組學研究中的應(yīng)用

吳飛林，趙明治，張瑤,3，熊智，徐平 西南林業(yè)大學 生命科學學院，云南 昆明 6504 軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所 蛋白質(zhì)組學國家重點實驗室 國家蛋白質(zhì)科學中心 (北京) 北京蛋白質(zhì)組研究中心 蛋白質(zhì)藥物國家工程研究中心，北京 0063 中國科學院微生物研究所，北京 000

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蛋白質(zhì)水解酶和樣品預(yù)處理優(yōu)化技術(shù)在蛋白質(zhì)組學研究中的應(yīng)用

吳飛林1,2，趙明治2，張瑤2,3，熊智1，徐平2
1 西南林業(yè)大學 生命科學學院，云南 昆明 650224
2 軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所 蛋白質(zhì)組學國家重點實驗室 國家蛋白質(zhì)科學中心 (北京) 北京蛋白質(zhì)組研究中心 蛋白質(zhì)藥物國家工程研究中心，北京 102206
3 中國科學院微生物研究所，北京 100101

吳飛林, 趙明治, 張瑤, 等. 蛋白質(zhì)水解酶和樣品預(yù)處理優(yōu)化技術(shù)在蛋白質(zhì)組學研究中的應(yīng)用. 生物工程學報, 2016, 32(3): 306–316.

Wu FL, Zhao MZ, Zhang Y, et al. Application of optimized multi-enzyme combination and sample pretreatment in proteomics. Chin J Biotech, 2016, 32(3): 306–316.

摘 要:蛋白質(zhì)組學是全景式鑒定、定量蛋白質(zhì)，并研究蛋白質(zhì)功能的學科?；诟叻直尜|(zhì)譜的鳥槍法蛋白組學研究技術(shù)首先利用不同的位點特異性蛋白酶對復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品進行酶解，進而利用質(zhì)譜獲得蛋白質(zhì)相關(guān)的定性和定量信息。為了獲得高質(zhì)量的質(zhì)譜信息，前期的樣品處理和質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集同樣重要。本文對蛋白組學中常用的Trypsin、Lys-C、Glu-C等位點特異性蛋白酶的酶切特點進行了總結(jié)，并綜述了目前常用的幾種酶切組合策略和樣本預(yù)處理技術(shù)在提高蛋白質(zhì)組學研究效率中的作用。

關(guān)鍵詞:蛋白質(zhì)組學，蛋白質(zhì)水解酶，多種酶組合技術(shù)，過濾器輔助樣品制備技術(shù)

Received: August 20, 2015; Accepted: November 4, 2015

Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (Nos. 2011AA02A114, SS2012AA020502, 2014AA020900, 2014AA020607), National Basic Research and Development Program of China (973 Program) (Nos. 2011CB910600, 2013CB911200), National Natural Science Foundation of China (Nos. 31470809, 31170780) , Beijing Natural Science Foundation (No. 5152008), Special Research Foundation of the Forestal Public Welfare (No. 201304105).

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃 (863計劃) (Nos. 2011AA02A114, SS2012AA020502, 2014AA020900, 2014AA020607)，國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃 (973計劃) (Nos. 2011CB910600, 2013CB911200)，國家自然科學基金 (Nos. 31470809, 31170780)，北京市自然科學基金 (No. 5152008)，林業(yè)公益性行業(yè)科研專項 (No. 201304105) 資助。

蛋白質(zhì)組 (Proteome) 的狹義定義是指生物的細胞、組織或者器官所有蛋白質(zhì)，包括基因轉(zhuǎn)錄、翻譯后直接產(chǎn)物及其翻譯后修飾(PTM) 的蛋白質(zhì)的總和。蛋白質(zhì)是生物學功能的直接執(zhí)行者，表達失調(diào)可能會導(dǎo)致疾病的發(fā)生和發(fā)展。因此，對蛋白質(zhì)表達水平、功能、相互作用、細胞內(nèi)定位信息的獲取和生物體本身蛋白質(zhì)基礎(chǔ)的了解，是研究這些蛋白質(zhì)生物學功能的前提和基礎(chǔ)[1-3]。蛋白質(zhì)組學是系統(tǒng)鑒定和定量生物體蛋白質(zhì)，并研究蛋白質(zhì)生物學功能的新興學科。

蛋白質(zhì)組學研究的初期階段，復(fù)雜蛋白樣品的分離主要是通過雙向 (2D) 凝膠電泳技術(shù)。質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展和軟電離技術(shù)的發(fā)展，使得基于凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)鑒定成為可能[4]。

蛋白質(zhì)組學研究中，膠內(nèi)消化的局限性在一定程度上限制了蛋白質(zhì)檢測的動態(tài)范圍。相比較而言，蛋白質(zhì)溶液消化預(yù)處理的方法逐漸地嶄露頭角[5]。隨著液相色譜分離技術(shù)、質(zhì)譜鑒定技術(shù)和生物信息解析蛋白質(zhì)序列技術(shù)的發(fā)展，鳥槍法蛋白質(zhì)組 (主要是Bottom-up蛋白質(zhì)組) 逐漸成為基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組定性鑒定和定量的核心技術(shù)。但多年來位點特異性蛋白酶的開發(fā)及其在蛋白質(zhì)組樣品制備中的優(yōu)化、使用沒有得到應(yīng)有的重視，一定程度上影響了蛋白質(zhì)組學學科的發(fā)展。

本文主要從3種常見的蛋白水解酶出發(fā)，對它們的優(yōu)缺點和蛋白質(zhì)組學樣品預(yù)處理等方面進行闡述，并對蛋白質(zhì)水解酶的發(fā)展趨勢和應(yīng)用前景做出展望。

1　蛋白質(zhì)組學研究常用的蛋白酶

蛋白水解酶種類繁多，在生物體內(nèi)通過對蛋白樣品的消化 (如氨基酸肽鍵之間水解)，實現(xiàn)蛋白質(zhì)的降解、吸收及激活等復(fù)雜而重要的功能[6]。蛋白水解酶主要涉及多種生理過程，包括組成蛋白質(zhì)氨基酸的分選和回收、細胞周期、細胞分化和遷移、組織的形態(tài)發(fā)生和重塑等過程[7]。蛋白質(zhì)水解過程的異?；蚴д{(diào)和許多病理過程密切相關(guān)，例如癌癥、關(guān)節(jié)炎和心血管疾病等[8]。

根據(jù)國際酶學委員會 (EC) 分類，蛋白水解酶屬于3.4亞類 (水解主要作用在肽鍵上)，分為肽段內(nèi)切酶和外肽酶。肽段內(nèi)切酶作用于蛋白質(zhì)內(nèi)部的肽鍵，而外肽酶酶切的氨基酸肽鍵主要來自于蛋白質(zhì)N-端或C-端，因此也稱為氨肽酶或羧肽酶。蛋白酶的進一步分類主要是基于它們的催化機制、特異性和其他性質(zhì)。如大多數(shù)已知蛋白酶的活性位點為半胱氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺或者是和水結(jié)合的金屬離子，這些活性位點也可以作為蛋白酶類型的定義。蛋白水解酶的特異性往往比較低，只有少量酶切位點特異性的蛋白酶可以用于蛋白質(zhì)組學研究。目前常用的蛋白酶主要有胰蛋白酶 (Trypsin)、谷氨?；鶅?nèi)切酶 (Glu-C)、賴氨?；鶅?nèi)切酶 (Lys-C) 和天冬氨酸酰胺基內(nèi)切酶 (Asp-N) 等。

胰蛋白酶是一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)水解酶，其水解位點位于蛋白質(zhì)底物C端側(cè)鏈的精氨酸和賴氨酸相連的肽鍵。Lys-C是一種絲氨酸蛋白酶，它能特異水解賴氨酸的羧基端 (與精氨酸相連時除外)，可以產(chǎn)生比胰蛋白酶更長的酶解肽段。Lys-C也比胰蛋白酶更為穩(wěn)定，在一些苛刻的條件中，例如8 mol/L尿素中，活性不受影響，因此Lys-C經(jīng)常在胰蛋白酶酶切之前使用。Glu-C也是一種常見的胞內(nèi)蛋白酶，能特異切割蛋白質(zhì)底物C端的天冬氨酸及谷氨酸相鄰的肽鍵，發(fā)揮酶活力的最適pH范圍在4.0–9.0之間，且酶切特異性易受緩沖液的影響。在碳酸氫銨和醋酸銨緩沖液中，該酶對谷氨酸殘基的酶切特異性更高；而在磷酸鹽緩沖液中，谷氨酸和天冬氨酸殘基均可被酶切。三種蛋白水解酶單獨使用的時候，都可以特異性地酶切蛋白質(zhì)的序列。采用不同蛋白水解酶的組合，對蛋白序列的確認和一些翻譯后修飾位點的鑒定都是非常有幫助的。

1.1胰蛋白酶

胰蛋白酶 (EC 3.4.21.4)，是一種絲氨酸蛋白酶，在脊椎動物和無脊椎動物中廣泛表達。胰蛋白酶在表達時通常以無活性的酶原 (胰蛋白酶原) 形式表達，經(jīng)腸激酶或者胰蛋白酶本身活化后形成具有活性的胰蛋白酶。該酶可特異地在蛋白質(zhì)底物的賴氨酸和精氨酸的羧基端進行酶切水解，但當賴氨酸和精氨酸后的氨基酸是脯氨酸時，水解不會發(fā)生。胰蛋白酶消化可產(chǎn)生含有一個堿性精氨酸或者賴氨酸結(jié)尾的短肽，比較適合肽段的碎裂，形成較強的b和y離子系列對，適于現(xiàn)有的鑒定算法。另外，該酶價格合理，在實踐中得到了廣泛應(yīng)用。

目前常見的胰蛋白酶以豬源、牛源和人源胰蛋白酶為主。以人為例，胰腺分泌陽離子型胰蛋白酶原 (Cationic trypsinogen)、陰離子型胰蛋白酶原 (Anionic trypsinogen) 和腦胰蛋白酶原 (Mesotrypsinogen) 等3種胰蛋白酶原。這些胰蛋白酶原的編碼基因分別為PRSS1、PRSS2 和PRSS3。胰蛋白酶原在胰臟中表達后被分泌到胰液，并隨胰液轉(zhuǎn)運到小腸。在腸激酶的作用下，胰蛋白酶原的N端保護序列 (識別位點為DDDDK) 被切除并激活。被激活的胰蛋白酶被稱為β-胰蛋白酶，可進一步激活更多的酶原。對豬陽離子胰蛋白酶的結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)經(jīng)過EK 酶 (腸激酶，Enterokinase) 活化，露出第16位氨基酸殘基新的N端序列。該序列可插入靠近第195位的絲氨酸的位置，并且跟相鄰的天冬氨酸形成離子對，從而實現(xiàn)其他氨基酸的結(jié)構(gòu)重排，其中Gly193 被重排到合適的位置而形成氧陰離子穴，最終完成胰蛋白酶的激活，形成的活性位點的關(guān)鍵氨基酸包括His57、Asp102 和Ser195[9]。

β-胰蛋白酶除了可以對底物蛋白進行酶切外，也可以發(fā)生自消化，比較典型的是在Lys131-Ser132之間發(fā)生自切而產(chǎn)生α-胰蛋白酶。α-胰蛋白酶通過分子內(nèi)二硫鍵維持其完整的分子狀態(tài)，但其活性顯著降低。因此通過化學修飾降低胰蛋白酶自消化是維持其高蛋白酶活性的重要方法。位點特異性修飾如乙?；痆10]和甲基化[11]是目前通用的抑制胰蛋白酶自消化策略。

此外，胰蛋白酶與胰凝乳蛋白酶(Chymotrypsin) 在胰臟中共表達。在純化過程中這2種蛋白酶很難完全分開，因此在純化的胰蛋白酶中難于完全去除胰凝乳蛋白酶的活性，這使得動物來源的胰蛋白酶具有非特異性酶切活性。因此，需要對純化產(chǎn)物進行甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮 (TPCK) 處理，以達到淬滅胰凝乳蛋白酶的作用。

1.2賴氨?；鶅?nèi)切酶 (Lys-C)

Lys-C是特異酶切蛋白C端賴氨酸殘基的胞內(nèi)蛋白酶，Masaki等第一次從無色桿菌Achromobacter lyticus M497-1的肉湯培養(yǎng)基中分離純化得到[12]。該酶具有很強的特異性，特異水解蛋白質(zhì)C端賴氨酸的肽鍵，其中也包括賴氨酸和脯氨酸形成的肽鍵[12-13]，其反應(yīng)的pH范圍比較廣，在8.5到10.7之間[14]。除了底物的專一性特性，該酶還具有其他特異的特征，如蛋白水解活性高于牛源的胰蛋白酶幾個數(shù)量級[14]，在5 mol/L尿素 (甚至更高) 和0.1% SDS(十二烷基磺酸鈉) 的溶液中也能表現(xiàn)出高效的活性，這些特點彌補了胰蛋白酶在上述溶液中酶切活性低的缺陷。由于Lys-C的這些優(yōu)點，Masaki等成功地利用Achromobacter 蛋白酶作為工具，開展蛋白的氨基酸序列研究[15]。

自從Lys-C發(fā)現(xiàn)以來，主要基于原始菌株對該蛋白酶的作用機理和蛋白酶的純化進行研究。Lys-C主要從A. lyticus[11]、綠膿假單胞菌Pseudomonas aeruginosa[16]和產(chǎn)酶溶桿菌Lysobacter enzymogenes[17]等菌株合成。Kuhlman等[18]以L. enzymogenes ATCC 27796作為研究對象，基于不含動物源成分的培養(yǎng)基生產(chǎn)的純Lys-C蛋白酶，該蛋白酶對于賴氨酸殘基的特異性酶切更強，且內(nèi)毒素低、耐存儲、并可反復(fù)凍融，更適于在蛋白質(zhì)組學研究中廣泛使用。

1.3谷氨酰基內(nèi)切酶 (Glu-C)

金黃色葡萄球菌胞內(nèi)蛋白酶Glu-C是絲氨酸蛋白酶[19]，它可以特異地酶切與蛋白C端谷氨酸或者天冬氨酸殘基結(jié)合的肽鍵，但是與前者相比，對后者的酶切速率要慢大約300多倍[20]。該酶在pH 3.5?9.5范圍內(nèi)均有活性，最佳活性的pH在4.0到7.8之間。研究表明氟磷酸鹽可以特異地抑制其活性[21]。通過對蛋白質(zhì)序列的優(yōu)化并且經(jīng)過重組表達，分別實現(xiàn)大腸桿菌Escherichia coli[22]、枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis[23]、灰色鏈霉菌Streptomyces griseus[24]等宿主中的重組表達和純化。和大多數(shù)蛋白水解酶一樣，大腸桿菌中表達Glu-C (Glu V8) 也存在自身降解現(xiàn)象[25]。Ono等對前肽序列研究表明其5個位點突變可以使Glu-C抑制其自身降解現(xiàn)象[26]，這是由于前導(dǎo)肽序列中4個氨基酸發(fā)揮了分子內(nèi)伴侶的作用[25]，有效地保護自身的序列。但是對于去除前導(dǎo)肽序列的重組表達Glu-C的方法至今還沒有人報道。

在蛋白質(zhì)組學研究中，Glu-C單一酶切可以很好地應(yīng)用于分離和富集磷酸化肽段的鑒定[27]。與單一酶切相比，Glu-C與胰蛋白酶聯(lián)用不僅有效地提高蛋白質(zhì)鑒定的序列覆蓋度，而且提升了基于質(zhì)譜檢測的可信度[28]。

Asp-N、糜蛋白酶和胃蛋白酶等蛋白酶雖然在一些實驗中有采用，但與Trypsin、Lys-C、Glu-C這3種常見的酶相比，這些非常見蛋白酶在酶切條件和兼容性方面，都不是很成熟，例如Asp-N是一種金屬蛋白內(nèi)切酶，從莓實假單胞菌Pseudomonas fragi的突變菌株中分離出來，水解的蛋白N端天冬氨酸和半胱氨酸殘基，平均分子量為24.5 kDa，酶切的最佳pH為6.0 和8.5[29-30]。

糜蛋白酶 (Chymotrypsin) 別名胰凝乳蛋白酶、α-糜蛋白酶、甲-糜蛋白酶，是胰液中消化酶的一種，主要在十二指腸中發(fā)揮水解酶的作用，酶切蛋白和多聚肽[31]。商品化的糜蛋白酶主要來源于牛胰腺，糜蛋白酶優(yōu)先酶切的是酰胺鍵C端的疏水性氨基酸 (例如酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)，肽鍵的水解位置含有其他氨基酸 (亮氨酸和蛋氨酸) 水解速率將會降低[32-33]。

胃蛋白酶和胰蛋白酶、糜蛋白酶一樣是消化系統(tǒng)中3種主要的蛋白降解或者蛋白水解酶之一，是天門冬氨酸水解酶家族成員之一。在消化的過程中，這些酶特異酶切氨基酸的肽鍵，共同作用把膳食蛋白酶切成它們的共同組成成分，例如肽段和氨基酸，促進腸膜吸收。胃蛋白酶酶切位點比較廣泛，其中最有效的酶切序列是疏水性氨基酸之間的肽鍵，更適宜的是芳香族氨基酸，例如酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸[34]。該酶在酸性環(huán)境中具有較高活性，其最適pH值約為3。在中性或堿性pH值的溶液中，胃蛋白酶會發(fā)生解鏈而喪失活性，相對于蛋白質(zhì)組學實驗中的酶切條件，這種條件比較苛刻。

LysargiNase蛋白水解酶主要酶切蛋白N端的賴氨酸和精氨酸殘基[35]，雖說這種性質(zhì)在蛋白質(zhì)組學中備受關(guān)注，但是其來源比較少，酶活性也不理想，難于使用。在我們的研究中也觀察到此現(xiàn)象，結(jié)果待發(fā)表。因此，目前這些酶在蛋白質(zhì)組學大規(guī)模數(shù)據(jù)集中應(yīng)用相對比較少。

2　蛋白質(zhì)組學常用胰蛋白水解酶的不足及優(yōu)化

商品化胰蛋白酶主要來源于豬或牛的胰臟，經(jīng)分離純化得到。這種方法得到的胰蛋白酶雖然產(chǎn)量很大，但是存在病原污染等危險，其安全性和活性不能得到保障，從而限制了它在生物制藥中的應(yīng)用。此外，由于動物胰臟中的胰糜蛋白酶與胰蛋白酶的性質(zhì)極其相似，提取純化過程中二者較難分開，因此胰蛋白酶常伴有糜蛋白酶活性。糜蛋白酶為非特異性酶，具有催化酶切酪氨酸、苯基丙氨酸和色氨酸等氨基酸的活性。這使得酶切位點過多，產(chǎn)生的肽段太短，不利于質(zhì)譜鑒定。此外，不加修飾的胰蛋白酶會自身酶解成肽段，影響蛋白質(zhì)測序和肽段的質(zhì)譜分析。

胰蛋白酶原具有自身活化和自身降解的特性，在真核系統(tǒng)中表達，難于得到完整的胰蛋白酶原，并且其活化為有活性的胰蛋白酶會對宿主細胞造成一定的毒性[36]。本實驗室利用大腸桿菌作為表達體系，實現(xiàn)了豬胰蛋白酶原的重組表達。胰蛋白酶原以包涵體的形式表達，經(jīng)過復(fù)性和乙?；揎椀炔襟E，成功獲得穩(wěn)定性和活性遠遠高于動物來源胰蛋白酶的重組乙?；鹊鞍酌?，目前該酶已用于大規(guī)模蛋白組學研究[10]。

蛋白質(zhì)組學基于高精度現(xiàn)代質(zhì)譜儀可對復(fù)雜蛋白樣品進行鑒定、定量以及翻譯后修飾中的位點分析。在鳥槍法蛋白質(zhì)組學中，上述分析多數(shù)基于胰蛋白酶進行酶切實現(xiàn)的，但是并不是所有的序列都可以通過這種方法檢測到[38]。由于整個蛋白質(zhì)序列中精氨酸和賴氨酸殘基分配不均和數(shù)量的限制，可能導(dǎo)致特定區(qū)段序列偏長，不利于質(zhì)譜鑒定。在一些感興趣的序列區(qū)域，例如，轉(zhuǎn)膜區(qū)包含豐富的翻譯后修飾位點，容易形成漏切，胰蛋白酶的酶切不完全，影響了蛋白質(zhì)的有效鑒定[39]，不利于重要蛋白的后續(xù)功能分析。為提高特異性消化的效率，在實踐中利用Lys-C和胰蛋白酶的級聯(lián)消化可獲得更完全的消化肽段[38]。另一方面，在大多數(shù)酶切產(chǎn)物中胰蛋白酶完全酶切所產(chǎn)生的肽段，56%以上的長度少于6個氨基酸殘基。這些肽段太小，也不利于質(zhì)譜的鑒定，從而限制了蛋白質(zhì)肽段的覆蓋[40]。

3　蛋白質(zhì)組學樣品的溶液酶切的劣勢和優(yōu)化

目前蛋白質(zhì)酶解成肽段的策略主要包括膠內(nèi)消化和溶液酶切兩種。膠內(nèi)消化涉及去污劑對蛋白質(zhì)的溶解，首先通過SDS-PAGE對蛋白質(zhì)的分離接著進行膠內(nèi)消化[41]。溶液酶切主要通過溶解能力較強且酶切兼容性的試劑抽提蛋白質(zhì)，例如尿素和硫脲進行蛋白質(zhì)的變性，實現(xiàn)蛋白質(zhì)的有效溶出。隨后通過降低尿素或者其他解離試劑濃度，實現(xiàn)變性條件環(huán)境下蛋白質(zhì)的溶液消化 (‘in-solution’ digestion)[42]。膠內(nèi)消化的優(yōu)勢是基于強去污劑SDS溶解蛋白比較完全，但是其缺點是肽段的抽提效率難以保證、操作復(fù)雜和不易進行自動化處理等。溶液消化易實現(xiàn)自動化，可以進行大容量平行樣品處理，為了實現(xiàn)對復(fù)雜樣品的質(zhì)譜前預(yù)分離，需要采用HPLC (SCX或者高pH-C18) 對消化肽段進行分離[43-44]，但缺點是很難保證蛋白樣品的完全溶解、消化時容易被其他干擾物質(zhì)影響等。因此如何實現(xiàn)蛋白質(zhì)的充分溶解，排除表面活性劑的干擾是實現(xiàn)溶液酶切成功的關(guān)鍵。為了得到更充分的酶切，多種技術(shù)應(yīng)運而生，并得到業(yè)界的廣泛使用。

3.1膜輔助樣品制備 (Filter-aided sample preparation, FASP) 技術(shù)在蛋白質(zhì)樣品預(yù)處理中的應(yīng)用

SDS可以對細胞和組織樣品來源的蛋白樣品溶解，是目前溶解能力最強的表面活性劑。但是SDS濃度高于0.1%時會影響胰蛋白酶的消化，進而影響肽段在質(zhì)譜檢測中的離子化。因此，SDS的去除是蛋白質(zhì)組學研究尤其是溶液酶切中非常重要的因素。FASP技術(shù)[45]是最近幾年發(fā)展起來的一種對質(zhì)譜樣品前期處理的方法。該方法首先通過SDS完全溶解蛋白質(zhì)組樣品，然后通過超濾裝置 (如3 kDa，10 kDa超濾管) 用8 mol/L尿素緩沖液將SDS緩沖液替換出來，避免SDS對蛋白質(zhì)消化和質(zhì)譜分析的干擾。超濾裝置被認為是一個“蛋白質(zhì)組反應(yīng)器”，可除去去污劑，實現(xiàn)緩沖液的替換，減少化學修飾。隨后通過兩步酶切，從而實現(xiàn)蛋白的完全溶液酶切。

FASP方法包括4步：1) 先用SDS對蛋白樣品進行完全溶解，并對蛋白中的二硫鍵進行還原；2) 通過超濾實現(xiàn)8 mol/L尿素替換SDS和對還原的半胱氨酸進行烷基化修飾；3) 在8 mol/L尿素條件下充分利用Lys-C耐受高濃度尿素的特性，首先進行Lys-C過夜消化，有效避免功能重要但易聚集沉淀蛋白質(zhì)的丟失，進而將溶液稀釋至2 mol/L尿素后，添加胰蛋白酶繼續(xù)消化4 h；4) 肽段的洗脫和脫鹽。

FASP方法一個重要的特征是其過濾膜可以保留高分子量的物質(zhì) (蛋白質(zhì)和DNA)，過濾低分子量的物質(zhì) (雜質(zhì)和消化的肽段)。選擇一個理想分離能力的超濾管是非常重要的。消化結(jié)束后通過超濾收集濾過液并真空干燥和脫鹽獲得的肽段，適合后續(xù)的LC-MS/MS分析。該方法操作簡單，并且其蛋白質(zhì)鑒定效率和覆蓋度高于膠內(nèi)消化，因而得到了越來越多的應(yīng)用。

FASP方法可以耐受來自于任何起源生物材料中的蛋白質(zhì)裂解液 (含SDS)，因此不論哪個亞細胞定位的細胞或者蛋白質(zhì)都可以有效地增溶，膜蛋白也不例外。隨著超微體積過濾裝置的出現(xiàn)，F(xiàn)ASP可以處理微克級以上的蛋白。在FASP的原始文獻初次報道中[45]，作者采用20 mg小鼠組織的蛋白質(zhì)組樣品，其中包括腦組織、眼睛組織、肝臟組織、脾臟組織和骨骼肌組織，單個流程中最多可以鑒定超過1 000個蛋白，其中膜蛋白數(shù)量為797±43個。并且對蛋白的序列覆蓋度和對疏水性較高的蛋白如膜蛋白的鑒定數(shù)量上有明顯優(yōu)勢。在哺乳動物的復(fù)雜蛋白質(zhì)組深度覆蓋分析中，F(xiàn)ASP技術(shù)也是一個重要的樣品處理技術(shù)。本實驗室利用FASP方法，進一步優(yōu)化膜蛋白的提取和溶解緩沖液的方法并進行質(zhì)譜分析，獲得了比膠內(nèi)消化更多的膜蛋白，充分證明了FASP在處理特殊樣本方面可替代膠內(nèi)消化，如膜蛋白等特殊樣本中有很好的應(yīng)用前景。同時對于一些微量級、珍貴的樣本 (如染色體和核蛋白等)，應(yīng)該也是很不錯的選擇。

3.2蛋白水解酶組合及其在提高消化效率和蛋白質(zhì)鑒定覆蓋度中的應(yīng)用

多種蛋白酶組合酶切蛋白質(zhì)樣品的策略已被廣泛地應(yīng)用。不同的研究者通過不同酶切組合技術(shù)，旨在實現(xiàn)樣本鑒定中的高覆蓋和更多的蛋白鑒定。

基于單一蛋白酶測序常采用的策略是通過使用蛋白的餾分簡化樣品復(fù)雜度和對目的蛋白富集，進而增加蛋白鑒定數(shù)量和提高序列覆蓋度[46-47]。近來，通過選擇多種蛋白酶組合酶切來提高蛋白序列覆蓋研究已取得了新的進展。由于具有高的蛋白水解酶活性和酶切位點特異性，胰蛋白酶仍然是質(zhì)譜技術(shù)中應(yīng)用最普遍的酶。但是胰蛋白酶對底物蛋白質(zhì)消化不完全，而且折疊緊密的蛋白質(zhì)具有胰蛋白酶抵抗性，降低了胰蛋白酶對蛋白鑒定數(shù)量和序列覆蓋度的貢獻。

Yates實驗室[48]發(fā)明了一種組合消化的策略，通過Lys-C與胰蛋白酶互補進行消化，彌補了這些缺點。胰蛋白酶緊接著Lys-C消化，克服了緊密折疊蛋白對水解的抑制。Saveliev等[49]也發(fā)明了一種Trypsin/Lys-C Mix的方法使蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析更高效。相對于單一胰蛋白酶消化，Trypsin/Lys-C Mix使蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量增加了20%以上，而且實驗變異系數(shù)為0.5%，表明消化效率的提高可以在重復(fù)實驗中重現(xiàn)，這使蛋白質(zhì)的定量更加準確。這個研究結(jié)果也被Glatter等證實[50]。Biringer等[51]發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶和Glu-C消化人的腦脊液樣品可增加蛋白的鑒定，也提高了序列覆蓋度。Swaney等[40]開展了多種位點特異性蛋白酶 (Trypsin、Lys-C、Arg-C、Asp-N和Glu-C)) 的組合酶切蛋白質(zhì)組學研究，結(jié)果顯示盡管這個方法對于蛋白數(shù)量的增加不顯著，但是一定程度上提高了平均序列覆蓋 (從24.5%到43.4%)。Nagaraj等[52]首先對樣品進行預(yù)分離，接著進行胰蛋白酶、Lys-C 和Glu-C酶切兩種不同方法的組合對Hela細胞系進行高覆蓋蛋白質(zhì)組學研究，幾乎獲得了人細胞系的高覆蓋，共鑒定了10 255個蛋白和166 420個肽段。但上述研究都是基于不連續(xù)的酶消化。最近Mann實驗室開發(fā)了一種新的策略[53]，使用連續(xù)的消化并過濾，進行兩步和三步消化，對胰蛋白酶、Lys-C、Glu-C、Arg-C和 Asp-N進行多種組合分析。與單一胰蛋白酶消化相比，Lys-C和胰蛋白酶的連續(xù)使用，能夠鑒定多達40%的蛋白和磷酸化位點。Mirzaei等[54]用Hela細胞系通過1種、2種和3種酶組合的共計48種消化方式，篩選出了特定物種最佳消化組合的實驗方法，結(jié)合強陰離子分餾技術(shù)，有效地提高了蛋白質(zhì)組鑒定的序列覆蓋度，共鑒定到8 539個蛋白和419 952個獨特的肽段序列，平均序列覆蓋度達到44.7%。這個數(shù)量是在單一起始樣品中鑒定的最高記錄。Jacek和Mann[53]在研究連續(xù)酶切中使用FASP技術(shù)，可以實現(xiàn)肽段最大程度的分離，進一步增加了蛋白和肽段的數(shù)量。在低于微克級的蛋白質(zhì)組樣品，Lys-C和胰蛋白酶連續(xù)使用實現(xiàn)比單一胰蛋白酶消化多鑒定40%以上的蛋白和磷酸化位點，有效提升了蛋白鑒定效率，提高了序列覆蓋度。

通過不同酶切技術(shù)組合提高蛋白和肽段鑒定的數(shù)量，對于深入研究生物體功能和新基因的發(fā)現(xiàn)提供了新方向。

4　展望

隨著人類基因組計劃的完成，生命科學研究已進入了后基因組時代。生命科學的主要研究對象是功能基因組學。近幾年的發(fā)展，蛋白質(zhì)組學獲得了高速發(fā)展，不論是從軟件方面還是從硬件方面都有了很大的提升。位點特異性蛋白酶的開發(fā)和利用，進一步提升了蛋白質(zhì)組鑒定技術(shù)的效率。最近Overall實驗室通過蛋白質(zhì)重組表達的技術(shù)第一次從乙酸甲烷八疊球古菌Methanosarcina acetivoran純化表達得到了新的蛋白水解酶lysargiNase[35]，可以特異地酶切蛋白N端的賴氨酸和精氨酸殘基，促進了蛋白C端肽段的鑒定。不僅如此，該酶切還可以發(fā)生在賴氨酸或精氨酸單雙甲基化的位點，可促進這些位點表觀遺傳學修飾的檢測。因此對新型蛋白酶和多酶切組合技術(shù)的開發(fā)，將促進低豐度蛋白質(zhì)及其翻譯后修飾位點的鑒定。低豐度蛋白及其翻譯修飾位點的確定可能對疾病機制研究、發(fā)展預(yù)警和診斷治療都有重要的意義?；谀壳暗奈墨I報道，多個蛋白酶的組合酶切，對蛋白鑒定數(shù)量的提高沒有明顯的改善，但是不同蛋白酶的組合對蛋白的序列覆蓋有比較大的貢獻，這對蛋白翻譯后修飾以及疾病相關(guān)的突變研究非常有利。膠內(nèi)消化操作雖然相對成熟，但是其操作復(fù)雜性以及酶兼容性差等問題，阻礙了該方法在大規(guī)模蛋白組學樣品制備中的應(yīng)用。目前FASP方法的應(yīng)用越來越多，因為其操作的便捷性、更高的蛋白覆蓋率和更多的蛋白鑒定率，受到蛋白質(zhì)組學研究者的推崇。但是有其自身弱勢 (如低分子量蛋白的低鑒定率，尿素對某些蛋白的溶解能力有限等)，促使研究者對該方法做進一步的優(yōu)化。

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(本文責編 陳宏宇)

動物及獸醫(yī)生物技術(shù)

Application of optimized multi-enzyme combination and sample pretreatment in proteomics

Feilin Wu1,2, Mingzhi Zhao2, Yao Zhang2,3, Zhi Xiong1, and Ping Xu2
1 Life Science College, Southwest Forestry University, Kunming 650224, Yunnan, China
2 State Key Laboratory of Proteomics, Beijing Proteome Research Center, National Engineering Research Center for Protein Drugs, National Center for Protein Sciences, Beijing Institute of Radiation Medicine, Beijing 102206, China
3 Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China

Abstract:Proteomics is a powerful subject focusing on large-scale study of protein structures and functions. A complete enzymatic digestion of protein complexes is the key step in modern high-resolution and high-throughput mass spectrometry (MS)-based identification and quantification. To achieve MS analysis, both peptide sample pretreatment and data acquisition are prerequisite in proteomic studies. In this paper, we summarized both the enzymatic proprieties of three common proteolytic enzymes, Trypsin, Lys-C and Glu-C, the optimization of multi-enzyme combination and an advanced sample pretreatment in proteomics research.

Keywords:Proteomics, proteolytic enzyme, multi-enzyme combination, filter-aided sample preparation

Corresponding authors: Ping Xu. Tel: +86-10-83147777-1314; Fax: +86-10-80705155; E-mail: xupingghy@gmail.com ? Zhi Xiong. Tel: +86-871-63825322; E-mail:zhix65.swfc@gmail.com