異種胰島移植的現(xiàn)狀

謝艷，王樹森，2，3，劉蕾，2（.天津市第一中心醫(yī)院器官移植中心，天津 30092；2.天津市器官移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 30092；3.衛(wèi)生部危重病急救醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 30000）

隨著2000年加拿大Edmonton方案的問世及推廣，胰島移植治療1型糖尿病取得了鼓舞人心的臨床效果。國際胰島細(xì)胞移植登記處（collaborative islet transplant registry，CITR）自 1999 年 以 來 的864例單獨(dú)胰島細(xì)胞移植或腎移植后胰島細(xì)胞移植患者胰島素撤離患者比例從1999-2002年的27%上升到2007-2010年的44%［1］。有研究報(bào)道顯示，胰島移植后5年達(dá)到胰島素撤離患者的比例為60%［2］。胰島移植臨床效果顯著，且創(chuàng)傷性小，并發(fā)癥發(fā)生率低，易被患者接受，但同種胰島移植面臨供體短缺的嚴(yán)重問題，這大大阻礙了臨床同種胰島移植的進(jìn)程。豬胰島細(xì)胞移植始于20世紀(jì)90年代，異種胰島移植有望克服困難走向臨床。本文就異種胰島移植的現(xiàn)狀進(jìn)行簡要綜述。

1 異種胰島移植的臨床進(jìn)展

1.1 第1例臨床異種胰島移植∶在大量動物實(shí)驗(yàn)的研究基礎(chǔ)上，瑞典Uppsala大學(xué)Groth等［3］在1994年首次較為系統(tǒng)地進(jìn)行了豬胰島細(xì)胞移植到人體的臨床試驗(yàn)。Groth等［3］將胎豬胰島樣細(xì)胞團(tuán)（islet-like cellclusters，ICCs）移植給10例胰島素依賴性糖尿病腎移植術(shù)后患者，其中8例患者ICCs植入門靜脈，2例患者植入腎包膜下。所有受者給予抗胸腺細(xì)胞球蛋白或15-DSG進(jìn)行免疫誘導(dǎo)和標(biāo)準(zhǔn)化維持治療。將ICCs植入門靜脈的4例患者尿液中檢測到豬源性C肽釋放且最長持續(xù)200～400天。對腎包膜下移植的1例患者進(jìn)行活檢，胰島素和胰高血糖素染色均呈陽性。盡管患者每日所需胰島素劑量并未減少，臨床療效也不明顯，但這項(xiàng)研究首次證實(shí)了豬胰島可以在人體內(nèi)長期存活。

1.2 微囊化新生豬胰島細(xì)胞移植∶Elliott等［4］通過腹腔鏡將海藻酸鈉微囊包裹新生豬胰島細(xì)胞移植給1例1型糖尿病患者?；颊吖步邮芰? 305 000 IEQ胰島細(xì)胞植入腹膜腔。移植術(shù)后12周，患者每日胰島素劑量減少近30%，但移植后49周時(shí)又增加到移植前劑量。移植后11個(gè)月，尿中可檢測到豬源性C肽。移植后14個(gè)月，糖化血紅蛋白從移植前9.3%降低至7.8%。移植術(shù)后9.5年取活檢，胰島素和胰高血糖素免疫組化染色仍然呈陽性。在此之后，Scharp等［5］給7例1型糖尿病患者進(jìn)行了1～3次海藻酸鈉微囊包裹新生豬胰島細(xì)胞移植，未見明顯不良反應(yīng)。其中5例患者的血糖水平有所改善，2例患者達(dá)到胰島素撤離并持續(xù)32周。

1.3 新生豬胰島細(xì)胞和豬Sertoli細(xì)胞聯(lián)合移植∶Valdes-Gonzalez等［6］報(bào)道了12例青春期1型糖尿病患者進(jìn)行新生豬胰島細(xì)胞和豬Sertoli細(xì)胞聯(lián)合移植的研究。先將2個(gè)內(nèi)含聚四氯乙烯（PTFE）內(nèi)芯的不銹鋼篩網(wǎng)柱置于腹部皮下，兩端封口，2個(gè)月后血管化的膠原纖維包繞該柱并沿篩孔長入。此時(shí)移去PTFE內(nèi)芯，留下空腔，然后在此空腔內(nèi)植入豬胰島和新生豬Sertoli細(xì)胞。術(shù)后未使用任何免疫抑制劑，11例患者6～9個(gè)月后接受了第2次移植，其中6例患者每日所需胰島素劑量減少。值得注意的是2例患者達(dá)到胰島素撤離，平均糖化血紅蛋白移植術(shù)前高于10%，移植術(shù)后低于10%，這表明新生豬睪丸Sertoli細(xì)胞對豬胰島細(xì)胞具有保護(hù)作用，抑制異種移植排斥反應(yīng)的發(fā)生。

盡管豬異種胰島移植可以緩解同種移植供體短缺的問題，但目前臨床異種移植效果仍不如同種異體移植，研究人員從豬胰島細(xì)胞的供體來源、異種移植排斥反應(yīng)的防治、移植部位的優(yōu)化等方面探索改善異種移植臨床效果的方法。

2 豬胰島細(xì)胞的供體來源

供體豬的年齡對胰島產(chǎn)量有很大影響。豬胰島細(xì)胞的供體來源按不同年齡分為胎豬、新生豬（1～5 天）、幼豬（7～22天）、幼豬/成年豬（12～15周）、成年豬（＞2年）［7-8］。

胎豬和新生豬的胰島結(jié)構(gòu)與成年豬相差較大。尤其胎豬和新生豬結(jié)締組織結(jié)構(gòu)還未充分分化，通過酶消化分離胰島細(xì)胞相對容易，分離出來的胰島組織稱為ICCs［9］。ICCs主要含內(nèi)分泌組織，體外培養(yǎng)時(shí)內(nèi)分泌組織可以存活而外分泌組織失去活性，因此，ICCs培養(yǎng)時(shí)便可純化。但每只胎豬胰島產(chǎn)量少于8 000 IEQ，新生豬胰島產(chǎn)量為25 000 ～50 000 IEQ［8］。從移植手術(shù)到胰島素分泌，ICCs需要?dú)v經(jīng)一段較長的成熟期。據(jù)報(bào)道，每只幼豬的胰島產(chǎn)量接近30 000 IEQ［8］，此外，胰島細(xì)胞在培養(yǎng)期間便可成熟，幼豬的胰島細(xì)胞移植后能立即分泌胰島素［7，10］。幼豬/成年豬和成年豬的胰島細(xì)胞容易破裂，很難分離出胰島細(xì)胞，但分離的胰島能立即分泌胰島素。每只幼豬/成年豬的胰島產(chǎn)量為80 000～150 000 IEQ，每只成年豬的胰島產(chǎn)量為200 000～500 000 IEQ［8］。另一方面，胰島細(xì)胞分離前維持供體豬在無指定病原體環(huán)境（designated pathogen free，DPF）中的費(fèi)用昂貴，減少胰島細(xì)胞分離前供體豬的培育時(shí)間能減少費(fèi)用。因此，臨床試驗(yàn)也多使用胎豬、新生豬或幼豬的胰腺［3，5-6，10］。

近幾年，供體豬基因修飾成為研究熱點(diǎn)，新出現(xiàn)的基因編輯技術(shù)使移植領(lǐng)域活躍起來。研究表明，成年豬Gal和hCD46敲除的基因修飾改善了移植物在STZ誘導(dǎo)的靈長類動物糖尿病模型中的存活情況［11］。近期誕生的新型基因工程豬，α1、3-Gal基因被敲除，使之表達(dá)人CD46（GTKO/CD46 pigs）、人組織因子途徑抑制物、人CD39或豬CTLA4-lg［12］，將此新型豬胰島細(xì)胞植入免疫抑制（STZ）誘導(dǎo)的5只糖尿病猴中，只有2只維持血糖水平正常超過5個(gè)月。也有研究顯示，新生豬Gal基因敲除而表達(dá)CD55和hCD59的基因修飾減輕了STZ誘導(dǎo)狒狒的立即經(jīng)血液介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)（Instant blood mediated inflammatory reaction，IBMIR）［13］。

3 異種移植排斥

除了免疫抑制劑，臨床已嘗試用免疫隔離的方法使受體免于異種排斥。盡管還未取得臨床突破性效果，但在靈長類動物糖尿病模型中已取得較大進(jìn)步。Sertoli細(xì)胞與胰島細(xì)胞聯(lián)合移植是抵抗異種排斥較為獨(dú)特的方法。

3.1 免疫抑制方法∶在靈長類動物糖尿病模型中，使用CD25和CD154特異性單克隆抗體、FTY720（或他克莫司）、依維莫司和來氟米特等免疫抑制劑可使成年豬胰島移植物存活超過100天［14］。免疫病理學(xué)分析提示，靈長類動物模型對豬異種胰島排斥是由細(xì)胞介導(dǎo)的。由于CD154特異性抗體在臨床前期試驗(yàn)中曾發(fā)生血栓事件，因此CD154特異性抗體已不再用于臨床試驗(yàn)。有研究致力于用CD40單克隆抗體替代CD154單克隆抗體，CD40特異性新型抗體共刺激可延長靈長類動物糖尿病模型中新生豬胰島移植物的存活時(shí)間［15］。將50 000 IEQ/kg新生豬胰島細(xì)胞通過門靜脈植入6只切除胰腺的糖尿病獼猴中，免疫誘導(dǎo)治療使用CD40特異性單克隆抗體和巴利昔單抗，用西羅莫司和貝拉西普維持治療，結(jié)果顯示，其中5只獼猴受體脫離胰島素治療，且未見血栓栓塞現(xiàn)象。進(jìn)一步了解異種移植物排斥反應(yīng)的獨(dú)特機(jī)制，聯(lián)合特異性的靶向治療對異種胰島移植排斥反應(yīng)的防治具有重要意義。

3.2 免疫隔離方法∶胰島免疫隔離方法是將胰島細(xì)胞置于帶有微孔的生物相容性半透膜制成的包囊內(nèi)，允許水、電解質(zhì)、糖類、胰島素等小分子物質(zhì)自由通過，阻止免疫活性細(xì)胞、免疫球蛋白、補(bǔ)體等大分子物質(zhì)通過，使胰島細(xì)胞與受體免疫系統(tǒng)隔離，從而避免移植排斥反應(yīng)。Soon-Shiong等［16］首次報(bào)道了將微囊化胰島移植用于1型糖尿病患者，按10 000 IEQ/kg的劑量移植到患者腹膜腔內(nèi)，6個(gè)月后又按5 000 IEQ/kg的劑量進(jìn)行第2次移植，患者達(dá)到胰島素撤離持續(xù)9個(gè)月且未見不良反應(yīng)。Tuch等［17］報(bào)道了4例1型糖尿病患者微囊化胰島移植后持續(xù)30個(gè)月可檢測到C肽，但在移植術(shù)后16個(gè)月時(shí)發(fā)現(xiàn)微囊周圍纖維組織增生且胰島壞死。盡管微囊化胰島移植理論上是理想的免疫隔離方法且取得了一定的臨床療效，但微囊纖維化是阻礙其發(fā)展的重要原因。

3.3 豬Sertoli細(xì)胞聯(lián)合移植∶自從墨西哥進(jìn)行的臨床試驗(yàn)顯示出較好的效果，豬胰島細(xì)胞和豬Sertoli細(xì)胞共同移植成為了研究熱點(diǎn)［6，18］。Dufour等［19］的研究結(jié)果顯示，新生豬Sertoli細(xì)胞可以在不使用免疫抑制劑的小鼠體內(nèi)存活，且胰島細(xì)胞和豬Sertoli細(xì)胞共同移植可以成功逆轉(zhuǎn)糖尿病小鼠的血糖水平［20］。Takemoto等［21］研究發(fā)現(xiàn)，在不使用免疫抑制劑的情況下，豬Sertoli細(xì)胞和胰島細(xì)胞共同移植可以逆轉(zhuǎn)糖尿病小鼠的高血糖狀態(tài)。盡管用豬胰島和豬Sertoli細(xì)胞共同移植治療糖尿病的研究取得了令人振奮的初步成果，但目前還沒有足夠的、可靠的靈長類動物糖尿病模型實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持臨床應(yīng)用。

4 移植部位

門靜脈是同種胰島細(xì)胞移植的標(biāo)準(zhǔn)部位。由于肝臟是調(diào)節(jié)胰島素水平的關(guān)鍵器官，部分肝病患者伴有糖尿?。?2］。因此，將胰島素直接分泌到肝臟是維持血糖水平較理想的方法［23］。與門靜脈移植相比，腹膜內(nèi)移植顯示胰島素分布延遲［24］。另外，通過門靜脈移植所需胰島細(xì)胞數(shù)量也比其他部位少。

但門靜脈仍不是胰島細(xì)胞移植最理想的部位，因?yàn)橐浦埠蠖虝r(shí)間內(nèi)植入的胰島細(xì)胞超過一半失去功能［25］，且門靜脈移植有出血、血栓形成、膽道穿孔、血清轉(zhuǎn)氨酶一過性升高及動靜脈瘺的風(fēng)險(xiǎn)。豬胰島細(xì)胞通過腹膜內(nèi)、皮下等部位移植均在靈長類動物糖尿病模型上進(jìn)行過試驗(yàn)［26］。胰島細(xì)胞純化程度是選擇移植部位的主要因素。純度高的胰島細(xì)胞主要通過門靜脈移植，純度低的胰島細(xì)胞主要植入腹膜內(nèi)，因?yàn)榧兌鹊偷囊葝u細(xì)胞體積較大，需植入較大空間的部位［27］。臨床同種胰島細(xì)胞移植顯示，腹膜內(nèi)純度低的胰島細(xì)胞移植療效比門靜脈純度高的胰島細(xì)胞移植療效差［17］。網(wǎng)膜囊內(nèi)移植可以克服腹膜內(nèi)移植的缺點(diǎn)。 網(wǎng)膜囊有豐富的血供，胰島素以更接近生理的方式輸入肝內(nèi)，葡萄糖刺激胰島素分泌反應(yīng)也可能比腹膜移植有所改善，但網(wǎng)膜囊包被胰島細(xì)胞需要特殊的外科技術(shù)［26］。皮下移植可以提供相對較大的空間，移植的胰島細(xì)胞可以取回，但皮下移植血供差，胰島素系統(tǒng)傳輸和外觀問題是皮下移植的缺點(diǎn)［26］。

5 異種胰島移植面臨的倫理問題

異種胰島移植將豬的胰島細(xì)胞或經(jīng)基因修飾的胰島細(xì)胞植入人體，盡管豬與人胰島素的氨基酸排列順序接近，但有人認(rèn)為，這將使人類與動物的生命體征之間的界限逐漸淡化，受者將面臨人的完整性問題。

此外，異種胰島移植存在跨物種感染風(fēng)險(xiǎn)。豬攜帶許多病原微生物，其中大多數(shù)在DPF培育下可以被清除［28］，但豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（porcine endogenous retrovirus，PERVs）存在于所有豬的基因組中，極難清除。Patience等［29］研究指出，豬細(xì)胞系PK-15與人細(xì)胞系HEK-293共同培養(yǎng)時(shí)，人細(xì)胞廣泛感染 PERVs。van der Laan等［30］實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，在培養(yǎng)液中豬胰島細(xì)胞釋放的PERVs可以感染人細(xì)胞。由于豬異種胰島移植患者免疫系統(tǒng)受抑制，PERVs感染風(fēng)險(xiǎn)大大增加。有臨床研究評估了來自160例接受多種活體豬組織或細(xì)胞移植的患者異種移植后PERVs的感染風(fēng)險(xiǎn)，包括體外灌注肝1例、體外灌注腎2例、生物人工肝28例、胰島細(xì)胞14例、皮膚15例、體外灌注脾100例、隨訪12年時(shí)結(jié)果顯示患者均未發(fā)生病毒血癥且未感染PERVs［31］。目前沒有發(fā)現(xiàn)人類感染PERVs的直接證據(jù)，但移植的安全性仍存在爭議。

6 異種胰島移植的展望

異種移植是解決器官移植供體短缺問題的主要途徑之一，十幾年前學(xué)者們就預(yù)言異種移植會首先在胰島等細(xì)胞治療上取得突破［30，32-33］。研究者通過選擇適當(dāng)豬齡的供體豬、尋找新的免疫抑制劑、改善免疫隔離的材料及尋找更好的移植部位等方法來提高豬胰島移植效果，使這個(gè)預(yù)言逐漸成為現(xiàn)實(shí)。另外，通過基因編輯技術(shù)減少免疫反應(yīng)及改善療效也已經(jīng)成為異種移植領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［34］。近期，國際異種移植協(xié)會更新了1型糖尿病患者進(jìn)行豬異種移植臨床試驗(yàn)安全規(guī)范共識［35-42］。通過異種移植解決供體短缺的問題，胰島細(xì)胞移植將有望成為糖尿病患者的標(biāo)準(zhǔn)療法。