小麥麩質蛋白中乳糜瀉關聯(lián)表位的檢測方法研究進展

李晶晶,袁娟麗,高金燕,舒　恒,李海飛,陳紅兵,*

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047;2.南昌大學中德聯(lián)合研究院,江西南昌 330047;3.南昌大學資源環(huán)境與化工學院,江西南昌 330047)

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小麥麩質蛋白中乳糜瀉關聯(lián)表位的檢測方法研究進展

李晶晶1,2,3,袁娟麗1,2,高金燕1,2,舒恒1,2,李海飛1,2,陳紅兵1,2,*

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047;2.南昌大學中德聯(lián)合研究院,江西南昌 330047;3.南昌大學資源環(huán)境與化工學院,江西南昌 330047)

乳糜瀉關聯(lián)表位的定量檢測可以評價小麥種質資源及加工食品的乳糜瀉致敏性,為患者安全消費提供技術保障。定量檢測小麥麩質蛋白中致乳糜瀉表位的方法包括免疫印跡法、高通量測序法和多反應檢測串聯(lián)質譜檢測(LC-MRM/MS),它們在麩質表位的檢測中各具特色。免疫印跡法檢測結果穩(wěn)定直觀,但定量精確度不高;高通量測序法準確度相對較高,但應用范圍窄,且數(shù)據(jù)處理困難;多反應檢測串聯(lián)質譜檢測靈敏度高、樣品用量少、分析速度快,但費用較高。

乳糜瀉,T細胞表位,麩質蛋白

乳糜瀉(celiac disease,CD)是一種自身免疫性疾病,患病率約為0.5%～2%。它是基因易感人群攝入來自小麥、大麥、黑麥及其衍生產品中的麩質蛋白而誘發(fā)的T細胞介導的慢性腸炎疾病[1]。小麥中的麩質蛋白的攝入,是引起乳糜瀉易感人群發(fā)病的誘導因素。目前治療乳糜瀉唯一有效的方法就是終身堅持無麩質飲食[2]。小麥中的麩質蛋白,包括聚合的麥谷蛋白(HMW-GS,LMW-GS)和單體的麥醇溶蛋白(α/β-,γ-,ω-)[3],是影響小麥粉面團粘彈性和烘焙品質的主要因素,同時也存在多種致乳糜瀉T細胞表位。含T細胞表位的肽段,至少有9個氨基酸序列,進入粘膜固有層后,在組織型轉谷氨酰胺酶(tTG)的作用下,脫去酰胺基,隨后被抗原遞呈細胞表面的HLA-DQ2和-DQ8分子識別而導致乳糜瀉[4-5]。目前,小麥麩質蛋白中,已鑒定出的致乳糜瀉核心表位可分為DQ2.5型、DQ2.2型、DQ8型及DQ8.5型四種類型[4]。

根據(jù)食品法典委員會規(guī)定,只有含量低于20 mg/kg麩質的食品才允許在其預包裝上標注“不含麩質”,而“含微量麩質”的標簽適用于已經進行特殊處理及去除大量麩質,但食品成分中仍存在低于100 mg/kg麩質的食品[6-8]。然而,乳糜瀉的誘因是麩質蛋白上的某些T細胞表位,部分麩質蛋白富含這類T細胞表位,特別是來自α-醇溶蛋白中的33肽,含6個T細胞表位[5,9-10]。而有些麩質蛋白缺失這些表位[11]。另外,核心表位中單個氨基酸或多個氨基酸的替換或缺失,會使其失去T細胞刺激能力,即喪失致敏性[12]。由此可見,用麩質含量的高低評估小麥品種及其制品的乳糜瀉致敏性不科學,準確定量小麥麩質蛋白中的T細胞表位凸顯重要。迄今為止,基于T細胞表位的定量檢測可以評價種質資源的乳糜瀉致敏性,直接獲得或選育獲得低致敏甚至是無致敏性的種質資源,有望從源頭上解決原料問題,從而為乳糜瀉患者提供安全可靠的低麩質食品;其次,可以科學評價加工食品中乳糜瀉致敏性,保障無麩質食品標簽的準確性。

1　致乳糜瀉表位檢測方法

目前能準確定量麩質蛋白中致乳糜瀉表位檢測方法主要包括免疫印跡法,高通量測序法以及多反應檢測串聯(lián)質譜檢測法。

1.1免疫印跡法

免疫印跡法是在SDS-PAGE凝膠電泳和固相免疫測定技術基礎上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術[13]?；谠撛?荷蘭學者Hetty[14]創(chuàng)建了定量檢測麩質蛋白中致乳糜瀉T細胞表位的方法。

該方法的主要操作程序如下。首先通過SDS-PAGE結合PageBlueTM染色鑒定提取出的麩質蛋白,然后,采用基于致乳糜瀉T細胞表位單克隆抗體Glia-α9和Glia-α20,進行蛋白質免疫印跡。最后,使用Quantity One軟件對印跡條帶強度進行灰度掃描,與參照的標準六倍體小麥對比分析來定量比較分析待測小麥種質中乳糜瀉T細胞表位含量。

在實際應用中,Hetty利用此方法,以致敏性較強的六倍體小麥Bovictus為對照品種,評價了103種四倍體小麥品種的乳糜瀉致敏性,確定了14個致敏性相對較低的品種。2013年,本實驗室率先引進該技術,并開展了相應的研究工作。如,朱曉燕[15]評價了80個中國六倍體小麥品種,發(fā)現(xiàn)浙江溫麥8號品種的乳糜瀉致敏性相對最低,為我國進一步選育低乳糜瀉致敏性的小麥品質提供了示范。免疫印跡法主要應用于篩查小麥種質的致乳糜瀉T細胞表位含量,但也可用于評價加工食品的乳糜瀉致敏性。如呂崇富[16]評價了擠壓加工對面粉麩質蛋白結構和致敏性的影響,于鳳蓮[17]評估了新疆小麥及主要面制品馕的乳糜瀉致敏性,這對乳糜瀉患者的健康飲食具有指導意義。

免疫印跡技術本身受到環(huán)境因素的影響比較多,在精確定量上存在不穩(wěn)定性。但免疫印跡法具有高分辨力和固相免疫測定的高特異性及敏感性等優(yōu)點,操作方便,成本低且適合大量樣品的篩選,而且是驗室常規(guī)方法。另外,采用免疫印跡法可以較直觀地觀察出不同品種麩質蛋白的種類與含量的差異,也可反映單克隆抗體的特異性免疫反映強弱程度。由此可見,基于免疫印跡定量檢測麩質蛋白中致乳糜瀉T細胞表位的方法易于推廣。

1.2高通量測序法

迄今為止,DNA的高通量測序主要有三大技術,包括Roche 454、Illumina Solexa及ABI SoLiD[18-20]。它能一次性對數(shù)百萬到十億條DNA分子進行并行測序,使其可以對一個物種的轉錄組和基因組進行深入細致的分析,所以又稱深度測序或下一代測序技術[21]。人們利用高通量測序法可以從基因水平定量小麥麩質蛋白中的致乳糜瀉表位。該方法的主要操作程序如下。首先,制備mRNA樣本,小麥抽穗后,采摘開花21 d后的小麥顆粒,提取和純化mRNA。其次,構建cDNA文庫,用于后續(xù)反應。然后,PCR擴增含待檢測表位的肽段,選擇合適的測序平臺,上機測序。最后,數(shù)據(jù)分析,利用高通量測序特有的定量功能,計算出各擴增肽段的豐度值,再根據(jù)致乳糜瀉表位在各擴增肽段中的分布情況,定量待檢測表位含量。

Elma[22]等利用DNA高通量測序原理,建立了一種基于454深度RNA擴增子測序法,對發(fā)育時期的77種小麥顆粒中含乳糜瀉表位片段進行表達譜分析,定量出各小麥種質α-gliadins片段中的三個主要表位(DQ2.5-Glia-α1、α2、α3)及變體含量。結果發(fā)現(xiàn),平均每個品種的α-gliadins轉錄本含1.81個DQ2.5型表位。其中,地方品種Dibillik Sinde轉錄本中所含表位豐度值最低。遺憾的是通過此方法并未找到不含T細胞表位的小麥品種,但此方法作為一種新的分析工具,通過檢測小麥胚乳中表位含量,可以篩選潛在低致敏的小麥品種。該方法有兩個突出創(chuàng)新點:一,選擇Roche 454測序平臺,Roche 454邊合成邊測序[23],無拼接過程,可確定各個表位在麩質肽段中的分布情況。因此,消除了小麥醇溶蛋白的高同源性對結果影響[24-25]。二,通過分析3,000多種已知α-gliadins片段核酸序列,設計一對簡并引物,擴增出小麥發(fā)育時期時,轉錄組中不同的α-gliadins片段,可避免小麥種質基因組中終止密碼子和假基因對結果的干擾[12]。Carmen[26]等則通過高通量測序對小麥屬和山羊草屬中的α麥醇溶蛋白基因組片段進行分析,確定了六種表位含量明顯不同的α麥醇溶蛋白片段,并建立了小麥中α-gliadins的進化模型,對低豐度表位的小麥育種具有重要的作用。

基于DNA高通量測序法是一種用非免疫學技術檢測麩質蛋白表位含量的方法,此方法突破了先前研究中T細胞克隆及單克隆抗體的局限性[27-28],首次將麩質蛋白中的表位做了精確定量分析。但是,高通量測序法也存在一些不足,此方法主要通過mRNA水平定量麩質蛋白中的致乳糜瀉表位,但mRNA水平與蛋白水平有一定的差異,且蛋白成分可能在小麥發(fā)育期發(fā)生改變[29-31],從而影響了實驗結果的準確性。此外,測序費用較高,后續(xù)海量測序數(shù)據(jù)的分析是一大難題[32],只適合對小麥種質資源進行分析,不適用于食品行業(yè)的現(xiàn)場快速檢測。

1.3多反應檢測串聯(lián)質譜檢測

多反應檢測串聯(lián)質譜(Liquid chromatography-multiple reaction monitoring mass spectrometry,LC-MRM/MS)是一種基于已知信息或假定信息有針對性地獲取數(shù)據(jù),進行質譜信號采集的技術[33-34]?；贚C-MRM/MS高通量檢測肽原理[35],可以同時定量檢測小麥麩質蛋白中的多個特異性致乳糜瀉表位,荷蘭學者Hetty[34]率先創(chuàng)建了該方法。

在早期研究中,根據(jù)質譜模式圖定量麩質蛋白,但檢測線性范圍窄,不適用于低麩質或無麩質蛋白食物樣本的檢測。Sealey[36]等則建立了液質連用(LC-MS)定量麩質蛋白的方法,檢測線性范圍相對提高。但由于小麥麩質蛋白同源性高,致敏肽段中氨基酸的替換會影響結果的準確性[12]。而LC-MRM/MS可同時檢測并定量多種致乳糜瀉肽段表位。首先,合成待檢測的肽段表位作為標準樣品,其次,確定麩質蛋白消化時釋放待檢測肽段的最優(yōu)條件,最后,通過質譜分析法檢測并定量乳糜瀉抗原表位。

Hetty[34]等采用LC-MRM/MS方法分析了四倍體小麥品種Dibillik Sinde、六倍體小麥老品種Minaret及新品種Toronto中以下9種含T細胞表位肽段含量:LQLQPFPQPQLPY、LQLQPFPQPQLPYPQPHLPY PQPQPF、LQLQPFPQPQLPYPQPQPF、LQLQPFPQPQ LPYP、QPQLPYPQPQPF、RPQQPYPQPQPQY、RPQQPY PQSQPQY、QQQLIPCRDVVL、QQILQQQLI PCRDVVL。結果發(fā)現(xiàn)相對于Minaret和Dibillik Sinde兩個品種,Toronto含乳糜瀉表位最多。該方法的精確度主要依賴于麩質蛋白最優(yōu)消化條件的確定[37]。其次,是檢測水平的提高,質譜高的靈敏性和特異性,可以識別出單個氨基酸替換,從而區(qū)別免疫原性肽和非免疫原性肽[34]。

LC-MRM/MS結合了液質連用與質譜多反應監(jiān)測的優(yōu)點,實現(xiàn)了一種靈敏度高、樣品用量少、分析速度快、重現(xiàn)性高的檢測方法。不僅可以分析低麩質中的致乳糜瀉表位含量,還可以檢測分析一些由于氨基酸替換,使得免疫活性下降甚至對于乳糜瀉患者來說是安全的肽段。由于該方法可以分析不同小麥品種中表位含量,對低致敏小麥品種的育種,食品中免疫顯性表位的檢測分析提供了廣闊的應用前景。但是,此方法依賴貴重設備,待檢測樣品需要前處理,存在費用較高、費時費力等缺點。

2　總結

與小麥麩質相關的過敏性疾病分為三大類,包括自身免疫型、過敏型以及非自身免疫非過敏型[38]。國外對與麩質相關的疾病系統(tǒng)地研究了多年,并取得了階段性的成果[39]。乳糜瀉是一種自身免疫型食物過敏疾病,其致病機理是所有與麩質相關疾病中研究最為透徹的[40-41]。因此,準確定量麩質蛋白中的致乳糜瀉T細胞表位,對低麩質和無麩質產品研發(fā)、標簽標示的制定至關重要。眾所周知,各種定量方法是保障食品安全的支撐技術。因此,本文介紹的方法不僅可以為乳糜瀉患者安全消費提供技術支撐,還可以為其它食物過敏原的檢測提供參考。另外,國內相關工作雖然剛剛起步,但是我國小麥種質資源豐富,通過現(xiàn)有的檢測方法,有望發(fā)現(xiàn)出低致敏甚至是無致敏的小麥品種,為乳糜瀉患者提供安全的食品原料。同時,我國無麩質食品研發(fā)尚在研發(fā)階段,這些檢測技術的應用將起到雪中送炭的作用。

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Progress in detection methods for epitopes related to celiac disease in wheat gluten

LI Jing-jing1,2,3,YUAN Juan-li1,2,Gao Jin-yan1,2,SHU Heng1,2,LI Hai-fei1,2,CHEN Hong-bing1,2,*

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China;2.Sino-German Joint Research Institute,Nanchang University,Nanchang 330047,China;3.School of Environmental and Chemical Engineering,Nanchang University,Nanchang 330047,China)

Detection of epitopes in gluten related to celiac disease can evaluate the sensitivity of wheat variety resources and the relevant food,and it is a strong technical support for the safety consumption for celiac disease patients.The main methods used in the detection of epitopes related to celiac disease in wheat gluten involve three approaches based on western blotting,next-generation sequencing,LC-MRM/MS,respectively.The advantages and disadvantages of these methods were introduced in detail.Among them,western blotting could present direct results,while the quantitative accuracy was not high.The accuracy of next-generation sequencing is relatively high,while the range of application is narrow with a complicated data processing.LC-MRM/MS has advantages on high sensitivity,low sample consumption and fast analysis speed with higher cost.

celiac disease;T cell epitope;gluten

2015-10-16

李晶晶(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：生物加工工程，E-mail：ljjncu@163.com。

陳紅兵(1967-)，男，博士，教授，研究方向：食品科學，E-mail：chenhongbing@ncu.edu.cn。

科技部國際科技合作專項(2013DFG31380)；江西省對外科技合作計劃(2012BDH80019)；江西省科技計劃項目(20132BBG70101)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)09-0380-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.067