金創(chuàng)抗菌膏對(duì)糖尿病難愈性皮膚潰瘍中Ⅰ、Ⅲ膠原及MMP-13表達(dá)的影響*

殷 菱，唐 莉，石鎂虹，劉珉甬，任曉軍，程基焱

（西南醫(yī)科大學(xué)：1醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究中心；2附屬醫(yī)院分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心；3護(hù)理器械研發(fā)實(shí)驗(yàn)室，四川瀘州 646000）

金創(chuàng)抗菌膏對(duì)糖尿病難愈性皮膚潰瘍中Ⅰ、Ⅲ膠原及MMP-13表達(dá)的影響*

殷 菱1，唐 莉2，石鎂虹2，劉珉甬3，任曉軍1，程基焱1

（西南醫(yī)科大學(xué)：1醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究中心；2附屬醫(yī)院分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心；3護(hù)理器械研發(fā)實(shí)驗(yàn)室，四川瀘州 646000）

目的：探討金創(chuàng)抗菌膏對(duì)治療糖尿病難愈性皮膚潰瘍Ⅰ、Ⅲ膠原及MMP-13表達(dá)的影響。方法：32只糖尿病大鼠模型造模成功的雄性SD大鼠隨機(jī)分為生理鹽水組和金創(chuàng)抗菌膏治療組（每組 16只），另外選擇 16只健康雄性SD大鼠作為對(duì)照組，三組大鼠同時(shí)制作創(chuàng)面模型。創(chuàng)面造模成功后，每天每組分別換藥，于第 7 d、14 d，每組處死8只大鼠。HE染色觀察壓瘡皮膚形態(tài)改變；免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶13（matrix metalloproteinase 13，MMP-13）的表達(dá)變化，RT-PCR技術(shù)檢測(cè)MMP-13 mRNA的表達(dá)；苦味酸-天狼星紅染色觀察Ⅰ、Ⅲ型膠原面積變化。結(jié)果：HE染色顯示金創(chuàng)膏組較生理鹽水組更早出現(xiàn)肉芽組織，且成纖維細(xì)胞排列規(guī)則呈“指紋狀”；對(duì)照組成纖維細(xì)胞極性消失及膠原纖維排列紊亂，肉芽組織出現(xiàn)較晚。免疫組化及RT-PCR顯示，金創(chuàng)抗菌膏治療組MMP-13表達(dá)比對(duì)照組和生理鹽水組均降低（P＜0.05）?？辔端?天狼星紅染色顯示與其它兩組比較，金創(chuàng)抗菌膏組Ⅲ膠原面積最大，Ⅰ型膠原面積最小。結(jié)論：金創(chuàng)抗菌膏可以促進(jìn)大鼠糖尿病皮膚潰瘍的愈合，可能與調(diào)控創(chuàng)面皮膚Ⅰ、Ⅲ膠原基因及MMP-13的表達(dá)相關(guān)。

金創(chuàng)抗菌膏；糖尿病潰瘍；Ⅰ、Ⅲ膠原；基質(zhì)金屬蛋白酶13

糖尿病 （diabetes mellitus，DM）患者并發(fā)潰瘍后，由于創(chuàng)面愈合紊亂，缺血病變、神經(jīng)病變、局部感染等多因素使細(xì)胞增殖分化能力減弱，創(chuàng)面愈合比非糖尿病患者更難。目前，中西醫(yī)治療均具有一定的局限，如何更有效的治療DM難愈性潰瘍對(duì)減輕患者痛苦、改善預(yù)后有極大的臨床意義。金創(chuàng)抗菌膏由多種中藥精制而成，具有清熱解毒消腫、活血化瘀止痛、去腐生肌斂瘡等作用特點(diǎn)，對(duì)一些皮膚難愈性潰瘍有良好的治療效果[1-2]，但其分子機(jī)制不明。為探討金創(chuàng)抗菌膏對(duì)DM難愈性皮膚潰瘍的療效及其對(duì)Ⅰ、Ⅲ膠原及基質(zhì)金屬蛋白酶13（matrix metallproteinase 13，MMP-13）表達(dá)的影響，特做如下研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SD雄性大鼠，二級(jí)、清潔，體重220~260 g（重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司提供）。

1.1.2 主要試劑

鏈脲佐菌素購(gòu)自上海信然生物科技有限公司；金創(chuàng)抗菌膏購(gòu)自瀘州天泰生物科技開(kāi)發(fā)有限公司提供；兔抗鼠MMP-13多克隆抗體、SABC免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。RNA抽提試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑、PCR試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 動(dòng)物模型的建立

1.2.1 糖尿病大鼠模型

方法[3]，結(jié)合實(shí)際，按如下步驟完成造模。造模大鼠在空腹3 h狀態(tài)下，稱(chēng)重。按 35 mg/kg尾靜脈注射 1% 鏈脲佐菌素 （STZ）溶液 （用 0.1 mmo1/L枸櫞酸鈉緩沖液配制）。 7 d后測(cè)血糖，隨機(jī)血糖超過(guò) 11.1 mmol/L的大鼠，繼續(xù)喂養(yǎng) 4月。4月后，造模大鼠隨機(jī)血糖大于 11.1 mmol/L者視為糖尿病大鼠模型成功。

選擇糖尿病模型造模成功的大鼠 32只，隨機(jī)分為金創(chuàng)抗菌膏組，生理鹽水組，每組16只。另取16只正常狀態(tài)大鼠作為對(duì)照組。

1.2.2 皮膚潰瘍模型

2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，8%硫化鈉脫毛。常規(guī)消毒，于大鼠背部脊柱附近腰背部?jī)蓚?cè)，標(biāo)記出直徑為2.0 cm的圓形圖案，用手術(shù)剪沿著標(biāo)記范圍剪去全層皮膚和皮下結(jié)締組織，深至筋膜，造成缺損創(chuàng)面，保證初始創(chuàng)面面積大小一致.。止血后以無(wú)菌紗布包扎固定。次日起，每日用50%冰醋酸涂抹創(chuàng)面一次，1周后形成皮膚潰瘍大鼠模型。潰瘍形成后，每天分組換藥，金創(chuàng)抗菌膏組用金創(chuàng)抗菌膏換藥，生理鹽水組用生理鹽水沖洗后包扎處理，對(duì)照組讓其自然愈合。在造模后第7 d、14 d各處死8只大鼠，取創(chuàng)面與正常皮膚交界處組織，進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1 形態(tài)學(xué)檢測(cè)

標(biāo)本以4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片。HE染色、免疫組化染色。具體步驟參考前期文獻(xiàn)[2]。采用日本OLYMPUS公司的BX-53顯微成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察分析及照相。每張切片自表皮向真皮深層隨機(jī)抽取8個(gè)視野照相。利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，測(cè)定平均光密度值 （average optical density，AOD）。

1.3.2 苦味酸-天狼星紅染色

將制作好的組織切片放入二甲苯 （10 min）→100%酒精（5 min）→100%酒精（5 min）→95%酒精（5 min）→90%酒精（5 min）→85%酒精（3 min）→75%酒精（3 min）→蒸餾水（2 min）→天青石藍(lán)液→蒸餾水洗3 min×3次→天狼星紅飽和苦味酸液 （30 min）→蒸餾水洗3 min×3→75%乙醇（30 s）→85%乙醇（30 s）→95%乙醇（5 min）→95%乙醇（5 min）→無(wú)水乙醇（10 min）→干燥后入二甲苯（5 min）→中性樹(shù)膠封片、偏振光顯微鏡下觀察，照相。

1.3.3 RT-PCR檢測(cè)MMP-13 mRNA水平

根據(jù)Tri Reagent說(shuō)明書(shū)提取各組組織總RNA，測(cè)A260/A280在1.8~2.0之間。2步法RT-PCR檢測(cè)mRNA，以GAPDH為內(nèi)參。具體序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件：94℃ 變性3 min，94℃ 30 s，58℃ 退火30 s，72℃30 s，72℃ 延伸5 min，共35個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后，采用凝膠成像分析系統(tǒng)照相并分析其吸光度值。以目的基因與內(nèi)參的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有計(jì)量資料以±s表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較單因素方差分析 （one-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD比較，兩個(gè)樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 大鼠皮膚潰瘍HE染色結(jié)果

7 d時(shí)，與對(duì)照組相比，真皮層底部成纖維細(xì)胞數(shù)量，生理鹽水組較少，而金創(chuàng)抗菌膏組較多；膠原纖維的排列上，生理鹽水組膠原粗大，排列紊亂，金創(chuàng)抗菌膏組膠原纖維較細(xì)且排列整齊；炎細(xì)胞聚集上，生理鹽水組真皮層有大量炎性細(xì)胞聚集，而金創(chuàng)抗菌膏組真皮層較少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。14 d時(shí)，與7 d時(shí)相比，生理鹽水組真皮層聚集成纖維細(xì)胞數(shù)量增加，形狀多不規(guī)則，細(xì)胞排列無(wú)極性，分泌膠原排列紊亂，團(tuán)塊狀，再生復(fù)層扁平上皮細(xì)胞不明顯，較多炎性細(xì)胞；金創(chuàng)抗菌膏組真皮層成纖維細(xì)胞減少，多為長(zhǎng)梭形，排列整齊，膠原排列整齊，再生的復(fù)層扁平上皮細(xì)胞排列整齊，炎細(xì)胞較少，見(jiàn)圖1。

圖1 HE染色顯示大鼠潰瘍組織7 d、14 d結(jié)構(gòu)（×400）

2.2 苦味酸-天狼星紅染色結(jié)果

在偏振光顯微鏡下，Ⅰ型膠原纖維具有強(qiáng)雙折光性，排列緊密，鏡下呈現(xiàn)紅色，Ⅲ型膠原纖維具有弱折光性，鏡下呈綠色。7 d時(shí)，生理鹽水組，鏡下可見(jiàn)Ⅰ型膠原纖維較其它兩組多，纖維粗，排列緊密紊亂，面積較Ⅲ型膠原纖維多。金創(chuàng)膏組，鏡下可見(jiàn)Ⅲ型膠原纖維較多，綠色纖維較細(xì)排列呈網(wǎng)狀，面積多于紅色Ⅰ膠原纖維。14 d時(shí)，生理鹽水組，鏡下可見(jiàn)，紅色Ⅰ型膠原纖維較1周前增多，纖維粗，排列緊密紊亂，面積較Ⅲ型膠原纖維多。金創(chuàng)膏組，鏡下Ⅲ型膠原纖維較一周前增多，纖維較細(xì)，排列呈疏松的網(wǎng)狀，排列整齊，面積明顯多于紅色Ⅰ型膠原纖維。對(duì)照組的表現(xiàn)介于金創(chuàng)抗菌膏組和生理鹽水組之間，見(jiàn)圖2。

2.3 MMP-13免疫組織化學(xué)染色結(jié)果潰瘍組織染色陽(yáng)性區(qū)域呈現(xiàn)棕黃色，切片觀察MMP-13陽(yáng)性表達(dá)接近潰瘍組織真皮乳頭層和表皮基底層時(shí)最強(qiáng)，真皮乳頭層向下逐漸減弱，成纖維細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中均有表達(dá)，正常組織幾乎不表達(dá)。7 d、14 d時(shí)，金創(chuàng)抗菌膏組MMP-13表達(dá)最弱（P＜0.05）。各組第14 d與第7 d時(shí)MMP-13平均光密度值比較，不同程度減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖3、表2。

2.4 MMP-13 mRNA結(jié)果

與對(duì)照組及生理鹽水組相比，金創(chuàng)抗菌膏能夠降低組織內(nèi)MMP-13 mRNA的表達(dá)；與生理鹽水組相比，對(duì)照組MMP-13 mRNA表達(dá)也降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但各組14 d與7 d相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖4，表3。

圖2 苦味酸-天狼星紅染色顯示大鼠潰瘍組織7 d、14 d時(shí)Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維表達(dá)（×400）

圖3 免疫組化染色顯示大鼠潰瘍組織7 d、14 d時(shí)MMP-13表達(dá)（×400）

表2 7 d、14 d時(shí)MMP-13的平均光密度值（±s，n=8）

表2 7 d、14 d時(shí)MMP-13的平均光密度值（±s，n=8）

注：a與對(duì)照組比，P＜0.05；b與生理鹽水組比，P＜0.05

0 . 3 1 2 5 ± 0 . 0 0 8 6 0 . 3 2 0 4 ± 0 . 0 1 0 6a0 . 2 9 4 8 0 . 0 1 2 7ab對(duì)照組生理鹽水組金創(chuàng)抗菌膏組0 . 3 2 8 2 ± 0 . 0 0 5 3 0 . 3 3 2 6 ± 0 . 0 1 0 4a0 . 3 1 3 3 ± 0 . 0 0 6 8ab

圖4 RT-PCR示大鼠潰瘍組織7 d、14 d時(shí)MMP-13 mRNA電泳圖

表3 大鼠潰瘍組織7d、14d時(shí)MMP-13mRNA表達(dá)（±s，n=3）

表3 大鼠潰瘍組織7d、14d時(shí)MMP-13mRNA表達(dá)（±s，n=3）

注：a與對(duì)照組比，P＜0.05；b與生理鹽水組比，P＜0.05;各組14 d與7 d比，P＞0.05

14 d 0.92±0.56 1.03±0.07a0.81±0.08ab組別對(duì)照組生理鹽水組金創(chuàng)抗菌膏組7 d 0.96±0.24 1.24±0.19a0.83±0.29ab

3 討論

糖尿病潰瘍是糖尿病患者常見(jiàn)并發(fā)癥，常因反復(fù)發(fā)作、遷延不愈而給患者帶來(lái)極大壓力和痛苦。因此，尋找一種有效的治療方法是臨床急需解決的重大問(wèn)題之一。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，中醫(yī)藥對(duì)糖尿病皮膚潰瘍具有顯著療效[4-6]。金創(chuàng)抗菌膏是根據(jù)中醫(yī)藥 “抗菌消炎、活血化瘀、祛腐生肌”的原理研發(fā)的純中藥制劑[2]，使用簡(jiǎn)便，臨床療效顯著，但其治療機(jī)制不明。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，金創(chuàng)抗菌膏治療糖尿病皮膚潰瘍時(shí)，創(chuàng)面炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)少；膠原排列整齊，且以Ⅲ型膠原為主；成纖維細(xì)胞在創(chuàng)面形成初期顯著增多，而后期數(shù)量減少；再生復(fù)層扁平上皮細(xì)胞整齊，上皮完整。

成纖維細(xì)胞是皮膚創(chuàng)傷愈合過(guò)程中重要的效應(yīng)細(xì)胞，機(jī)體在受到創(chuàng)傷刺激后，在生長(zhǎng)因子、炎性產(chǎn)物等誘導(dǎo)下，由纖維母細(xì)胞分化而來(lái)。成纖維細(xì)胞可分泌各型膠原纖維、蛋白聚糖、糖蛋白等大分子構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），其中Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維在ECM的重塑中具重要作用。正常皮膚組織中以Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維為主，創(chuàng)傷修復(fù)中肉芽組織的Ⅲ型膠原的含量明顯高于Ⅰ型膠原，在該過(guò)程中，伴隨著舊膠原的降解和新膠原的產(chǎn)生，重新排列沉積。另有研究表明，在胚胎皮膚成纖維細(xì)胞中，以Ⅲ型膠原為主，并與胚胎無(wú)瘢痕愈合的特征相關(guān)[7]，本次試驗(yàn)中，苦味酸-天狼星紅染色結(jié)果顯示，7 d和14 d時(shí)金創(chuàng)膏組的Ⅲ型膠原面積明顯大于Ⅰ型膠原面積，而其余兩組Ⅰ型膠原面積明顯大于Ⅲ型膠原面積，提示金創(chuàng)抗菌膏可促進(jìn)Ⅲ膠原的表達(dá)而減少瘢痕的形成，從而調(diào)節(jié)DM難愈性潰瘍的愈合。

MMP-13是Gross J和Lapiere CM首先發(fā)現(xiàn)的一種膠原水解酶[8]，在體內(nèi)以前體或酶原形式分泌，被激活后發(fā)揮降解細(xì)胞外基質(zhì)的作用，MMP-13的作用底物主要是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原纖維[9]，Ⅱ型膠原主要存在于軟骨組織中，因此推測(cè)在皮膚潰瘍愈合過(guò)程中，MMP-13對(duì)Ⅰ、Ⅲ型膠原的最終表達(dá)起到了關(guān)鍵性作用。有研究表明，早期潰瘍組織中MMP-13的活性增高，溶解壞死組織和細(xì)菌產(chǎn)物，達(dá)到清創(chuàng)的作用。在潰瘍創(chuàng)面肉芽組織生長(zhǎng)階段，創(chuàng)面MMP-13又降低到一個(gè)低水平，有利于創(chuàng)面新生Ⅰ、Ⅲ型膠原的生成、沉積和正常ECM的構(gòu)建。這可能是由于在創(chuàng)傷的初期，由于創(chuàng)傷刺激，MMP-13轉(zhuǎn)錄和無(wú)活性的前體酶被激活，MMP-13表達(dá)量增加[10]，晚期MMP-13的活性受到抑制，膠原降解減少，沉積增加，而促進(jìn)創(chuàng)面的瘢痕愈合。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著潰瘍愈合，MMP-13在每個(gè)組別中都不同程度降低，與前述文獻(xiàn)報(bào)道一致；而金創(chuàng)抗菌膏組表達(dá)最弱，說(shuō)明金創(chuàng)抗菌膏能夠部分抑制MMP-13的表達(dá)利于膠原沉積，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

創(chuàng)面愈合是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜過(guò)程，相關(guān)分子和細(xì)胞之間彼此影響、制約、協(xié)調(diào)。而糖尿病潰瘍的形成和發(fā)展不僅與免疫、代謝、神經(jīng)、血管等內(nèi)因相關(guān)，還與感染、壓力、護(hù)理等外因相關(guān)。臨床上單一的抗生素治療和單體中藥治療療效不太理想。金創(chuàng)抗菌膏是一種復(fù)方制劑，可從多方面調(diào)節(jié)糖尿病潰瘍的愈合，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)金創(chuàng)膏在治療糖尿病難愈性潰瘍時(shí)，可影響MMP-13的活化，調(diào)控Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維的表達(dá)及二者分布比例，而促進(jìn)潰瘍的愈合和創(chuàng)面的重建。

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（2016-02-20收稿）

Therapeutic effect of antiseptic ointment on the expression of Col-Ⅰ，Col-Ⅲand MMP-13 on diabetic ulcer in a rat model

Yin Ling1，Tang Li2，Shi Meihong2，Liu Minyong3，Ren Xiaojun1， Cheng Jiyan1

1Research Center for Preclinical Medicine；2Experimental Center of molecular medicine，the Affiliated Hospital；3Nursing instrument research and development laboratory of Southwest Medical University；Luzhou of Southwest Medical University，Sichuan Province 646000，China

Objective:To investigate the curative effects of antiseptic ointment in a rat model on diabetic ulcer and to explore its potential mechanism.Methods:32 rats，after establishing the model of diabetic ulcer，were divided into 2 groups randomly:physiological saline group and antiseptic ointment treatment group，and 16 healthy rats were used as a control group.The changes of the morphological structure was examined by HE staining;the expression of MMP-13 was determined by immunohistochemical staining;the mRNA expression of MMP-13 was assessed by RT-PCR;and the area of collagenⅠand collagenⅢ were measured by picric acid-Sirius red staining.Results:Compared with control group，mRNA and protein expression of MMP-13 were decreased remarkably in antiseptic ointment treatment group（P＜0.05），and the area of collagenⅢ was increased.Conclusion:The expression of typeⅠandⅢ collagens and matrix metalloproteinase 13 can be modulated by antiseptic ointment in a rat model of diabetic skin ulcer.

Antiseptic ointment;Diabetic ulcer;CollagenⅠ/Ⅲ;Matrix metalloproteinase 13

R242

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.03.012

*四川省衛(wèi)生廳科研項(xiàng)目（130267），瀘州市科技局科研項(xiàng)目（2012-177）

殷 菱（1979-），女，碩士，講師。

程基焱（1971-），男，碩士，教授。E-mail:49046804@qq.com