正交試驗優(yōu)化紫荊果總黃酮提取及其抗氧化性

陳　園鄭州大學(xué)信息工程學(xué)院，河南鄭州450001

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正交試驗優(yōu)化紫荊果總黃酮提取及其抗氧化性

陳園
鄭州大學(xué)信息工程學(xué)院，河南鄭州450001

摘要:為篩選紫荊果總黃酮的最佳提取工藝條件，研究紫荊果總黃酮提取液對羥自由基（·OH）清除活性，本文采用乙醇浸提法提取紫荊果中總黃酮，考察乙醇濃度、料液比、浸提溫度、浸提時間四個單因素對紫荊果總黃酮提取率的影響，設(shè)計L9（34）正交實驗確定最佳提取工藝條件。與二丁基羥基甲苯（BHT）對照，初步探究紫荊果總黃酮對羥自由基的清除活性。結(jié)果顯示，紫荊果總黃酮的提取率在料液比1.5:60 g/mL，浸提時間2.5 h，溫度80℃，乙醇濃度75%條件下為2.910%。對羥自由基清除活性高于同濃度的BHT，且隨濃度升高而增大。

關(guān)鍵詞:紫荊果；總黃酮；提取率；抗氧化性

黃酮類化合物是一類多酚類物質(zhì)，在自然界中廣泛分布，屬于植物次級代謝產(chǎn)物[1]。它是大多數(shù)自由基的清除劑[2]，有較強(qiáng)的抗氧化活性[3]，具有抗菌、消炎、清熱解毒、鎮(zhèn)靜、利尿等作用[4]。黃酮類化合物安全、無毒，在醫(yī)藥、食品加工等方面已被廣泛應(yīng)用[5]。

紫荊（Cercis chinensis Bunge），屬豆科植物，因“其木似黃荊而色紫，故名。又名，滿條紅、烏桑、籮筐樹、紫金盤、扁頭翁。根皮（紫荊根皮）、木部（紫荊木）、花（紫荊花）、果實（紫荊果）供藥用，其樹皮和木材可入藥，具有活血行氣、清熱解毒、消腫止痛等功效。紫荊花可用于治療風(fēng)濕骨痛、鼻中疳瘡。紫荊果可治療咳嗽[6]。研究發(fā)現(xiàn)，紫荊含有豐富的黃酮類化合物[7]。目前為止，已有從紫荊花和紫荊皮中提取總黃酮的研究，尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)紫荊果中總黃酮的研究報道，本研究對紫荊果中總黃酮的含量進(jìn)行了測定，并以總黃酮得率為考察指標(biāo)，優(yōu)化其醇沉提取工藝，并初步探究提取物的抗氧化性質(zhì)，即對羥自由基的清除活性，為紫荊在醫(yī)藥及食品等領(lǐng)域的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)參考。

1　材料與儀器

紫荊果，采集于鄭州人民公園，洗凈，烘干，粉碎（備用）。

無水乙醇、蘆丁、二丁基羥基甲苯、水楊酸、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、硫酸亞鐵、雙氧水、氯化鐵。均為市購，優(yōu)級純。

CP214C電子天平（德國賽多利斯）、722N可見分光光度計（上海光學(xué)儀器廠）、SHSG-3050型高速多功能粉碎機(jī)（上海碩光科技有限公司）、202-0A電熱恒溫干燥箱（北京金志業(yè)儀器設(shè)備有限責(zé)任公司）、HH.S11-Ni4電熱恒溫水浴鍋（北京三二八科學(xué)儀器有限公司）。

2　實驗方法

2.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確吸取0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.00 mL、2.50 mL、3.50 mL、4.50 mL、5.50 mL、6.50 mL分別置于50 mL容量瓶中，各加入5%亞硝酸鈉溶液0.40 mL，搖勻，靜置6 min；加10%硝酸鋁溶液0.40 mL，搖勻，靜置6 min；加4%氫氧化鈉溶液5.00 mL，用濃度為70%的乙醇溶液定容至50.00 mL，搖勻，靜置10 min。在510 nm波長處以試劑空白為參比測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得回歸方程，A＝-0.0053＋0.2458C，R2＝0.99904。

2.2紫荊果總黃酮的提取

將紫荊果洗凈，干燥至恒重，磨碎，過40目篩。準(zhǔn)確稱取2.0000 g的紫荊果粉末，用乙醇溶液做提取劑，水浴浸提，提取液過濾，用相同濃度的乙醇溶液洗滌并定容至50 mL容量瓶中，即得總黃酮提取液。

用分光光度法在510 nm波長處測紫荊果提取液的吸光度，按下式計算總黃酮提取率：

式中：V1為第二次定容后提取液的體積50 mL；V2從母液中量取的提取液體積0.50 mL；C為提取液中總黃酮濃度；M為樣品（紫荊果）質(zhì)量。

2.3紫荊果中總黃酮的提取單因素試驗

2.3.1乙醇濃度對總黃酮提取率的影響準(zhǔn)確稱取2.000 0 g的紫荊果粉末，固定料液比為2:60，改變提取劑乙醇濃度分別為55%、60%、65%、70%、75%、80%，在80℃恒溫水浴中浸提2 h，將提取液冷卻至室溫過濾、洗滌、合并提取液和洗滌液，并用與提取劑相同濃度的乙醇溶液在50 mL容量瓶中定容。在510 nm波長處測其吸光度，做3組平行試驗。將吸光度的平均值代入線性回歸方程，計算提取液中總黃酮濃度和紫荊果中總黃酮提取率，選擇較佳的提取劑濃度。

2.3.2料液比對總黃酮提取率的影響準(zhǔn)確稱取2.000 0 g的紫荊果粉末，固定提取劑乙醇的濃度為70%，提取溫度80℃，提取時間2 h，改變料液比分別為：1.0:60，1.5:60，2.0:60，2.5:60，3.0:60，以總黃酮提取率為指標(biāo)，考察料液比對紫荊果總黃酮提取率的影響。

2.3.3浸提溫度對總黃酮提取率的影響準(zhǔn)確稱取2.000 0 g的紫荊果粉末，固定提取劑乙醇濃度為70%，料液比為2.0:60，提取時間2 h，提取溫度分別為50℃、60℃、70℃、80℃、85℃、90℃，以總黃酮提取率為指標(biāo)，考察提取溫度對紫荊果總黃酮提取率的影響。

2.3.4浸提時間對總黃酮提取率的影響準(zhǔn)確稱取2.000 0 g的紫荊果粉末，固定提取劑乙醇的濃度為70%，料液比為2.0:60，提取80℃，浸提時間分別為1.5 h、2 h、2.5 h、3 h，以總黃酮提取率為指標(biāo)，考察提取時間對紫荊果總黃酮提取率的影響。

2.4紫荊果總黃酮最佳提取工藝優(yōu)化

在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，以黃酮提取率為綜合考察指標(biāo)，選定料液比、浸提時間、浸提溫度、乙醇濃度4因素3水平，設(shè)計L9（34）表進(jìn)行正交試驗，優(yōu)化紫荊果中總黃酮提取工藝條件。

2.5總黃酮對羥自由基的清除作用

參考Fenton反應(yīng)體系，加入不同體積的總黃酮提取液，在510 nm波長處測定吸光度[8]。扣除提取液的本底吸收。按下式計算提取液中總黃酮對羥自由基的清除率，并以BHT（二丁基羥基甲苯）為對照，比較兩種抗氧化劑對·OH的清除活性。

式中：A0為空白對照溶液吸光度；Ax為提取液吸光度；Ax0為不加H2O2提取液的本底吸光度。

3　結(jié)果與分析

3.1紫荊果中總黃酮提取單因素實驗及結(jié)果分析

3.1.1乙醇濃度對總黃酮提取率的影響乙醇濃度對總黃酮提取率影響見圖1。

由圖1可知，乙醇濃度在55%～70%之間，吸光度值逐漸增加，乙醇濃度在70%～80%之間，吸光度值逐漸降低。實驗結(jié)果表明，當(dāng)乙醇濃度為70%時，吸光度值達(dá)到最大，總黃酮提取率最高。即紫荊果中提取總黃酮，提取劑乙醇的最佳濃度為70%。

圖1　乙醇濃度對總黃酮提取率的影響Fig.1　Effect of ethanol concentrations on the extraction ratio of flavonoids

圖2　料液比對總黃酮提取率的影響Fig.2　Effect of solid-liquid ratio on the extraction ratio of total flavonoids

3.4.2料液比對總黃酮提取率的影響料液比對總黃酮提取率影響見圖2。由圖2可知，料液比為2.0:60 g/mL時，測定提取液的吸光度值最大，即總黃酮提取率最高。

3.4.3浸提溫度對總黃酮提取率的影響浸提溫度對總黃酮提取率影響見圖3。

由圖3可知，在50℃～80℃之間，總黃酮提取率隨溫度升高而增加，浸提溫度高于80℃，總黃酮提取率隨著溫度升高而降低，可能是由于提取物的熱不穩(wěn)定性，溫度升高引起提取物熱分解增加。

3.4.4浸提時間對總黃酮提取率的影響浸提時間對總黃酮提取率的影響見圖4。

圖3　浸提溫度對總黃酮提取率的影響Fig.3　Effect of temperatures on the extraction ratio of total flavonoids

圖4　提取時間對總黃酮提取率影響Fig.4　Effect of leaching times on the extraction ratio of total flavonoids

由圖4可知，總黃酮提取率開始隨著時間延長而增加，當(dāng)時間超過2.0 h后，總黃酮提取率不再增加，甚至隨著時間延長而降低。探究其原因可能是隨著時間延長提取劑乙醇的揮發(fā)損耗。實驗結(jié)果顯示紫荊果中總黃酮提取的較佳浸提時間為2.0 h。

3.5正交實驗及結(jié)果分析

因素水平見表1，正交實驗結(jié)果見表2。

表1　L9（34）正交實驗因素與水平設(shè)計Table 1 Factors and levels in the orthogonal test

表2　正交實驗結(jié)果Table 2 The result of the orthogonal test

從表2可以看出，本實驗中A、B、C、D四個單因素的主次關(guān)系是C＞B＞A＞D，即C（浸提溫度）為最重要的因素，其次是B（浸提時間），再次是A（料液比），D（乙醇濃度），影響最小。正交實驗結(jié)果顯示，以總黃酮提取率為考察指標(biāo)，最優(yōu)實驗條件組合是A1B3C2D3。即料液比為1.5:60 g/mL，浸提時間為2.5 h，浸提溫度為80℃，提取劑乙醇濃度為75%。

按照正交實驗所確定的最佳提取條件進(jìn)行驗證性實驗，做三次平行實驗，計算得到紫荊果中總黃酮提取率為2.910%。

3.6紫荊果中總黃酮對羥基自由基的清除作用

紫荊果中總黃酮對羥基自由基的清除實驗結(jié)果見圖5。

圖5　紫荊果總黃酮對羥基自由基的清除率Fig.5　The rate of hydroxyl radicals scavenged by flavonoids in Cercis chinensis Bunge fruit

由圖5可知：紫荊果中的總黃酮提取液對羥基自由基（·OH）有清除能力，隨著提取液濃度增加，清除率也逐漸增加。當(dāng)加入與提取液相同體積的同濃度BHT情況下，紫荊果中的總黃酮提取液對羥基自由基（·OH）的清除率要高于BHT（二丁基羥基甲苯）對羥自由基（·OH）的清除率。

4　討論

本論文利用乙醇單次浸提紫荊果中總黃酮，采用分光光度法測得總黃酮含量為2.910%。與文獻(xiàn)中報道的通過醇沉法提取純化紫荊花中黃酮類化合物，測得總黃酮回收率為7.32%[8]。提取液的抗氧化實驗結(jié)果顯示，紫荊果中總黃酮對羥自由基有較強(qiáng)的清除活性。紫荊果與花、皮一樣[9]，同樣具有較高的利用價值，有待開發(fā)。

5　結(jié)論

紫荊果總黃酮最佳提取條件為：料液比1.5:60 g/mL，浸提時間2.5 h，浸提溫度80℃，提取劑乙醇濃度75%。在此條件下總黃酮提取率可高達(dá)2.910%。

本文還對紫荊果總黃酮提取液抗氧化性質(zhì)做了初步探究，將紫荊果中的總黃酮提取液和BHT對羥自由基（·OH）清除活性作了比較。結(jié)果顯示，紫荊果提取液對羥基自由基（·OH）的清除能力略高于BHT（二丁基羥基甲苯）。

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Flavonoids Extracted from Cercis chinensis Bunge Fruit with an Orthogonal Test and Its Antioxidant

CHEN Yuan
School of Information Engineering/Zhengzhou University, Zhengzhou 450001，China

Abstract:To optimize the extraction of total flavonoids in Cercis chinensis Bunge and study on the scavenging effect on hydroxyl radicals，the preferred extraction conditions were determined by a single factor and orthogonal test. The results showed that the extraction ratio of flavonoids reached up to 2.910%at ethanol concentration of 75%，solid-liquid ratio of 1.5:60 mg/mL，temperature 85℃and extraction time 2.5 h. Antioxidant effect of flavonoids was higher than BHT and it was increasing with the concentration.

Keywords:Cercis chinensis Bunge fruit；flavonoids；extraction ratio；antioxidant

作者簡介：陳園（1964-），女，碩士，講師，研究方向:計算機(jī)應(yīng)用. E-mail:hbzyjsxy@163.com

收稿日期：2013-11-19修回日期：2014-01-13

中圖法分類號:S131；S132

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

文章編號:1000-2324（2016）01-0043-04