一種抗菌絲綢的制備及其抗菌作用分析*

杜 泰 陳學(xué)情 杜華茂

(1. 西南大學(xué)附屬中學(xué)， 重慶 400714； 2. 西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院， 重慶 400716)

一種抗菌絲綢的制備及其抗菌作用分析*

杜 泰1陳學(xué)情2杜華茂2

(1. 西南大學(xué)附屬中學(xué)， 重慶 400714； 2. 西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院， 重慶 400716)

桑蠶絲是一種與人體組織相容性極好的天然蛋白纖維，抗菌蠶絲在醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。本文探索了直接在絲綢上嫁接納米銀的方法。用紅外光譜儀分析自制的納米銀樣品，發(fā)現(xiàn)在1 651cm-1，1 584cm-1，1 379cm-1， 1 033cm-1有特征峰，表明納米銀結(jié)合蛋白質(zhì)。用戊二醛處理絲綢后加入納米銀膠體溶液，室溫下處理10h, 在掃描電子顯微鏡下觀(guān)察絲綢上納米銀的結(jié)合狀態(tài)，并按《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》測(cè)定處理后絲綢的對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及白色念珠菌的抗菌性能。結(jié)果顯示絲綢上的納米銀以分散狀、成簇存在；在20min內(nèi)，2cm ×3cm大小絲綢對(duì)104CFU/ml細(xì)菌的殺菌率達(dá)到90%。研究表明，用戊二醛將結(jié)合了蛋白質(zhì)分子的納米銀嫁接到蠶絲蛋白上可制備抗菌絲綢。

絲綢；納米銀；抗菌

蠶絲纖維是一種蛋白質(zhì)纖維，是由18種天然氨基酸組成的天然高分子材料[1]。由蠶絲紡織而成的絲綢質(zhì)地柔軟纖細(xì)光滑，手感細(xì)膩，與人體體表有良好的適應(yīng)性。近年發(fā)現(xiàn)蠶絲纖維在體內(nèi)穩(wěn)定性較好，也可緩慢降解，表現(xiàn)出良好的組織相容性，已用于制備外科合線(xiàn)和再造血管等[2-3]。具有抗菌作用的蠶絲在醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域?qū)⒂懈鼜V泛的應(yīng)用。目前有大量抗菌蠶絲的研究報(bào)道，主要是對(duì)絲膠或絲束進(jìn)行抗菌物質(zhì)的嫁接[4-5]，特別是嫁接納米銀的蠶絲抗菌作用強(qiáng)，抗菌譜廣[4，6]。對(duì)于需要加工成織物才能進(jìn)行抗菌性應(yīng)用的蠶絲，后期加工過(guò)程對(duì)蠶絲結(jié)合的納米銀將有不同程度的影響，或者說(shuō)為保持其抗菌作用，在后期加工工藝上會(huì)做出某些犧牲。本研究報(bào)道一種在絲綢上直接嫁接納米銀的方法并分析其抗菌效果。

1 材料與方法

1.1 主要材料

納米銀由本實(shí)驗(yàn)室自制，按專(zhuān)利ZL 2012 1 0579134.4制備[7-8]。絲綢購(gòu)于四川省南充市愛(ài)膚爾絲綢有限公司。戊二醛(分析純，25%)。LB 培養(yǎng)基為上海生物工程公司產(chǎn)品。大腸桿菌CVCC2081，金黃色葡萄球菌CVCC1882，白色念珠菌CMCC(F)98001由黃偉博士惠贈(zèng)。

1.2 紅外光譜分析

取100mL納米銀膠體溶液經(jīng)12 000r/min離心濃縮后再冷凍干燥。取1mg納米銀粉與120mg溴化鉀充分研磨混合后壓片，用傅立葉紅外光譜儀(IR-6700，美國(guó)尼高立)作4 000cm-1-400cm-1波數(shù)掃描，采集紅外光譜圖并進(jìn)行官能團(tuán)分析。

1.3 納米銀的嫁接

剪取1M2絲綢，放入4%戊二醛PBS溶液中，在室溫浸泡12h后用去離子水洗滌3次，以去除殘留的戊二醛分子。將絲綢轉(zhuǎn)入10 ppm的溶液中浸泡12h，用去離子水洗滌3次去除未結(jié)合的納米銀。至此，納米銀已嫁接到絲綢上，閉光保存。

1.4 掃描電鏡分析

將處理的絲綢自然干燥后送北京中科百測(cè)分析測(cè)試中心進(jìn)行掃描電鏡分析，觀(guān)察絲綢表面納米銀的形態(tài)。

1.5 絲綢的抗菌性能分析

按《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB15979-2002)附錄三進(jìn)行抗菌性檢測(cè)。主要步驟如下，將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌接種于LB培養(yǎng)基，白色念珠菌接種于土豆培養(yǎng)基，過(guò)夜培養(yǎng)后離心收集菌體，用PBS將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌濃度調(diào)至2×105CFU/mL，將白色念珠菌調(diào)為2×104CFU/mL。

將絲綢剪為2cm × 3cm大小，放入5mL滅菌的試管中。每張絲綢片上加菌液100μL。每種菌作6張絲綢小片。室溫放置10min、20min后分別取出3片絲綢，每片加5mL 終止液。對(duì)照組的絲綢用75%乙醇浸泡30min后用滅菌水洗滌。取100μL涂瓊脂平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，每個(gè)處理樣品取三份計(jì)數(shù)。試驗(yàn)重復(fù)三次，計(jì)算平均殺菌率，并進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 納米銀的紅外光譜特征

本研究所用的納米銀是由赤霉菌的菌絲裂解物在室溫下所合成,所制備出的納米銀膠體溶液Zeta電位為-33 eV，表現(xiàn)為自穩(wěn)定的特性[8]。將該納米銀用去離子水充分洗滌后進(jìn)行紅外光譜分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在1 651cm-1、1 584cm-1有特征峰，分別代表伯胺與仲胺基團(tuán)的振動(dòng)，在1 379cm-1、 1 033cm-1有特征峰，代表芳香族氨基和脂肪族氨基的C-N基團(tuán)的振動(dòng)(見(jiàn)圖1)，表明該納米銀結(jié)合有蛋白質(zhì)。

2.2 絲綢表面的納米銀

因紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)赤霉菌菌絲裂解物合成的納米銀結(jié)合有氨基，所以可用戊二醛將其與蠶絲蛋白的α氨基進(jìn)行偶聯(lián)，達(dá)到將納米銀嫁接到蠶絲纖維上的目的。嫁接過(guò)程在室溫下由兩步反應(yīng)完成，先將戊二醛與蠶絲蛋白結(jié)合，再與納米銀結(jié)合的蛋白質(zhì)結(jié)合。在掃描電鏡下清晰可見(jiàn)蠶絲纖維編織的規(guī)律紋理(圖2A),在500倍下可見(jiàn)蠶絲纖維表面附著有顆粒物，這些顆粒物分散存在，大小不一(圖2B)。一根絲束表面局部的附著物呈堆出現(xiàn)(1萬(wàn)倍)，在2.5萬(wàn)倍下可見(jiàn)球狀的納米銀(圖2 C，D)。

圖1 赤霉菌合成納米銀的紅外光譜圖

圖2 處理后絲綢織物的超微結(jié)構(gòu)

圖3 處理后絲綢的抗菌作用

2.3 處理后絲綢織物的抗菌作用

按《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB15979-2002) 附C3介紹的方法測(cè)定嫁接納米銀的絲綢織物對(duì)大腸桿菌CVCC2081、金黃色葡萄球菌CVCC1882及白色念珠菌CMCC(F)98001的殺菌率。菌液在絲綢織物上保留10min、20min后測(cè)定的殺菌率如圖3所示，由圖可知處理10min對(duì)三類(lèi)微生物的殺菌率在50%左右，對(duì)金黃色葡萄球菌的殺菌率略低；處理20min均超過(guò)90%。

3 小結(jié)與討論

蠶絲從中國(guó)走向世界，為人類(lèi)服務(wù)了數(shù)千年，贏(yíng)得了“纖維皇后”之美稱(chēng)，蠶絲織物也享有“人體第二皮膚”的高度評(píng)價(jià)?，F(xiàn)代生物學(xué)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)正試圖證明蠶絲在人類(lèi)健康相關(guān)的諸多領(lǐng)域有更重要的應(yīng)用價(jià)值[1-2]。抗菌蠶絲及抗菌蠶絲織物是其中一個(gè)研究方向，可以用于多種感染性疾病的治療，比如燒傷和糖尿病足的治療。

納米銀是目前最有效的抗菌材料之一，利用活性氧對(duì)蛋白質(zhì)、脂類(lèi)和核酸的廣泛破壞作用發(fā)揮其殺滅細(xì)菌、真菌和病毒的功能?；钚匝醯漠a(chǎn)生有兩種途徑，一方面是納米銀不斷釋放的銀離子，另一方面納米銀本身。因此，從理論上講，只要使蠶絲結(jié)合上納米銀，就負(fù)于其抗菌性能。人們探索了多種方法將納米銀修飾到蠶絲或嫁接到蠶絲織物表面[4-5]。本文報(bào)道了一種相對(duì)簡(jiǎn)單的方法，利用戊二醛對(duì)蛋白質(zhì)的偶聯(lián)作用將納米銀結(jié)合到蠶絲織物表面，處理后的絲綢的殺菌率達(dá)到了90%。這一方法的可行性主要得益于近年來(lái)興起的生物法合成納米銀技術(shù)，即利用細(xì)菌或真菌還原硝酸銀，生成的納米銀可與反應(yīng)體系中蛋白質(zhì)的氨基、巰基結(jié)合，以形成穩(wěn)定的納米銀膠體。本研究用紅外光譜儀檢測(cè)赤霉菌合成納米銀樣品中有伯氨、仲氨及芳香族氨基酸的C-N等基團(tuán)的特異性振動(dòng)峰，這與先前的報(bào)道相一致[10]。

抗菌蠶絲在臨床上的應(yīng)用尚需大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的支撐，除生物學(xué)角度的研究外，還需要醫(yī)學(xué)相關(guān)人員的加入，以評(píng)價(jià)其作為外科敷料或填料在組織學(xué)上的可行性。

致謝：感謝劉英帥博士在紅外光譜分析中的技術(shù)支持。

[1] 向仲懷. 蠶絲生物學(xué)[M]. 北京：中國(guó)林業(yè)出版社，2005：288-374.

[2] BANANI K., NICHOLAS K., SUBIA B., et al. Silk proteins for biomedical applications: Bioengineering perspectives [J]. Progress in Polymers Science. 2013,39(2)：251-267.

[3] 汪斯衡, 蔣佳, 陳世益. 蠶絲及其衍生材料在運(yùn)動(dòng)損傷修復(fù)中的應(yīng)用 [J]. 中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志, 2016, 35(7)：682-686.

[4] 魯志松，孟梅，李長(zhǎng)明，等. 納米銀修飾蠶絲的制備方法及其產(chǎn)品和應(yīng)用：中國(guó)，201410145408.8 [P].2015-04-22.

[5] 魏麗喬，郭華，陳小麗，等. 一種天然蠶絲織物表面的抗菌處理方法：中國(guó)，201310278794.3 [P].2015-04-22.

[6] 周亮，湯京龍，陳艷梅 等.納米銀的抗菌特性及其在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 [J]. 北京生物醫(yī)學(xué)工程，2011，30(2)：205-209.

[7] 杜華茂，鄧亞平，秦小璇，等. 一株赤霉菌：中國(guó)，201210579134.4 [P].2015-02-18.

[8] QIN G, XIONG Y, TANG S, et al.Impact of predator cues on the response of Daphnia carinata to low-concentration silver nanoparticles[J].Arch Environ Contam Toxicol. 2015, 69: 494-505.

[9] 馬艷，李智，代方銀，等. 蠶絲與蠶絲織物的改性研究綜述 [J]. 蠶業(yè)科學(xué)，2016，42(6)：1106-1112.

[10]VIGNESHWARAN N, ASHTAPUTRE NM, VARADARAJAN PV, et al. Biological synthesis of silver nanoparticles using the fungus Aspergillus flavus [J]. Materials Letters，2007，61：1413-1418.

*資助項(xiàng)目：中央高校基本業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)基金(XDJK2016E105)。

杜華茂，博士，副教授。Email: duhmao@swu.edu.cn