同/異質(zhì)型乳酸菌添加對蘇丹草青貯酵母菌群落結(jié)構(gòu)及發(fā)酵品質(zhì)的影響

萬江春，謝開云，王玉祥，趙 云，劉 莉，玉 柱

（1. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，新疆草地資源與生態(tài)重點(diǎn)實驗室，新疆 烏魯木齊 830052；2. 中國牧工商集團(tuán)有限公司，北京 100070；3. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，北京 100093）

蘇丹草(Sorghum sudanense)原產(chǎn)于非洲，是禾本科高粱屬一年生優(yōu)良牧草。蘇丹草性喜溫，耐貧瘠，抗旱，營養(yǎng)價值高，再生力強(qiáng)，可多次刈割[1-3]，目前已在新疆地區(qū)廣泛種植。新疆地域廣闊，在雨熱同期地區(qū)，青貯是重要的飼草加工方式。青貯主要是利用乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生乳酸來降低青貯飼料的pH，進(jìn)而抑制其他有害微生物的生長和繁殖，從而達(dá)到長期保存的目的[4]。乳酸菌可分為兩類，一類為同質(zhì)型乳酸菌，另一類為異質(zhì)型乳酸菌。同質(zhì)型乳酸菌主要包括干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、植物乳桿菌(L. plantarum)、乳酸片球菌(Pedicoccus acidilactici)、戊糖片球菌(P. pentosaceus)、糞鏈球菌(Streptococcus faecalis)和屎鏈球菌(S. faceium)等，這類乳酸菌的共同特點(diǎn)是同型發(fā)酵，他們可有效利用植株中的可溶性碳水化合物，增加乳酸產(chǎn)量并迅速降低pH。布氏乳桿菌(L. buchneri)是常見的異質(zhì)型乳酸菌[5-6]，特點(diǎn)是在青貯發(fā)酵過程中除產(chǎn)生乳酸外，還產(chǎn)生乙酸，但他將水溶性碳水化合物轉(zhuǎn)化為乳酸的效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于同質(zhì)型乳酸菌。布氏乳桿菌發(fā)酵終產(chǎn)物中所產(chǎn)乳酸含量與同質(zhì)型乳酸菌發(fā)酵終產(chǎn)物中所產(chǎn)乳酸含量相比，僅有其17%～50%。過去認(rèn)為酵母菌在青貯飼料中的數(shù)量很少，但近年來的許多研究表明酵母菌在青貯飼料中的數(shù)量并不少[7-9]。多數(shù)研究認(rèn)為，青貯飼料中酵母菌的活動不利于青貯飼料的發(fā)酵及有氧穩(wěn)定，這主要是因為酵母菌會與乳酸菌爭奪糖分并發(fā)酵，除產(chǎn)生乙醇外，酵母菌還會進(jìn)一步發(fā)酵醇類物質(zhì)，進(jìn)而產(chǎn)生正丙醇、異戊醇、異丁酸以及少量的乳酸等[10-11]，這些物質(zhì)并不能提高青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性。酵母菌在青貯過程中是不可避免的存在，而且數(shù)量也不少，但是目前缺乏同/異質(zhì)型乳酸菌添加劑對酵母菌在青貯過程中的酵母菌種群動態(tài)變化關(guān)系方面的研究。

蘇丹草作為一種優(yōu)質(zhì)牧草，目前新疆已開始大面積種植，但如何提高青貯后的飼料品質(zhì)卻成了亟待解決的問題。本研究以植物乳桿菌作為同質(zhì)型乳酸菌添加劑，以布氏乳桿菌作為異質(zhì)型乳酸菌添加劑，探討其作為添加劑對蘇丹草青貯飼料發(fā)酵過程中酵母菌群落及發(fā)酵品質(zhì)的影響，以期提高蘇丹草青貯飼料的品質(zhì)，為開發(fā)乳酸菌與酵母菌共生性產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

蘇丹草種植于新疆烏魯木齊市三坪農(nóng)場新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)實習(xí)基地 (43°54′ N，87°19′ E)。該區(qū)域?qū)儆诘湫偷闹袦貛Т箨懶园敫珊禋夂颍?月平均氣溫 24.5 ℃，年降水量 180 mm，年均蒸發(fā)量1 780 mm，＞10 ℃ 年積溫 3 500 ℃·d，光照時間長，年均日照時數(shù) 2 900 h，無霜期 170～180 d。

1.2 原料與加工調(diào)制

蘇丹草原料：以新蘇3號蘇丹草(新疆草地資源與生態(tài)重點(diǎn)實驗室提供)為種植品種；蘇丹草種植小區(qū)面積為 100 m2(10 m × 10 m)，重復(fù) 3 次；小區(qū)內(nèi)播種行距 15 cm，播種量為 105 kg·hm-2。2017 年4月28-30日進(jìn)行苗床的準(zhǔn)備，包括犁地、耙地和施基肥 (磷酸一銨，90 kg·hm-2)；5 月 2 日完成小區(qū)播種；抽穗期進(jìn)行刈割(2017年7月20日)；將原料凋萎12 h后切短至1～2 cm待貯。

原料青貯特性：凋萎12 h后的蘇丹草，其干物質(zhì)含量為284 g·kg-1，附著的乳酸菌數(shù)量為3.51 lg cfu·g-1?；诟晌镔|(zhì)測定的粗蛋白含量為98.6 g·kg-1，可溶性碳水化合物含量為52.4 g·kg-1，酸性洗滌纖維含量為 613 g·kg-1，中性洗滌纖維含量為 324 g·kg-1，粗脂肪含量為 26.3 g·kg-1，粗灰分含量為 81.4 g·kg-1，緩沖能值為 169 mEq·kg-1，pH 為 4.85。

添加劑：植物乳桿菌 CGMCC 10474 (LP)和布氏乳桿菌 CGMCC 14268 (L. buchneri，LB)均由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)草地研究所提供。

1.3 青貯試驗方法

以收獲凋萎12 h后的蘇丹草為原料，利用真空包裝袋為青貯容器制作青貯。乳酸菌處理為3種：同質(zhì)型乳酸菌處理(LP)-植物乳桿菌，添加量為1 × 105cfu·g-1；異質(zhì)型乳酸菌處理 (LB)-布氏乳桿菌，添加量為 4 × 105cfu·g-1；同質(zhì)型+異質(zhì)型乳酸菌處理 (LP + LB)，添加量為植物乳桿菌 1 × 105cfu·g-1+布氏乳桿菌 4 × 105cfu·g-1；以不添加任何菌劑的空白為對照處理(CK)。各處理均將提前按比例配置好的菌液用噴壺均勻噴灑至樣品表面，CK處理噴灑等量的蒸餾水。青貯調(diào)制48袋，每個處理12袋，每袋 1.0 kg，室溫環(huán)境 (23～36 ℃)下發(fā)酵 60 d。在發(fā)酵1、7、15和60 d時分別取各處理樣品(每個處理取3個重復(fù))進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測定。

1.4 各指標(biāo)測定方法

原料的分析樣品在65 ℃下干燥48 h，粉碎，過0.425 mm篩孔制成[12]。取原料風(fēng)干樣參考Zhang等[13]的方法測定以下指標(biāo)：干物質(zhì)含量(dry matter, DM)采用烘干法，粗蛋白質(zhì)(crude protein, CP)采用凱氏定氮法，中性洗滌纖維 (neutral detergent fiber, NDF)和酸性洗滌纖維 (acid detergent fiber, ADF)采用 Van Soest洗滌纖維素分析法，粗脂肪 (ether extract, EE)采用索氏抽提法，粗灰分采用灰化法，可溶性碳水化合物 (water soluble carbohydrate, WSC)采用分光光度法，緩沖能值 (buffer energy, BC)采用滴定法。

參考王慧麗[11]的方法進(jìn)行酵母菌的分離、純化及保存等，參考Zhang等[14]的方法進(jìn)行乳酸菌及酵母菌數(shù)量的測定。發(fā)酵品質(zhì)的測定指標(biāo)主要包括pH(雷磁酸度計，PHS-25)、乳酸(Lactic acid，LA)、乙酸 (Acetic acid，AA)、丙酸 (propionic acid，PA)和丁酸 (butyric acids，BA)(高效液相色譜法)[11]；氨態(tài)氮(NH3-N)采用苯酚-次氯酸比色法測定[15]。

V-score評分方法參考日本粗飼料評定手冊(2001)[16]，該方法是以NH3-N和AA、PA、BA等揮發(fā)性脂肪酸為評定指標(biāo)進(jìn)行青貯品質(zhì)評價的方法。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用MEGA 7.0進(jìn)行酵母菌種群系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，利用SigmaPlot 14.0進(jìn)行相關(guān)圖表的繪制，利用SPSS 21.0軟件進(jìn)行方差分析，用Duncan法對測定數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘇丹草原料及青貯發(fā)酵過程中分離的酵母菌

從蘇丹草原料及整個發(fā)酵過程青貯飼料中共分離得到132株酵母菌。分離和純化酵母菌，使用單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析對其進(jìn)行初步篩選，之后進(jìn)行26S rDNA的D1/D2區(qū)序列測定，通過BLAST在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列及相關(guān)信息檢索，將酵母菌鑒定到種水平，通過Mega 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1、表1)。

從蘇丹草原料及青貯蘇丹草中共檢出9種酵母菌(表1)，除了Y7與Kluyveromyces marxianus模式菌株相似度為98.7%之外，其余菌株與模式菌株的相似度均在99.0%以上。所有分離得到的酵母菌菌株與GenBank上檢索得到的模式菌株均處于同一分支且重復(fù)抽樣分析值都在98%以上 (圖1)，因此分離得到9種酵母菌與對應(yīng)的模式菌株均屬于同一種。

2.2 蘇丹草青貯發(fā)酵過程中檢出的酵母菌種類

青貯前及青貯發(fā)酵的1、7、15和60 d，對蘇丹草青貯飼料中的酵母菌種類和比例進(jìn)行鑒定(圖2)。結(jié)果顯示，青貯發(fā)酵前，從4種處理中共檢測出9種酵母菌，只有Z. bailii是在每個處理中均檢出的酵母菌品種，且檢出比例較高，超過了40%；隨著青貯發(fā)酵時間的延長，酵母菌種類不斷減少，至發(fā)酵 60 d 時，LB 和 LP + LB 處理中酵母菌含量已在檢出限以下 (＜ 2.4 lg cfu·g-1)；與 0 d 時相比，CK和LP處理各減少了兩種酵母菌，分別是C.glabrata、C. quercitrusa 和C. glabrata、P. kudriavzevii；Z. bailii在4個處理中的檢出比例均出現(xiàn)一定程度下降，尤以LB和LP + LB處理明顯，至青貯60 d時，LB和LP + LB處理中已檢測不到Z. bailii。

2.3 同/異質(zhì)型乳酸菌對蘇丹草青貯飼料發(fā)酵過程中酵母菌群落的影響

隨著青貯發(fā)酵的進(jìn)行，各處理青貯飼料的pH均逐漸降低。CK和LP處理均未能有效抑制酵母菌數(shù)量，與0 d相比，發(fā)酵1 d后，酵母菌數(shù)量開始增加；LB處理發(fā)酵1 d后，酵母菌數(shù)量和pH同步下降；LP + LB 處理從 0 至 60 d，酵母菌數(shù)量隨著pH的下降而下降；隨著發(fā)酵時間延長，各處理酵母菌種類均出現(xiàn)不同程度減少，至60 d時，LB和LP + LB 處理酵母菌數(shù)量均在檢出限以下 (圖 2)。

圖1 蘇丹草青貯飼料發(fā)酵過程中分離的酵母菌的26S rDNA D1/D2區(qū)序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 1 Phylogenetic tree of 26S rDNA D1/D2 region sequence of yeast during silage process of Sudangrass

2.4 同/異質(zhì)型乳酸菌對蘇丹草青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響

添加同/異質(zhì)型乳酸菌顯著提高了蘇丹草青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)。與對照相比，同/異質(zhì)型乳酸菌顯著降低了蘇丹草青貯飼料的pH、PA、BA、NH3-N以及酵母菌數(shù)量，同時顯著增加了LA和乳酸菌數(shù)量 (P＜0.05)(表 2)；V-score 評分依次為 LP ＞ LP +LB ＞ LB ＞ CK，LP 處理達(dá)到了 91，LP + LB 處理評分也達(dá)到了86，均達(dá)到優(yōu)質(zhì)青貯飼料的評分標(biāo)準(zhǔn)。

3 討論

從蘇丹草原料及青貯飼料中共檢出9種酵母菌，分別是Z. bailii、C. tropicalis、C. ethanolica、C.rugosa、C. glabrata、C. quercitrusa、K. marxianus、S. cerevisiae和P. kudriavzevii，這些酵母菌菌種已在相關(guān)研究報道中出現(xiàn)[17-19]。酵母菌具有很高的營養(yǎng)價值，特別是含有較多的蛋白質(zhì)、B族維生素、核酸和礦物質(zhì)等，同時也能產(chǎn)生一些保健功能的活性物質(zhì)。然而在青貯飼料中，酵母菌的存在卻是不利的，往往認(rèn)為酵母菌是引起青貯飼料有氧變質(zhì)的主要原因[9, 14]。過去認(rèn)為酵母菌在青貯飼料中只是少量的，但是近年來大量的研究證明酵母菌在青貯飼料中的數(shù)量并不少[7-8, 10]，但鑒定到種水平的酵母菌研究則較少。王慧麗[11]對TMR原料有氧狀態(tài)下的酵母菌群落進(jìn)行了相關(guān)研究，推測C. tropicalis在TMR好氧變質(zhì)過程中不起作用或起較小作用，而K. marxianus、C. glabrata和P. kudriavzevii則可能參與了好氧變質(zhì)過程。本研究中，在CK和LP處理中，Z. bailii所占比例在相當(dāng)長的時間內(nèi)占據(jù)絕對優(yōu)勢，直至青貯發(fā)酵60 d時，Z. bailii所占比例仍舊超過30%，而LB和LP + LB處理組中的Z. bailii則最先受到抑制，但Z. bailii是否是蘇丹草青貯飼料有氧變質(zhì)過程中起主要作用的酵母菌仍需更進(jìn)一步的研究。

圖2 蘇丹草在青貯發(fā)酵過程中pH、酵母菌數(shù)量及其組成的變化Figure 2 Changes in pH and yeasts and their composition during the silage process of Sudangrass

表2 同/異質(zhì)型乳酸菌對蘇丹草青貯發(fā)酵指標(biāo)的影響Table 2 Effects of Sudangrass silage with homo-and hetero-fermentative lactic acid bacteria on fermentation

布氏乳桿菌屬于異型發(fā)酵型乳酸菌，在青貯發(fā)酵過程中除產(chǎn)生乳酸外，還產(chǎn)生乙酸[5]，乙酸被認(rèn)為是抑制酵母菌活動的主要限制因素[20-21]。除此之外，初始pH的高低也會影響到布氏乳桿菌抑制酵母菌群落的作用效果[22]，當(dāng)初始pH低于5.0時，布氏乳桿菌的使用可有效增加青貯飼料中乙酸的含量，進(jìn)而抑制酵母菌的活動[23-24]。本研究中，與對照相比，隨著發(fā)酵過程中厭氧條件的逐漸形成及pH的迅速下降，含有布氏乳桿菌處理的青貯飼料的酵母菌逐漸受到抑制，具體表現(xiàn)在酵母菌的種類和數(shù)量都有所減少，至青貯60 d時，LB和LP + LB處理中酵母菌均已在檢出限以下。本研究中，蘇丹草原料的初始pH為4.85，在這一條件下布氏乳桿菌的添加能有效抑制酵母菌的生長和繁殖，這與上述研究結(jié)論相一致。

大量試驗表明，飼料青貯過程中同質(zhì)型/異質(zhì)型乳酸菌都起作用，在青貯飼料中無論添加同質(zhì)型乳酸菌還是異質(zhì)型乳酸菌，都能夠改善飼料的青貯品質(zhì)[25-26]，不同的是，同型發(fā)酵乳酸菌作為添加劑使用后可迅速降低青貯飼料的pH，同時降低NH3-N和BA含量，但其發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸含量較低，對于霉菌和酵母菌等的生長和繁殖抑制效果有限，在貯藏和取用過程中更容易發(fā)生腐敗[27-29]，而異型乳酸菌的使用卻能提高青貯飼料中的乙酸含量并提高其有氧穩(wěn)定性[30-31]。Driehuis等[32]的研究表明，布氏乳桿菌可將1 mol乳酸降解為0.48 mol乙酸、0.48 mol 1,2-丙二醇、0.04 mol乙醇和 0.52 mol CO2。Holzer等[33]的研究則表明，布氏乳桿菌能有效抑制青貯過程中酵母菌等真菌的生長，改善青貯發(fā)酵有氧穩(wěn)定性。本研究中，單獨(dú)使用植物乳桿菌的LP處理組，在青貯發(fā)酵60 d時，雖然酵母菌的種類有所減少，但是相較于0 d時，酵母菌數(shù)量反而還有所增加，這和上述研究結(jié)果相似；使用布氏乳桿菌的處理，其乙酸含量顯著(P＜0.05)高于未使用處理，但是否能有效增加蘇丹草青貯飼料的有氧穩(wěn)定性，仍需更進(jìn)一步的研究。

以往 對 玉米 (Zea mays)[5, 34]、羊 草 (Leymus chine nsis)[13]及小麥(Triticum aestivum)[27]的青貯研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌和布氏乳桿菌進(jìn)行聯(lián)合接種時，對發(fā)酵底物產(chǎn)物和微生物的數(shù)量影響并不明顯。本研究中，與對照組相比，LP + LB處理可顯著(P＜0.05)降低蘇丹草青貯飼料的 pH、PA、BA、LA/AA的比值、NH3-N以及酵母菌數(shù)量，同時顯著(P＜0.05)增加LA含量和乳酸菌的數(shù)量，V-score評分也較高，達(dá)到了86。這與上述研究結(jié)果存在差異，這可能與原料的青貯特性以及青貯前的加工調(diào)制方法有關(guān)(本研究中的蘇丹草原料新鮮刈割后進(jìn)行了凋萎處理)。

4 結(jié)論

與對照相比，單獨(dú)或混合添加植物乳桿菌和布氏乳桿菌均可顯著提高蘇丹草青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)；單獨(dú)添加植物乳桿菌可有效減少酵母菌的種類，但不能有效抑制酵母菌的數(shù)量，布氏乳桿菌和植物乳桿菌 + 布氏乳桿菌混合添加可有效抑制酵母菌的種類和數(shù)量。綜合考慮發(fā)酵品質(zhì)及提高蘇丹草青貯飼料有氧穩(wěn)定性等因素，以植物乳桿菌 + 布氏乳桿菌處理效果較好。