葫蘆科蔬菜單倍體育種技術(shù)研究進(jìn)展
——花藥和游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)

董彥琪，黃金華，劉喜存，王文英，王玲燕，朱紅彩

（河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 河南新鄉(xiāng) 453000）

葫蘆科（Cucurbitaceae）植物包括118個屬825個種，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)。在我國分布約有130個種，且多為人們所喜愛的瓜類蔬菜，如西瓜[Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum.&Nakai]、甜瓜（Cucumis melo L.）、黃瓜（Cucumis sativus L.）和南瓜（Cucurbita pepo L.）等，他們的復(fù)合雜交育種需要某些具有優(yōu)良性狀的材料。此類材料的制備一般要經(jīng)歷很長時間的篩選和純合，單倍體育種技術(shù)為葫蘆科育種材料的制備開辟了一條簡便快捷的途徑，不但可以獲得較多基因型的植株，篩選到符合目標(biāo)性狀的材料，而且可以大大縮短育種時間，節(jié)省人力和物力。

由于葫蘆科蔬菜自然發(fā)生單倍體的頻率極低，為了獲得較多的單倍體植株，國內(nèi)外主要通過一些生物技術(shù)途徑?；ㄋ幣囵B(yǎng)和小孢子培養(yǎng)途徑屬于離體雄核發(fā)育途徑（in vitro androgenesis）[1-4]，將發(fā)育到一定階段的花藥通過無菌操作技術(shù)接種到培養(yǎng)基上，改變發(fā)育程序誘導(dǎo)分化出胚狀體，形成愈傷組織，隨后使愈傷組織分化成完整植株的過程。利用該技術(shù)可快速獲得純系、縮短育種周期、加速育種進(jìn)程[5]。本文側(cè)重綜述了影響該技術(shù)的一些重要因素，如基因型、小孢子發(fā)育時期、生長環(huán)境、接種密度、培養(yǎng)基、生長調(diào)節(jié)劑、碳源、活性炭、三十烷醇、低溫預(yù)處理、熱激處理、倍性鑒定及植株再生等，為該技術(shù)的開展和應(yīng)用提供可行的理論依據(jù)。

1 基因型

不同基因型間愈傷組織誘導(dǎo)率相差很大，選擇合適的基因型是花藥培養(yǎng)成功的關(guān)鍵[6-7]。謝淼等[8]研究發(fā)現(xiàn)，所用的不同黃瓜品種花藥培養(yǎng)都可以誘導(dǎo)出愈傷組織，但誘導(dǎo)率和質(zhì)量不一樣；詹艷等[9]對10份黃瓜供試材料進(jìn)行花藥培養(yǎng)，只有4份試材獲得了胚狀體。Song等[10]用16個不同黃瓜品種進(jìn)行花藥培養(yǎng)，其中‘Ningjia No.1’出胚率最高。詹艷等[9]在黃瓜游離小孢子培養(yǎng)中也證實(shí)基因型是影響胚誘導(dǎo)的重要因素，不同基因型產(chǎn)胚量差異很大，最多的為每皿33.4胚，最少的為每皿1.5胚。

2 小孢子發(fā)育時期

適宜的花粉發(fā)育階段對誘導(dǎo)雄性單性生殖至關(guān)重要，是決定誘導(dǎo)能否成功及誘導(dǎo)頻率高低的內(nèi)在因素之一。瓜類花藥培養(yǎng)中，花粉發(fā)育階段有一定的差異。西瓜花粉單核中期至晚期花藥培養(yǎng)效果較好[2]，李娟[11]運(yùn)用DAPI熒光染色法，鏡檢觀察橫徑0.3～7.0 mm的西瓜雄花花蕾，結(jié)果表明花蕾橫徑在2.0～4.0 mm時，小孢子處于單核靠邊期。謝淼等[8]和詹艷等[9]研究表明黃瓜花藥處于單核中后期（花蕾長度為0.9～1.5 mm）時較適合培養(yǎng)；Metwally等[4]研究表明西葫蘆小孢子處于單核中期至單核晚期花藥培養(yǎng)效果較好。

3 生長環(huán)境

供體植株的生長環(huán)境對小孢子活力及培養(yǎng)效果也有一定影響。Mohamed等[12]報道，西葫蘆花藥培養(yǎng)種植材料冬季的出胚率是夏季的2倍多。謝淼等[8]研究表明黃瓜花藥培養(yǎng)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)由于誘導(dǎo)率與季節(jié)有關(guān)，春季（4月）比秋季（10月）的效果好。

4 接種密度

接種密度與誘導(dǎo)率成正相關(guān)。接種密度不可過大，以盡量減輕花藥在空間和營養(yǎng)上的競爭；但也不能過小，否則不利于促進(jìn)物質(zhì)的形成，也不利于愈傷組織的形成。詹艷等[9]在黃瓜游離小孢子培養(yǎng)中采用的小孢子密度為2×105個·mL-1。

5 培養(yǎng)基成分

5.1 基本培養(yǎng)基

一般選用MS作基本培養(yǎng)基。初期的研究中西瓜愈傷組織易褐變且誘導(dǎo)率不高[13]，袁萬良等[14]和魏瑛等[15]通過改良培養(yǎng)基解決了西瓜愈傷組織褐變死亡問題；袁萬良等[14]將分化階段西瓜愈傷組織的誘導(dǎo)率從0.5%提高到94.4%，并快速誘導(dǎo)出綠色愈傷組織。西葫蘆花藥培養(yǎng)中[4]也選用MS作為花藥愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。謝淼等[8]在黃瓜花藥培養(yǎng)中選用MS和B5作為基本培養(yǎng)基。

5.2 生長調(diào)節(jié)劑

基本培養(yǎng)基能保證培養(yǎng)物的生存與最低生理活動，但只有配合使用適當(dāng)?shù)募に兀拍苷T導(dǎo)細(xì)胞分裂、愈傷組織生長以及芽和根的分化等。前人在瓜類花藥培養(yǎng)的研究中表明[4，10，12，16]，對愈傷組織誘導(dǎo)率影響最大的是2，4-D。Kumar等[17]在黃瓜花藥培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，2個品種對2，4-D（質(zhì)量濃度0.44 mg· L-1）反應(yīng)不完全一致，‘Calypso’直接發(fā)育成胚，而‘Green Long’經(jīng)愈傷組織發(fā)育成胚。詹艷等[9]在黃瓜花藥培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)低質(zhì)量濃度的2，4-D（0.5 mg·L-1）有利于胚形成；Rakha 等[18]研究表明隨著 2，4-D質(zhì)量濃度（從1.0到5.0 mg·L-1）增加，形成的愈傷組織越來越少。

耿晨光等[19]認(rèn)為6-BA能顯著提高愈傷組織的誘導(dǎo)率，配合2，4-D和KT使用效果更好。詹艷等[9]研究表明低質(zhì)量濃度的 6-BA（0.2 mg·L-1）有利于黃瓜胚形成。Kumar等[17]研究認(rèn)為ABA能促進(jìn)胚發(fā)育成熟，并隨之發(fā)育成正常植株。Song等[10]研究認(rèn)為有利于黃瓜胚發(fā)育的BA和KT最佳質(zhì)量濃度為 1.0 mg·L-1和 1.25 mg·L-1。

5.3 碳源

5.3.1 蔗糖 蔗糖一直被認(rèn)為是植物組織培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)碳源而被廣泛應(yīng)用，他不僅能給外植體提供能量，而且也能維持一定的滲透壓。Metwally等[4]在西葫蘆花藥培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)當(dāng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的蔗糖質(zhì)量濃度為150g·L-1時的再生植株最多。陶正南[20]在甜瓜愈傷組織誘導(dǎo)中采用的蔗糖質(zhì)量濃度為60 g·L-1，分化培養(yǎng)基中的質(zhì)量濃度為30 g·L-1。Kumar等[21]研究表明誘導(dǎo)黃瓜胚胎形成的最佳蔗糖質(zhì)量濃度為 85 g·L-1，分化時則為 30 g·L-1。羊杏平等[22]研究表明高質(zhì)量濃度的蔗糖不利于西瓜小孢子的存活，‘特大鳳’和‘こがね小玉’在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13%的蔗糖處理中的小孢子活性均高于10%和16%的蔗糖處理。

5.3.2 甘露醇 甘露醇通過影響培養(yǎng)基的滲透壓而影響小孢子的發(fā)育。羊杏平等[22]研究表明，西瓜品種‘新小蘭’和‘黑美人’對甘露醇的反應(yīng)不一致。未添加甘露醇（對照）的‘新小蘭’小孢子活性最高，且隨著添加甘露醇濃度的增加‘新小蘭’小孢子活性急劇下降；‘黑美人’小孢子活性則隨甘露醇濃度的增加呈先增加后下降趨勢，甘露醇質(zhì)量濃度為10 g·L-1時小孢子活性達(dá)到最大值，為92%。

5.4 活性炭

在瓜類的花藥培養(yǎng)中，有關(guān)活性炭對培養(yǎng)過程的影響報道極少。加入活性炭的目的主要是利用其吸附性，減少有害物質(zhì)的不利影響（如活性炭能吸附一些酚類物質(zhì)，可以減輕愈傷組織的褐化，吸收瓊脂中的雜質(zhì)等）。此外，創(chuàng)造暗環(huán)境有利于某些植物生根。但是活性炭也能吸附有益物質(zhì)，如NAA、KT、6-BA、Fe-EDTA。喻財(cái)鈴[24]在絲瓜花藥培養(yǎng)中明確提出活性炭的效果差，有抑制作用。

5.5 三十烷醇

三十烷醇生理活性很強(qiáng)，使用濃度較低，具有促進(jìn)生根、發(fā)芽等功用，但三十烷醇在花藥培養(yǎng)中的作用尚未清楚。袁萬良等[14]發(fā)現(xiàn)加入一定濃度的三十烷醇，西瓜愈傷組織全部變?yōu)榫G色，并形成深綠色點(diǎn)狀組織，提高了再生植株的誘導(dǎo)率。李娟等[11]的研究也表明三十烷醇對西瓜愈傷組織的分化至關(guān)重要，在 MS+2.0 mg·L-1三十烷醇+0.5 mg·L-16-BA培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d后，愈傷組織能成功分化出叢生芽。

羊杏平等[22]在 NLN+0.2 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-12，4-D的培養(yǎng)基中添加三十烷醇能夠促進(jìn)‘新小蘭’小孢子活性，在培養(yǎng)3 d時，‘新小蘭’小孢子存活率達(dá)到最高值，為84%，而未加三十烷醇的小孢子存活率只有46%。而‘早春紅玉’對三十烷醇的反應(yīng)與‘新小蘭’剛好相反，三十烷醇抑制了‘早春紅玉’的小孢子存活率，且隨培養(yǎng)時間的延長，小孢子活性顯著下降。王開凍等[23]研究也表明，三十烷醇只對誘導(dǎo)和保持綠色愈傷組織有利，對促進(jìn)不定芽形成的效果不明顯。

6 處理方法

6.1 低溫預(yù)處理

低溫預(yù)處理是花藥培養(yǎng)中比較常見的培養(yǎng)方法。4 ℃是較為適宜的預(yù)處理溫度[4，8，20-26]，但不同蔬菜作物處理時間不完全一致。

劉林[25]利用顯微切片技術(shù)研究了低溫（4～6℃）條件下西瓜品種‘京欣三號’花藥的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，結(jié)果表明，小孢子母細(xì)胞和絨氈層細(xì)胞是花藥中對低溫最敏感的細(xì)胞；小孢子母細(xì)胞時期和減數(shù)分裂前期是對低溫最敏感的發(fā)育階段。魏瑛[26]研究表明4℃低溫條件下西瓜花藥處理72 h效果較佳；羊杏平等[22]研究表明西瓜‘金玉玲瓏’和‘拿比特’4℃低溫處理2 d的小孢子存活率高于對照，但4℃處理4 d后2品種的小孢子存活率均較對照顯著下降，其原因可能是處理時間過長，影響了小孢子繼續(xù)發(fā)育，致使單核靠邊期的小孢子數(shù)量減少；而朱迎春等[27]研究認(rèn)為4℃低溫處理48 h和72 h時，西瓜花藥培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)率均較高。

Kumar等[21]研究表明黃瓜花蕾在4℃條件下處理2 d的效果最佳；謝淼等[8]認(rèn)為黃瓜適宜處理時間是48～72 h。Metwally等[4]研究表明西葫蘆處理時間4 d效果較好。喻財(cái)鈴[24]研究表明4～7℃的低溫處理可以顯著地提高絲瓜愈傷組織的誘導(dǎo)率，且在4～8 d內(nèi)隨著處理時間的延長，愈傷組織誘導(dǎo)率增高。

6.2 熱激處理

熱激處理溫度對愈傷組織或胚狀體的形成以及促進(jìn)其生長都有重要作用。李娟等[11]研究表明36℃熱激4 d時，西瓜小孢子的脫分化效果好。其中，‘271’小孢子脫分化率最高，達(dá)4.01%。羊杏平等[22]研究表明西瓜小孢子活性隨熱激處理時間的增加呈先上升后下降的趨勢，35℃熱激4 d時‘金玉玲瓏’和‘拿比特’小孢子存活率均最高，分別為68.33%和66.00%。

7 倍性鑒定與植株再生

7.1 倍性鑒定

Dryanovska等[3]發(fā)現(xiàn)了自然加倍現(xiàn)象。然而大多學(xué)者研究證明，瓜類花藥培養(yǎng)中，單倍體、多倍體或與非整倍體現(xiàn)象并存。如Metwally等[4]在西葫蘆花藥培養(yǎng)中的研究表明，單倍體植株和二倍體植株各占50%；Mohamed等[12]在西葫蘆花藥培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)60%植株是單倍體、23%植株是二倍體、17%植株是非整倍體，用秋水仙堿處理得到的二倍體植株能正常開花結(jié)果；薛光榮等[13]對生根植株隨機(jī)取樣，用鐵礬蘇木精染色法，多次檢定根尖細(xì)胞染色體數(shù)，均可見單倍體植株細(xì)胞2n=x=11和具有一定數(shù)量的非整倍體細(xì)胞；Kumar等[21]在西葫蘆花藥培養(yǎng)中的研究表明，‘Calypso’單倍體植株和二倍體植株分別是80%和20%；‘Green Long’單倍體植株和二倍體植株分別是60%和40%。

7.2 植株再生

薛光榮等[13]將誘導(dǎo)的西瓜花藥愈傷組織轉(zhuǎn)移到MS+2.0～4.0 mg·L-1三十烷醇的分化培養(yǎng)基上分化出發(fā)育正常、葉色濃綠的植株；再將分化出的植株轉(zhuǎn)入 1/2 MS+0.2 mg·L-1IBA+1.0 mg·L-1IAA 或轉(zhuǎn)入1/2MS+1.5 mg·L-1IAA生根培養(yǎng)基上，10 d左右生根。劉林[25]研究表明，西瓜花藥愈傷組織誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS+0.5mg·L-1KT+1.5mg·L-16-BA+1.0mg·L-1NAA 和 MS+1.5 mg·L-1KT+1.0 mg·L-16-BA+1.5mg·L-1NAA，增殖分化最佳培養(yǎng)基為MS+1.0mg·L-1NAA+0.25 mg·L-16-BA，但最終未能誘導(dǎo)出不定芽。朱迎春等[27]在西瓜花藥培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，野生西瓜在3種誘導(dǎo)培養(yǎng)基和2種分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)率均較高，在大量元素NH4+減半的MS+0.5 mg·L-1IBA+3.0%蔗糖+0.7%瓊脂的生根培養(yǎng)基上生根率達(dá)80%以上，且根系健壯。

8 問題與展望

利用瓜類花藥培養(yǎng)和游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)獲得單倍體植株是一個較為成功的途徑，眾多國內(nèi)外學(xué)者研究了一些影響因素，在基因型、小孢子發(fā)育時期、生長環(huán)境、接種密度、培養(yǎng)基、生長調(diào)節(jié)劑、碳源、活性炭、三十烷醇、低溫預(yù)處理、熱激處理、倍性鑒定及植株再生等方面并取得了一些重要進(jìn)展。如處于中期至單核靠邊期的花粉最易誘導(dǎo)胚胎發(fā)生，而其他時期的小孢子則不宜誘導(dǎo)成胚，因此小孢子發(fā)育時期是影響誘導(dǎo)成胚的關(guān)鍵因素；由西瓜花藥愈傷組織分化形成不定芽是比較困難的，外界激素起著重要作用，如 2，4-D、6-BA、KT、三十烷醇等對愈傷組織誘導(dǎo)起很大的促進(jìn)作用，但還存在愈傷組織褐化和不定芽玻璃化現(xiàn)象，使用激素時應(yīng)考慮外植體內(nèi)源激素水平和激素間相互配合作用等因素；4℃低溫預(yù)處理是保存花蕾的一種有效方式，熱激處理（35℃或36℃）促進(jìn)愈傷組織的形成，但低溫預(yù)處理和熱激處理對小孢子發(fā)育途徑的影響機(jī)制尚未見報道。

利用花藥培養(yǎng)和游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)已在黃瓜、西瓜、甜瓜、西葫蘆、絲瓜等瓜類作物上獲得了單倍體胚和單倍體植株，該技術(shù)為研究離體雄核發(fā)育機(jī)制、開展更廣泛的雄核（花藥和游離小孢子）單倍體培養(yǎng)奠定了基礎(chǔ)。游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)是一種更高效的單倍體胚誘導(dǎo)和植株再生技術(shù)，然而在瓜類作物單倍體育種中報道較少。深入探索瓜類游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)、建立高頻小孢子胚誘導(dǎo)和植株再生體系是今后育種工作者研究的重要方向。