尿HCMV-DNA檢測(cè)在新生兒疾病中的應(yīng)用價(jià)值*

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·論著·

尿HCMV-DNA檢測(cè)在新生兒疾病中的應(yīng)用價(jià)值*

鐘瑞芬1，黎四平1△，梁麗云1，程慶秋2，黃慧萍1，胡勉裕1，陸小梅2

(1.東莞市第八人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東東莞 523325；2.東莞市兒科研究所，廣東東莞 523325)

摘要:目的通過(guò)比較不同疾病中的新生兒尿人巨細(xì)胞病毒DNA(HCMV-DNA)與血HCMV-IgM抗體的結(jié)果，評(píng)估尿HCMV-DNA在新生兒疾病中的應(yīng)用價(jià)值。方法采集2013年1月至2014年12月在該院新生兒科住院的1 520例嬰幼兒的尿液進(jìn)行HCMV-DNA熒光定量PCR檢測(cè)，同時(shí)采集其血液采用化學(xué)發(fā)光方法檢測(cè)HCMV-IgM抗體。結(jié)果1 520例嬰幼兒中尿HCMV-DNA陽(yáng)性者有153例，陽(yáng)性率為10.07%，血液標(biāo)本中的HCMV-IgM陽(yáng)性者僅有4例，陽(yáng)性率為0.27%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。1 520例嬰幼兒的疾病構(gòu)成中，診斷為肝炎綜合征的HCMV-DNA陽(yáng)性率為82.6%，HCMV-IgM陽(yáng)性率為3.85%。出現(xiàn)黃疸癥狀的HCMV-DNA陽(yáng)性率為8.95%，肺部感染的HCMV-DNA陽(yáng)性率4.62%。各項(xiàng)疾病或癥狀的HCMV-DNA陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論在診斷嬰幼兒HCMV的感染時(shí)，尿HCMV-DNA檢測(cè)比HCMV-IgM抗體更為優(yōu)越，尤其在肝炎綜合征、新生兒黃疸、肺部感染中的應(yīng)用價(jià)值更高。

關(guān)鍵詞:巨細(xì)胞病毒；人巨細(xì)胞病毒脫氧核糖核酸；新生兒；尿

人巨細(xì)胞病毒(HCMV)屬于β皰疹病毒亞科，是導(dǎo)致新生兒產(chǎn)后感染的常見(jiàn)病原微生物。HCMV在自然人群中的感染較為常見(jiàn)，通常呈無(wú)癥狀的隱性感染[1]。當(dāng)孕婦感染HCMV后，病毒可通過(guò)胎盤(pán)使胎兒感染，可導(dǎo)致流產(chǎn)、早產(chǎn)或者引起胎兒生長(zhǎng)發(fā)育遲緩及畸形等，嚴(yán)重者還可導(dǎo)致死胎，嚴(yán)重威脅孕婦及胎兒的健康[2]。受到HCMV感染的胎兒在出生后，可能出現(xiàn)黃疸、肝炎、皮膚出血點(diǎn)及淤斑或肺炎等癥狀，還可能會(huì)出現(xiàn)耳聾、運(yùn)動(dòng)或智力障礙等[3]，如果能對(duì)感染的嬰兒進(jìn)行早期的診斷將對(duì)嬰兒的治療有重要的指導(dǎo)意義。嬰兒出生后，還可通過(guò)吸食含有HCMV的乳汁而被傳染[4]。本研究采用熒光定量PCR方法檢測(cè)有黃疸或肝功能損害等癥狀的新生嬰兒以及早產(chǎn)兒尿液中的HCMV-DNA，再用化學(xué)發(fā)光方法檢測(cè)其血液中HCMV-IgM抗體，比較這兩種檢測(cè)方法的檢測(cè)陽(yáng)性率，探討HCMV-DNA熒光定量檢測(cè)方法在HCMV感染引起不同的疾病或癥狀中的應(yīng)用價(jià)值。

1資料與方法

1.1一般資料1 520例嬰幼兒來(lái)源于本院2013年1月至2014年12月在新生兒科住院的患兒，患兒入住新生兒科的原因有肝炎綜合征，黃疸癥狀，肺部感染癥狀，早產(chǎn)兒等，其中男826例，女694例，年齡從1～15 d，平均年齡為7 d。

1.2標(biāo)本采集嬰幼兒尿標(biāo)本的采集：清潔患兒外陰，用一次性潔凈尿袋留取患兒新鮮尿液2～5 mL，置于干凈的無(wú)菌管中，立即送檢。標(biāo)本送達(dá)實(shí)驗(yàn)室后置-20 ℃冰箱中保存，集中檢測(cè)HCMV-DNA?；純貉簶?biāo)本的采集：消毒皮膚后，用一性采血管采集靜脈血2 mL，立即送檢。標(biāo)本送達(dá)實(shí)驗(yàn)后立即檢測(cè)或離心分離血清后置2～8 ℃冰箱中保存，第2天檢測(cè)。

1.3儀器與試劑HCMV-DNA采用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供的HCMV熒光PCR定量試劑，檢測(cè)儀器采用美國(guó)MX3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對(duì)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。HCMV-IgM采用深圳新產(chǎn)業(yè)化學(xué)發(fā)光儀及配套試劑進(jìn)行檢測(cè)。

1.4HCMV-DNA標(biāo)本處理取晨尿1 mL于1.5 mL的無(wú)菌離心管中，12 000 r/min離心5 min，去上清，沉淀(沉淀如不明顯，再加尿液1 mL于以上1.5 mL的無(wú)菌離心管中，12 000 r/min離心5 min，去上清)加50 μL DNA提取液混勻，100 ℃恒溫處理10 min(誤差不超過(guò)1 min)，12 000 r/min離心5 min，取上清液(含病毒DNA)2 μL做PCR擴(kuò)增。另外取出陰性質(zhì)控品加50 μL DNA提取液打勻，100 ℃保溫10±1 min；12 000 r/min離心5 min，取上清液2 μL備用。

1.5PCR擴(kuò)增從試劑盒中取出HCMV PCR反應(yīng)管若干,分別加入處理后的上清液各2 μL，8 000 r/min離心數(shù)秒。93 ℃：2 min；93 ℃：45 s，55 ℃：60 s，10個(gè)循環(huán)；93 ℃：30 s；55 ℃：45 s，30個(gè)循環(huán)。

1.6結(jié)果判斷陰性質(zhì)控品：增長(zhǎng)的曲線不呈S型曲線或Ct值等于30；陽(yáng)性質(zhì)控品：增長(zhǎng)的曲線呈S型曲線，且強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品檢測(cè)值允許范圍1.0×105～2.0×106copies/mL，弱陽(yáng)性質(zhì)控品檢測(cè)值允許范圍1.0×103～2.0×104copies/mL；陽(yáng)性定量質(zhì)控品：增長(zhǎng)的曲線呈S型曲線Ct值小于27，且0.97≤|r|≤1。以上要求需在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿(mǎn)足，否則，本次實(shí)驗(yàn)無(wú)效，全部實(shí)驗(yàn)應(yīng)重新進(jìn)行。若定量數(shù)值在線性范圍內(nèi)：5.0×102≤C≤5.0×108，則樣品中的HCMV-DNA含量=C copies/mL;如果定量數(shù)值在線性范圍外，有兩種情況：(1)C>5.0×108，則樣品中的HCMV-DNA的水平大于5.0×108copies/mL。如果需要精確定量結(jié)果，可將樣品稀釋至線性范圍內(nèi)再檢測(cè)。(2)C<5.0×102，則樣品中的HCMV-DNA水平小于5.0×102copies/mL。在本研究中，為方便統(tǒng)計(jì)，把樣品中的HCMV-DNA水平大于或等于5.0×102copies/mL判斷為陽(yáng)性，把樣品中的HCMV-DNA的水平小于5.0×102copies/mL判斷為陰性。

1.7HCMV-IgM標(biāo)本處理及結(jié)果判斷血液標(biāo)本及時(shí)分離血清，避免溶血，盡快采用深圳新產(chǎn)業(yè)化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行檢測(cè)，若樣品的檢測(cè)結(jié)果小于2.0 AU/mL的為陰性，若樣品的檢測(cè)結(jié)果大于或等于4.2 AU/mL的為陽(yáng)性。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用χ2檢驗(yàn)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩種HCMV方法的結(jié)果1 520例嬰幼兒的尿液樣本中，HCMV-DNA陽(yáng)性者有153例，陽(yáng)性率為10.07%，HCMV-DNA陽(yáng)性者其水平介于1.037×103～4.966×106copies/mL。1 520例嬰幼兒血液標(biāo)本中的HCMV-IgM陽(yáng)性者有4例，陽(yáng)性率為0.27%，HCMV-IgM陽(yáng)性者其抗體水平介于5.6～11.2 AU/mL，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明HCMV-DNA的陽(yáng)性檢出率較HCMV-IgM的陽(yáng)性檢出率要高。見(jiàn)表1。

2.2HCMV在不同疾病中的陽(yáng)性率1 520例嬰幼兒的疾病或癥狀構(gòu)成中，診斷為肝炎綜合征的HCMV-DNA陽(yáng)性率最高，HCMV-IgM陽(yáng)性率也最高，出現(xiàn)黃疸癥狀的、肺部感染癥狀HCMV-DNA陽(yáng)性率也較高。各項(xiàng)疾病或癥狀的HCMV-DNA陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明在新生兒肝炎綜合征、黃疸、肺部感染時(shí)，應(yīng)注意排除HCMV的感染。見(jiàn)表2。

表1　　1 520例嬰幼兒的兩種HCMV方法的結(jié)果比較(n)

表2　　1 520例嬰幼兒的疾病或癥狀構(gòu)成比及HCMV在

2.3HCMV感染的性別分布1 520例嬰幼兒中的HCMV感染的性別分布中，男性嬰幼兒尿HCMV-DNA陽(yáng)性者有85例，陽(yáng)性率為10.29%，血液HCMV-IgM陽(yáng)性者有2例，陽(yáng)性率為0.24%。女性嬰幼兒尿HCMV-DNA陽(yáng)性者有68例，陽(yáng)性率為9.80%，血液HCMV-IgM陽(yáng)性者有2例，陽(yáng)性率為0.29%,兩者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3　　1 520例嬰幼兒中的HCMV感染的性別分布[n(%)]

3討論

HCMV在人群中感染較為普遍，多表現(xiàn)為隱性感染，當(dāng)個(gè)體免疫力低下時(shí)，病毒可表現(xiàn)較為活躍而出現(xiàn)癥狀，成為顯性感染[1,5]。嬰幼兒免疫系統(tǒng)發(fā)育尚不完全，因此，極易引起HCMV感染[6]，并且嬰幼兒產(chǎn)生IgM、IgG抗體的能力均較弱，血清中HCMV-IgM 抗體不強(qiáng)，檢出率較低[7]。此外，HCMV抗體的產(chǎn)生需一段時(shí)間，當(dāng)患者感染病原體約2周后IgM抗體才達(dá)到被檢出的水平，說(shuō)明IgM檢查不能作為早期診斷的良好指標(biāo)。本研究中，HCMV-IgM陽(yáng)性者其抗體水平介于5.6～11.2 AU/mL，抗體水平均不高。最后，從檢測(cè)方法學(xué)上，熒光定量PCR的準(zhǔn)確性和快速性?xún)?yōu)勢(shì)，能更早檢測(cè)到感染的病毒，甚至比出現(xiàn)臨床癥狀的時(shí)間提前3～10 d[8]。表1的結(jié)果顯示，1 520例嬰幼兒中HCMV-DNA的陽(yáng)性率為10.07%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)地高于血液標(biāo)本中的HCMV-IgM的陽(yáng)性率(僅為0.27%)。表明在出生15 d內(nèi)的嬰幼兒中，HCMV-DNA的陽(yáng)性檢出率較HCMV-IgM的陽(yáng)性檢出率要高，HCMV-DNA在診斷嬰幼兒HCMV感染中的價(jià)值較高。

HCMV可以侵犯機(jī)體的多種器官，肝臟是重要的靶器官，在嬰幼兒感染中可以造成黃疸、肝功能受損、肝脾腫大、肺炎、瘀斑等，還可表現(xiàn)為局限的感染，在孕婦感染中可導(dǎo)致流產(chǎn)、早產(chǎn)或者引起胎兒生長(zhǎng)發(fā)育遲緩等[3,9]。本研究表2的結(jié)果顯示，在1 520例嬰幼兒中，診斷為肝炎綜合征的患兒中，HCMV-DNA陽(yáng)性率最高，HCMV-IgM陽(yáng)性率也最高，出現(xiàn)黃疸癥狀的、肺部感染癥狀HCMV-DNA陽(yáng)性率也較高，此時(shí)HCMV-IgM未見(jiàn)陽(yáng)性。表明HCMV更容易侵犯肝臟和肺臟。表3的結(jié)果表明HCMV在嬰幼兒感染中，與嬰幼兒的性別無(wú)關(guān)。

綜上所述，結(jié)合本研究的結(jié)果，由于HCMV具有嗜上皮細(xì)胞的特性，容易感染腎臟上皮細(xì)胞，在尿標(biāo)本中容易檢出HCMV-DNA[10]，加上尿液標(biāo)本取材方便、對(duì)新生兒無(wú)損傷性，更為家長(zhǎng)所接受，因此，筆者認(rèn)為進(jìn)行尿HCMV-DNA檢測(cè)比進(jìn)行HCMV-IgM抗體檢測(cè)來(lái)判斷是否感染HCMV更具有快速、準(zhǔn)確、可靠、便捷的優(yōu)勢(shì)。當(dāng)新生兒出現(xiàn)肝炎綜合征、黃疸癥狀、肺部感染癥狀等其他癥狀時(shí)，尤其是當(dāng)出現(xiàn)肝功能受損排除乙肝、丙肝、甲肝、丁肝等肝炎病毒，以及肺部感染排除一般微生物、支衣原體、呼吸道病毒后，也應(yīng)當(dāng)提示臨床進(jìn)行尿HCMV-DNA檢驗(yàn)以排除巨細(xì)胞感染的可能性，而不能只依靠HCMV-IgM抗體的檢測(cè)結(jié)果來(lái)判斷。至于是否在孕期也進(jìn)行孕婦尿HCMV-DNA檢測(cè)或者增加孕期HCMV-IgM檢測(cè)頻率來(lái)預(yù)測(cè)新生兒巨細(xì)胞感染，以及對(duì)于新生兒HCMV-IgM抗體陰性者經(jīng)過(guò)2周至1個(gè)月的時(shí)間，其HCMV-IgM的陽(yáng)性檢出率是否會(huì)增加來(lái)輔助診斷新生兒巨細(xì)胞感染，還有待進(jìn)一步調(diào)查研究。

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Application value of the detection of HCMV-DNA in urine in the diseases of neonatus*

ZhongRuifen1,LiSiping1△,LiangLiyun1,ChenQingqiu2,HuangHuiping1,HuMianyu1,LuXiaomei2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,NO.8HospitalofDongguanCity,Dongguan,Guangdong523325，China;2.DongguanInstituteofPediatric,Dongguan,Guangdong523325,China)

Abstract:ObjectiveTo evaluate the value of detecting HCMV-DNA in urine in the diseases of newborn babies,by comparing the result between HCMV-DNA in urine and HCMV-IgM antibody in blood in different diseases of the newborn babies.MethodsThe urine and blood samples were collected from 1 520 infants who were in hospital of the neonate department from January 2013 to December 2014.The HCMV-DNA in urine was examined by fluorescence quantitative polymerase chain reaction(FQ-PCR).And HCMV-IgM antibody in blood was examined by the method of chemiluminescence(ECL).ResultsIn the 1 520 cases，153 had detectable HCMV-DNA in their urine samples with a positive rate 10.07%,while only 4 cases were positive of the HCMV-IgM antibody in blood with a positive rate 0.27%.The two groups was statistically significant difference (P<0.05).In the infant diseases of 1 520 cases,the positive rate of HCMV-DNA in urine was 82.6% of the hepatitis syndrome while the positive rate of HCMV-IgM antibody in blood was 3.85%.The positive rate of HCMV-DNA in urine was 8.95% in the jaundice symptoms,while the positive rate HCMV-DNA in urine was 4.62% in the pulmonary infection.Each group of disease was statistically significant difference in the positive rate of HCMV-DNA (P<0.05).ConclusionThe detection of HCMV-DNA in urine is more beneficial to the diagnosis of HCMV infection of infants than the detection of HCMV-IgM antibody in blood,especially in hepatitis syndrome,neonatal jaundice and pulmonary infection.

Key words:cytomegalovirus；human cytomegalovirus DNA；neonatus；urine

(收稿日期：2015-10-18)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.04.018

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)04-0475-03

基金項(xiàng)目：東莞市科技計(jì)劃醫(yī)療衛(wèi)生類(lèi)科研重點(diǎn)資助項(xiàng)目(2013108101016)。

作者簡(jiǎn)介：鐘瑞芬，女，主管技師，主要從事臨床檢驗(yàn)研究?！魍ㄓ嵶髡?E-mail:lsp020@163.com。