13種鏈球菌超抗原基因的雙重實時熒光PCR檢測方法的建立*

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·論著·

13種鏈球菌超抗原基因的雙重實時熒光PCR檢測方法的建立*

崔淑娟，石偉先，張代濤，趙家琛，盧桂蘭，劉醫(yī)萌，梁慧潔，彭曉旻△，楊鵬，王全意

(北京市疾病預(yù)防控制中心傳染病地方病控制所，北京100013)

摘要:目的建立一新的快速的鏈球菌超抗原基因檢測方法，能快速、靈敏及特異地分析樣本中存在的各種超抗原基因。方法根據(jù)13種鏈球菌超抗原基因的保守序列設(shè)計特異性引物和探針,利用13種超抗原的陽性標(biāo)本作為模板來優(yōu)化了反應(yīng)體系與擴(kuò)增條件,并驗證其特異度與靈敏度。結(jié)果利用該研究建立的雙重?zé)晒釶CR方法體系，可以特異性鑒定出13種鏈球菌超抗原，并且與其他呼吸道病原菌也沒有交叉反應(yīng)。另外，該檢測體系的檢測靈敏度高于普通PCR至少 1～2個數(shù)量級(10～100倍)及以上。結(jié)論該研究建立的雙重實時熒光PCR法能更加準(zhǔn)確、快速地對鏈球菌菌株中的超抗原基因進(jìn)行檢測分析。

關(guān)鍵詞:鏈球菌；超抗原；雙重實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)

釀膿鏈球菌(GAS)是人類最常見和重要的致病菌之一。90%的鏈球菌感染疾病是由GAS引起的[1-2]。GAS可以產(chǎn)生大量的毒力致病因子，包括多種黏附分子和30余種外分泌蛋白，如鏈球菌超抗原、溶細(xì)胞素、蛋白酶、DNase和各種各樣的水解酶等。目前已知GAS的超抗原包括SpeA、SpeC、SpeG、SpeH、SpeI、SpeJ、SpeL、SpeK、SpeM、Ssa和SmeZ,共有11種。另外，化膿鏈球菌細(xì)胞外蛋白酶SpeB和SpeF也表現(xiàn)出超抗原的活性。超抗原是導(dǎo)致侵襲性鏈球菌感染的重要毒力因子。因此，基于各種超抗原的研究對于鏈球菌的深入研究及其流行病學(xué)的研究就顯得非常重要。Meisal等[3]建立了用普通PCR法對GAS超抗原進(jìn)行分型檢測，但是由于普通PCR的靈敏度較低、操作繁瑣而局限了該方法的應(yīng)用。因此，本課題擬建立一種全新的鏈球菌超抗原基因雙重實時熒光PCR檢測方法，能夠快速、靈敏及特異地鑒定13種超抗原基因。

1材料與方法

1.1標(biāo)本靈敏度檢測標(biāo)本：SpeA、SpeC、SpeG、SpeH、SpeI、SpeJ、SpeL、SpeK、SpeM、Ssa、SmeZ、SpeB和SpeF陽性標(biāo)本各1例。每個標(biāo)本分別進(jìn)行10倍梯度稀釋，每個標(biāo)本共計5個濃度，即原液、1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000倍稀釋。特異度檢測標(biāo)本：肺炎支原體(MP)、流行性腦膜炎雙球菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌(MRSA)、B族鏈球菌(FT67)、G族鏈球菌(XCN14)各1例。

1.2儀器與試劑CFX96實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad，美國)，普通PCR儀life Express(大和公司，日本)，凝膠圖象分析系統(tǒng)BioSenSC300(上海山富科學(xué)儀器有限公司)；Taq酶(Promega，美國)、瓊脂糖(西班牙)、DNA 標(biāo)記物 DL2000(TAKARA)、引物(上海英駿公司合成)等。

1.3方法

1.3.1核酸提取取100 L標(biāo)本直接加入100 L核酸抽提液，充分混勻，沸水浴10 min，然后13 000 r/min離心5 min，取上清4 L作為PCR反應(yīng)模板。

1.3.2普通定性PCR利用普通PCR法對13種型別的鏈球菌超抗原樣本的各稀釋度標(biāo)本以及肺炎支原體(MP)、流行性腦膜炎雙球菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌(MRSA)、B族鏈球菌(FT67)、G族鏈球菌(XCN14)進(jìn)行檢測，擴(kuò)增引物及反應(yīng)條件見表1[3]。

1.3.3雙重實時熒光PCR根據(jù)NCBI上登錄的13種超抗原的基因序列，針對各自保守區(qū)設(shè)計特異性引物和TaqMan探針序列，并由上海英俊公司合成(具體序列及組合見表2)。檢測體系(40 L)根據(jù)上海之江生物科技股份有限公司鏈球菌超抗原檢測試劑盒的說明書進(jìn)行配制，反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)熱2 min；再按93 ℃預(yù)熱15 s，55 ℃擴(kuò)增60 s，循環(huán)40次；單點熒光檢測溫度為55 ℃。熒光通道檢測選擇：選用FAM和VIC/HEX雙通道。Ct值小于或等于38確定為陽性。

表1　　普通定性PCR所用引物及擴(kuò)增參數(shù)

表2　　13種超抗原的雙重實時熒光PCR方法的配伍及

2結(jié)果

2.1特異度檢測結(jié)果分別用普通定性PCR和雙重實時熒光PCR對13種鏈球菌超抗原樣本、肺炎支原體、流行性腦膜炎雙球菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌標(biāo)本進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，普通定性PCR和雙重實時熒光PCR能特異性檢測出13種鏈球菌超抗原樣本，而肺炎支原體、流行性腦膜炎雙球菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌標(biāo)本則均為陰性。

2.2靈敏度檢測結(jié)果分別對13種鏈球菌超抗原的各自5個10倍梯度稀釋樣本同時進(jìn)行普通定性PCR和雙重實時熒光PCR檢測，普通定性PCR電泳圖見圖1(以SpeA和SpeL組合為例)，雙重實時熒光PCR擴(kuò)增曲線圖見圖2(見《國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”)(以SpeA和SpeL組合為例)。從結(jié)果上看，實時熒光PCR的檢測下限要低于普通定性PCR，普通定性PCR最多只能檢測到1∶100的稀釋濃度，而實時熒光PCR則至少能檢測到1∶1 000的稀釋濃度以上。在13種鏈球菌超抗原中，SpeC、SpeG和SpeM的實時熒光PCR檢測靈敏度高于普通定性PCR 1個數(shù)量級(10倍)，而其他10種超抗原實時熒光PCR檢測靈敏度均高于普通定性PCR 2個數(shù)量級(100倍)及以上。

M：DNA標(biāo)記物D2000；1～5：SpeA陽性樣品的5個梯度稀釋樣品(模板濃度由原液、10-1～1∶10-4)擴(kuò)增產(chǎn)物；6：陰性對照；7～11：SpeL陽性樣品的5個梯度稀釋樣品(模板濃度由原液、10-1～1∶10-4)擴(kuò)增產(chǎn)物；12：陰性對照。

圖1SpeA和SpeL普通定性PCR擴(kuò)增圖

3討論

鏈球菌嚴(yán)重威脅人類的健康，它能分泌包括超抗原在內(nèi)的一系列毒力因子，這些毒力因子在多種感染性疾病、自身免疫性疾病以及腫瘤的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。超抗原以MHCⅡ類分子依賴或非依賴的方式，與TCR Vβ結(jié)合激活T細(xì)胞，比普通抗原高1 000～100 000倍左右[4]。因此，研究超抗原基因在鏈球菌菌株中的分布，有助于鏈球菌致病機(jī)制的深入研究，便于更好地指導(dǎo)臨床感染性疾病和自身免疫性疾病的治療。

研究發(fā)現(xiàn)，超抗原基因在鏈球菌菌株中的分布存在不穩(wěn)定性，各個地區(qū)的超抗原基因存在情況也有所差異。因此需要開展鏈球菌菌株中超抗原基因的流行性調(diào)查。近年來分子生物學(xué)的發(fā)展為超抗原基因的檢測提供了很好的技術(shù)條件。如Meisal等[3]建立的普通定性PCR檢測超抗原基因技術(shù)，它能快速地對鏈球菌菌株中的各種超抗原基因進(jìn)行檢測。但是由于普通定性PCR的靈敏度較低，且其操作復(fù)雜，易造成污染。因此該方法已不符合當(dāng)前的發(fā)展需要。近年來，在普通PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的實時熒光定量PCR將核酸檢測的特異度和靈敏度大大提高。它克服了常規(guī)PCR易造成實驗室污染的缺點，保持了靈敏度、特異度高的優(yōu)點，還能進(jìn)行準(zhǔn)確定量，使常規(guī)PCR實現(xiàn)了從定性[4-8]到定量[9-12]的革命性飛躍。由于整個擴(kuò)增和檢測過程均為閉管操作，不需開蓋吸取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，避免了PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的污染，減少了假陽性結(jié)果，廣泛用于臨床病原體的檢測[13-15]。

本研究基于實時熒光定量PCR技術(shù)平臺建立了鏈球菌超抗原基因雙重實時熒光PCR檢測方法，并將其與普通定性PCR法從靈敏度和特異度兩個方面進(jìn)行比較研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)熒光PCR的靈敏度要明顯高于普通PCR，其敏感性至少要高于普通定性PCR 1個數(shù)量級以上。在特異度方面，用普通定性PCR和實時熒光PCR法分別對其他相似菌株MP、流行性腦膜炎雙球菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、MRSA進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果均為陰性，這表明實時熒光PCR法檢測鏈球菌超抗原基因的特異度與普通定性PCR法相當(dāng)。因此，本研究建立的實時熒光PCR法能更加準(zhǔn)確、快速、靈敏地對鏈球菌菌株中的超抗原基因進(jìn)行檢測分析。

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Development of a duplex real-time PCR assay for detecting 13 streptococcal superantigens*

CuiShujuan,ShiWeixian,ZhangDaitao,ZhaoJiachen,LuGuilan,LiuYimeng,LiangHuijie,PengXiaomin△,YangPeng,WangQuanyi

(InstituteforInfectiousDiseaseandEndemicDiseaseControl,BeijingCenterforDiseasePreventionandControl,Beijing100013,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a duplex real-time PCR assay for rapid,sensitive,specific detection of 13 streptococcal superantigens.MethodsPrimer and probe sequences were selected based on the highly conserved region from an alignment of nucleotide sequences of the 13 streptococcal SAgs.The reaction conditions of the duplex real-time PCR were optimized and the specificity and sensitivity of the duplex assay was evaluated using SAg positive strains.Results13 SAgs were able to differentiated using the duplex assay and there was no cross-reaction with non-Streptococcus bacteria.On the other hand,the limit of detection of the duplex assay was at least one or two log dilutions higher than that of the conventional PCR.ConclusionThe study of duplex real-time PCR assay can identified 13 streptococcal superantigens accurately and fastly.

Key words:streptococcal;superantigens;duplex real-time fluorescent polymerase chain reaction

(收稿日期：2015-10-20)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.04.004

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)04-0441-03

基金項目：北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生技術(shù)人才培養(yǎng)計劃項目(2013-3-098)；北京市青年拔尖人才項目(2014000021223ZK36)。

作者簡介：崔淑娟，女，副研究員，主要從事呼吸道病原體的研究?！魍ㄓ嵶髡撸珽-mail:pengxiaomin@bjcdc.org。