血細(xì)胞分析自動化與顯微鏡復(fù)檢應(yīng)關(guān)注什么

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·述評·

血細(xì)胞分析自動化與顯微鏡復(fù)檢應(yīng)關(guān)注什么

張時民1,2，王庚1,2

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，北京 100730；2.北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科,北京 100730)

關(guān)鍵詞:血細(xì)胞分析；顯微鏡；復(fù)檢

由于血細(xì)胞分析儀具有快速、準(zhǔn)確和便捷等優(yōu)勢，60多年來一直在改變實驗室血常規(guī)檢驗方法與檢驗流程。近年來血細(xì)胞分析儀由于各種新技術(shù)的使用，其檢測性能越來越強大，檢測參數(shù)也越來越多，特別是具有白細(xì)胞五分類技術(shù)的儀器的普及應(yīng)用及全自動流水線化的血細(xì)胞分析系統(tǒng)的使用，使得實驗室越來越依賴這樣的設(shè)備來完成大量的血常規(guī)檢驗工作[1]。在樣本量加大和人員缺乏這種特定環(huán)境條件下，外周血涂片檢查的重要性被逐漸淡化和忽視，以至造成一些漏診與錯誤。這種現(xiàn)象已經(jīng)引起國內(nèi)外臨床檢驗界的重視，因此P.W.Barnes等教授倡導(dǎo)并組成了國際血液學(xué)復(fù)檢專家組(International Consensus Group for hematology Review)，并在2005年制定了自動血細(xì)胞計數(shù)和白細(xì)胞分類計數(shù)的復(fù)檢標(biāo)準(zhǔn)[2]，該標(biāo)準(zhǔn)被國際實驗血液學(xué)學(xué)會(ISLH)作為一個推薦方法介紹給全球使用各種自動化血液分析系統(tǒng)的專業(yè)人士參考。中華醫(yī)學(xué)會檢驗分會也于2006年組成全國血液學(xué)復(fù)檢專家小組對該標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)的釋義并將其發(fā)表[3]，這就是所熟悉的41條篩檢規(guī)則。而采用不同的血細(xì)胞分析系統(tǒng)，建立與各自醫(yī)療單位和服務(wù)人群相適應(yīng)的復(fù)檢規(guī)則也成為血液分析儀的用戶單位的重要工作，這也是衛(wèi)生部實驗室管理辦法和ISO 15189評審中重要的檢查條款。

血涂片的復(fù)檢與復(fù)核方法有兩種，血片瀏覽(review)和血片分類(differential)。許多情況下僅僅需要瀏覽復(fù)核血片，用于確認(rèn)血細(xì)胞分析儀得出的結(jié)論，例如紅細(xì)胞體積大小(對發(fā)現(xiàn)的紅細(xì)胞異常形態(tài)、染色、內(nèi)含物應(yīng)同時進(jìn)行描述和報告)，大小不等、某類細(xì)胞增高或減低(不包括形態(tài)學(xué)報告內(nèi)容)。對出現(xiàn)白細(xì)胞形態(tài)學(xué)提示的問題，分類不正確的問題、不能分類的問題，則應(yīng)采用顯微鏡下血片分類，重新分類報告。那么復(fù)檢規(guī)則要關(guān)注和解決那些問題呢？以下幾點建議供參考。

1瀏覽血片

首先瀏覽血涂片，此時可采用低倍(或高倍)鏡瀏覽觀察，初步了解血涂片制片效果，細(xì)胞的分布情況，染色效果，有否具有病理意義的大型細(xì)胞的出現(xiàn)等。同時觀察血小板的聚集情況，如果是外周血、未抗凝的條件下直接涂片，血小板應(yīng)出現(xiàn)輕度聚集，可見3～5個的小型聚集或成簇狀聚集，表明血小板具有聚集能力，血小板無力癥患者血涂片中的血小板雖數(shù)量未見異常，但血小板散在分布，幾乎見不到聚集的血小板，也是一種異?，F(xiàn)象。如果是抗凝血，血小板應(yīng)該分布均勻，不應(yīng)出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，如有聚集出現(xiàn)將是導(dǎo)致儀器計數(shù)異常的問題所在。同時還需要觀察紅細(xì)胞的分布與排列，發(fā)現(xiàn)緡錢狀排列現(xiàn)象和紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象等，從而發(fā)現(xiàn)初步判斷是否有多發(fā)性骨髓瘤、巨球蛋白血癥、血粘度較高或者冷凝集綜合征等，甚至考慮判斷是否會影響紅細(xì)胞計數(shù)的準(zhǔn)確性等問題。

2評估檢測結(jié)果

通過血涂片的瀏覽觀察，可以對血細(xì)胞分析儀測定的細(xì)胞計數(shù)結(jié)果進(jìn)行復(fù)核，初步評估儀器計數(shù)結(jié)果的可靠性和一致性。例如白細(xì)胞可參考表1的關(guān)系進(jìn)行復(fù)核[4]；或采用估算方法進(jìn)行復(fù)核，選擇血片中分布均勻的區(qū)域進(jìn)行評估，白細(xì)胞計數(shù)(×109/L)=每高倍鏡視野中白細(xì)胞平均個數(shù)×2(×109/L)[5]。

表1　　血涂片白細(xì)胞分布與定量計數(shù)結(jié)果的關(guān)系對照表*

*：該對應(yīng)關(guān)系或評估方法，與所使用的顯微鏡鏡頭的數(shù)值孔徑和視場直徑有關(guān)，本表供參考。

還可根據(jù)血涂片上血小板分布情況初步評估儀器對血小板計數(shù)結(jié)果的一致性及復(fù)核。如果每油鏡視野中平均1個血小板，相當(dāng)于PLT計數(shù)結(jié)果的10×109/L，依次類推。或者通過血片推斷血小板數(shù)量，選擇血片體尾交界處分布均勻、無異常聚集或纖維蛋白絲的區(qū)域，瀏覽血涂片可大致估算血小板數(shù)量，方法：血小板數(shù)(×109/L)=每油鏡視野中血小板平均個數(shù)×15(×109/L)[5]。

3不漏檢血液病

復(fù)檢中很重要的問題是不要漏檢血液系統(tǒng)疾病，或者稱為造血與淋巴組織腫瘤。雖然許多品牌的血細(xì)胞分析儀可以給出不成熟粒細(xì)胞(IG)、異型淋巴細(xì)胞(ATYP)、原始細(xì)胞(BLAST)、核左移(LEFT SHIFT)、大型未染色細(xì)胞(LUC)等提示性報警信息，甚至是數(shù)量結(jié)果信息，但是他們依然具有局限性。根據(jù)目前的技術(shù)水平，五分類原理的血細(xì)胞分析儀尚不能對多種異常細(xì)胞給出明確的定義，更談不上對血液系統(tǒng)疾病給出正確的白細(xì)胞分類報告。因此需要有經(jīng)驗的檢驗醫(yī)師或技師進(jìn)行細(xì)致的顯微鏡分類復(fù)檢。在進(jìn)行顯微鏡涂片檢查時，除了關(guān)注和發(fā)現(xiàn)各系原始或幼稚細(xì)胞外，此外還應(yīng)關(guān)注中性粒細(xì)胞毒性改變(如中毒顆粒、空泡變性、D?hle小體及白細(xì)胞體積大小不均)，核左移與核右移、Pelger-Huet畸形、May-Hegglin畸形、Chediak-Higashi畸形、是否吞噬病原微生物等現(xiàn)象，這些問題的出現(xiàn)對診斷傳染性疾病、某些嚴(yán)重感染、中毒、惡性腫瘤、猩紅熱、白喉、MDS等具有重要意義，還對疾病的治療和預(yù)后判斷具有一定的幫助。對嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞異常增高的病例，也需進(jìn)行鏡下復(fù)核與確認(rèn)，以防止出現(xiàn)假性增加的問題。此外還要觀察是否有其他異常細(xì)胞出現(xiàn)，如異型淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞、毛細(xì)胞、塞色利(Sezary)細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞等，以便初步篩查某些血液系統(tǒng)疾病。白細(xì)胞參數(shù)出現(xiàn)異常報警提示，一般要考慮進(jìn)行白細(xì)胞分類，將幼稚或異常的白細(xì)胞給出適當(dāng)?shù)陌俜直葓蟾?，對儀器分類錯誤的結(jié)果要給予糾正或重新分類確定。如果某些報警信息過于敏感，經(jīng)鏡檢確認(rèn)未見異常報警信息所提示的細(xì)胞、或未見異常細(xì)胞，也要在報告中予以記錄和說明。

4關(guān)注紅細(xì)胞

應(yīng)該關(guān)注紅細(xì)胞形態(tài)信息,提供貧血診斷的初步鑒別信息。一般血細(xì)胞分析儀都會提供許多紅細(xì)胞報警的信息，如大細(xì)胞(Macro)、小細(xì)胞(Micro)、紅細(xì)胞大小不等(Aniso)、血紅蛋白含量不均(HC VAR)、低色素性(Hypo)、高色素性(Hyper)等形態(tài)學(xué)信息。筆者認(rèn)為這些紅細(xì)胞形態(tài)學(xué)信息是更加準(zhǔn)確的告知一個樣本的紅細(xì)胞大小或大小不等的信息，他更加客觀、更加敏感，更加準(zhǔn)確的、定量化的了解紅細(xì)胞大小及色素改變的情況，是比較可信的參數(shù)，而這些參數(shù)的準(zhǔn)確性應(yīng)該建立在儀器校準(zhǔn)合格、儀器質(zhì)控在控及MCV/MCH/MCHC三項浮動均值指標(biāo)完全在控的基礎(chǔ)之上。而人工觀測和描述這些紅細(xì)胞信息，則可能受到個人經(jīng)驗因素影響，筆者認(rèn)為其敏感性和一致性不如儀器分析結(jié)果準(zhǔn)確和穩(wěn)定。紅細(xì)胞大小及形態(tài)學(xué)改變的臨床意義參見表2。

表2　　MCV、MCH、MCHV和RDW輔助進(jìn)行貧血分類鑒別表

紅細(xì)胞分析還可對一些現(xiàn)象進(jìn)行提示性報警，如紅細(xì)胞聚集(RBC Agglutination)表示標(biāo)本可能有冷凝集現(xiàn)象；血紅蛋白測定濁度增加(Hb Interf)則可能是因乳糜血因素的影響；有核紅細(xì)胞增加(NRBC)、紅細(xì)胞雙峰分布(Dimorphic Population)、紅細(xì)胞碎片(RBC Fragment)干擾等，這些提示可以對一些紅細(xì)胞和血紅蛋白異?，F(xiàn)象進(jìn)行初步判斷，但是NRBC、紅細(xì)胞聚集、紅細(xì)胞碎片現(xiàn)象等還需要進(jìn)行顯微鏡下的確認(rèn)。如果這些現(xiàn)象出現(xiàn)，會影響到白細(xì)胞和紅細(xì)胞計數(shù)的正確性，進(jìn)而影響紅細(xì)胞相關(guān)計算參數(shù)的準(zhǔn)確性，因而需復(fù)檢血片；紅細(xì)胞碎片增多會干擾阻抗法的血小板計數(shù)結(jié)果，也要通過儀器直方圖和散點圖初篩，通過復(fù)檢血片而確認(rèn)，并且需要對受到影響的計數(shù)結(jié)果進(jìn)行糾正。復(fù)檢血片所需要關(guān)注的是許多紅細(xì)胞形態(tài)的異常改變、染色情況和內(nèi)部結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常時，血細(xì)胞分析儀的有關(guān)參數(shù)和報警信息不能完全覆蓋或不能正確提示，如珠蛋白生成障礙性貧血和HbC時出現(xiàn)的靶形紅細(xì)胞；遺傳性橢圓形紅細(xì)胞增多癥；自身免疫性溶血性貧血時的球形紅細(xì)胞(spherocyte)增多；肝臟疾病、溶血性貧血和小兒消化系統(tǒng)疾病導(dǎo)致的口形紅細(xì)胞(stomatocyte)增加；舞蹈病和重度肝損傷時的棘形紅細(xì)胞(acanthocyte)、骨髓纖維化時的淚滴樣紅細(xì)胞(tear drop)、巨幼細(xì)胞貧血和橢圓形紅細(xì)胞增多癥時的橢圓形紅細(xì)胞(elliptocyte)增加；以及鐮狀細(xì)胞(sickle cell)貧血、嗜堿性點彩(basophilic stippling)紅細(xì)胞、卡波環(huán)(Cabot rings)和豪焦小體(Howell-Jolly bodies)等情況出現(xiàn)和增加，均需要通過觀察紅細(xì)胞形態(tài)而進(jìn)行識別和參與臨床輔助診斷。

2015年，國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)委員會(International Council for Standardization in Haematology，ICSH)根據(jù)十多位專家的研究和建議，推出了有關(guān)紅細(xì)胞形態(tài)術(shù)語的標(biāo)準(zhǔn)化和外周血細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征分級標(biāo)準(zhǔn)(ICSH recommendations for the standardization of nomenclature and grading of peripheral blood cell morphological features)，見表3。該項推薦標(biāo)準(zhǔn)對今后應(yīng)用細(xì)胞形態(tài)術(shù)語的標(biāo)準(zhǔn)化，特別是在判斷細(xì)胞形態(tài)異常的標(biāo)準(zhǔn)方面，提供了有價值的借鑒性指導(dǎo)[6]。其中有關(guān)紅細(xì)胞形態(tài)的術(shù)語和分類原則，與我國專業(yè)書籍或教科書中有關(guān)紅細(xì)胞形態(tài)的命名及分類原則有一定差距，這方面應(yīng)該引起我國同行們的注意。同時筆者也建議國內(nèi)檢驗學(xué)會和血液學(xué)專家盡快討論，制定或建立中英文標(biāo)準(zhǔn)化術(shù)語和譯名，規(guī)范化各種細(xì)胞類別的定義，這對專業(yè)的發(fā)展是有積極意義的。

5關(guān)注血小板

特別關(guān)注血小板，血小板體積小，易發(fā)生聚集和計數(shù)不準(zhǔn)，因此是非常容易出現(xiàn)問題的復(fù)檢內(nèi)容之一。在進(jìn)行血涂片檢查或復(fù)檢時，首要注意是否出現(xiàn)血小板聚集(PLT Clump)報警信息，或者血小板分布異常(PLT Abn Distribution)的提示，特別是應(yīng)用EDTA抗凝血標(biāo)本時，注意防范血小板假性減低現(xiàn)象發(fā)生。而EDTA抗凝劑導(dǎo)致的假性血小板減低會給臨床帶來誤診或延誤治療。此外還需要關(guān)注大血小板是否明顯增加的報警(Large PLT)，它會使阻抗法計數(shù)的血小板出現(xiàn)假性減低現(xiàn)象，此時需要考慮是否改用其他檢測原理的設(shè)備，或者改用顯微鏡計數(shù)法進(jìn)行糾正，巨大血小板出現(xiàn)過多甚至?xí)?dǎo)致儀器“漏數(shù)”，這些超出紅細(xì)胞體積大小的巨大血小板只有通過鏡檢才能發(fā)現(xiàn)。如果外周血出現(xiàn)較多顆粒缺失或減少的血小板、巨大血小板、形態(tài)異常的血小板、血小板體積明顯大小不等，對骨髓病態(tài)造血相關(guān)的疾病和凝血機能障礙的疾病具有提示意義，如骨髓增生異常綜合征、慢性骨髓增生性疾病等。此外筆者在最近的兩年中還發(fā)現(xiàn)了冷球蛋白血癥患者，導(dǎo)致血小板計數(shù)假性升高的病例，如果是假性升高到極高的水平(如>1 000×109/L)通過復(fù)檢規(guī)則還可以發(fā)現(xiàn)，如果是血小板偏低，而假性升高到正常水平，甚至儀器不出現(xiàn)任何報警信息，那則是非常難以發(fā)現(xiàn)和復(fù)檢查出的，在2013和2015年就發(fā)現(xiàn)兩例此類患者。因此發(fā)現(xiàn)冷球蛋白血癥，其血小板計數(shù)結(jié)果一定要經(jīng)過人工復(fù)檢來確認(rèn)，這是以前的復(fù)檢規(guī)則中未曾提到的問題[7]。

表3　　細(xì)胞中英文名稱及形態(tài)學(xué)分級標(biāo)準(zhǔn)

6血液寄生蟲

血片檢查中另一特別需要重視的問題是血液寄生蟲，某些患者可能因臨床癥狀不典型，未引起臨床醫(yī)生關(guān)注寄生蟲感染問題。在血液中可以發(fā)現(xiàn)瘧原蟲[8]、微絲蚴、巴貝斯蟲、錐蟲、弓形蟲等感染，要知道這些病原體的發(fā)現(xiàn)，實際上是給臨床出具了診斷性報告，是血液檢驗中可以發(fā)出確診報告的項目，這是非常重要的。如果臨床患者有相關(guān)癥狀，或臨床醫(yī)生提示檢查血液寄生蟲，應(yīng)將血片仔細(xì)瀏覽，或者多涂幾張血片，包括厚血片進(jìn)行細(xì)致檢查。而目前在南方，特別是從疫區(qū)國家歸來的人員，其瘧原蟲感染率非常高，值得警惕和仔細(xì)檢查。

7顯微鏡計數(shù)技術(shù)

復(fù)檢有時候還需要傳統(tǒng)的顯微鏡法予以配合，雖然血細(xì)胞分析儀在計數(shù)的準(zhǔn)確性、精密度上、檢測速度上已經(jīng)大大高于傳統(tǒng)的人工測定方法，是毋庸置疑的。但是在某些特定的病例上，可能還需要人工法予以驗證和輔助分析。假如遇到EDTA及枸櫞酸鈉抗凝劑均可引發(fā)血小板聚集的病例，就需要回歸顯微鏡計數(shù)法。遇到嚴(yán)重的冷凝集現(xiàn)象或者冷球蛋白血癥、紅細(xì)胞碎片增加的病例，都有可能導(dǎo)致紅細(xì)胞計數(shù)及血小板計數(shù)出現(xiàn)錯誤，都可能要回歸顯微鏡計數(shù)法予以解決。溶血性貧血患者過高的網(wǎng)織紅細(xì)胞，也可因儀器試劑或線性問題導(dǎo)致計數(shù)結(jié)果偏低或不正確，且在41條規(guī)則中并未涉及到此類問題的復(fù)檢規(guī)則，因此也需要用傳統(tǒng)的煌焦油藍(lán)染色和顯微鏡計數(shù)法予以糾正[9]。

8數(shù)字圖像技術(shù)

目前已經(jīng)有一些數(shù)字圖像的血細(xì)胞檢查系統(tǒng)，將血片置于顯微鏡下進(jìn)行數(shù)字圖像拍攝，然后數(shù)字識別軟件對白細(xì)胞進(jìn)行分類處理。其完全模擬顯微鏡分類技術(shù)進(jìn)行形態(tài)學(xué)血細(xì)胞檢查，這是一個有益的進(jìn)步。但是可能還有一些瓶頸問題尚未得到解決，或許因血細(xì)胞形態(tài)千變?nèi)f化，在原始和幼稚細(xì)胞、異常細(xì)胞形態(tài)等方面，在某些成分的干擾情況下，其正確識別率仍有待進(jìn)一步的提升。目前對應(yīng)用此類儀器應(yīng)用，筆者的建議是，首先進(jìn)行屏幕審核，糾正其錯誤識別的細(xì)胞，消除干擾成分，對難以鑒別的樣本，重新進(jìn)行顯微鏡下的觀察和判別。

9小結(jié)

目前在廣泛應(yīng)用各種品牌的自動化血細(xì)胞分析儀進(jìn)行大量血常規(guī)標(biāo)本檢測的背景下、在工作量增加、檢驗人員配備不足、檢驗報告時間被限定的現(xiàn)實條件下，制定適合自己實驗室使用的、能夠保證實驗質(zhì)量、盡量減少漏檢和實驗誤差的復(fù)檢規(guī)則，非常重要。更為重要的是有了復(fù)檢規(guī)則，應(yīng)該具體落實和執(zhí)行這些規(guī)則，不要流于形式，以保證實驗室所出具的報告具有可信性和高質(zhì)量，最大限度地滿足臨床醫(yī)師診治工作對臨床檢驗的需求。

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(收稿日期：2015-08-28)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.04.001

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)04-0433-03

作者簡介：張時民，男，副主任技師，主要從事臨床檢驗基礎(chǔ)血液、體液及形態(tài)學(xué)檢驗專業(yè)研究。