茶葉中大腸菌群檢測方法的研究

武疆（濮陽市高等醫(yī)學(xué)專科學(xué)校（籌），河南濮陽457000）

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茶葉中大腸菌群檢測方法的研究

武疆
（濮陽市高等醫(yī)學(xué)專科學(xué)校（籌），河南濮陽457000）

摘要：本文以茶葉中大腸菌群為主要檢測目標(biāo)，利用國標(biāo)法、LST法以及熒光法檢測茶葉中大腸菌群總數(shù)，并比較三種檢測方法的優(yōu)劣，以期為相關(guān)研究者提供數(shù)據(jù)參考與理論支持。

關(guān)鍵詞：有害生物；茶葉；大腸菌群；檢測方法

據(jù)檢測結(jié)果表明，我國現(xiàn)出口的茶葉產(chǎn)品中，有害生物的種類是沙門氏桿菌、大腸桿菌、黃曲霉毒素等，其中，沙門氏桿菌和大腸桿菌嚴(yán)重超標(biāo)，黃曲霉毒素偶有檢出。另外，茶葉產(chǎn)品中，出現(xiàn)微生物污染的情況也不盡如人意。對此，不僅我國茶葉生產(chǎn)部門應(yīng)該重視并積極解決該問題，其他相關(guān)部門如銷售部門、管理部門、檢驗(yàn)檢疫部門等也應(yīng)該高度重視。尤其是檢驗(yàn)檢疫部門，應(yīng)該不斷加強(qiáng)檢疫力度，積極做好各項(xiàng)檢測試驗(yàn)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料：普洱、康磚、綠茶、包裝綠茶、茉莉花茶。（所有試驗(yàn)用茶都必須根據(jù)茶葉的具體取樣標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行樣品選取）

培養(yǎng)基：營養(yǎng)型瓊脂培養(yǎng)基、蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基、枸櫞酸鹽培養(yǎng)基、LST肉湯、BGLB肉湯、MUGal肉湯、乳糖發(fā)酵管、乳糖膽鹽發(fā)酵管、伊紅美藍(lán)瓊脂以及革蘭氏染色劑。（LST肉湯和BGLB肉湯需要自行熬制、MUGal可直接購買）

器材用具：酒精燈、天平、培養(yǎng)皿、吸液球、蓋玻片、載玻片、量筒、濾紙、紗布、漏斗、接種環(huán)、脫脂棉、溫度計(jì)、玻棒、膠頭吸管、試管、移液管、手術(shù)剪、250ml的燒杯、50ml、250ml、1000ml的三角燒瓶等。

實(shí)驗(yàn)器材：SW-CJ-1A型號的凈化水平流工作臺（江蘇省凈化設(shè)備有限公司）、B11.500-S恒溫電熱培養(yǎng)箱（江蘇省常熟醫(yī)療儀器有限公司）、S.C 101-1電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海市高機(jī)實(shí)業(yè)有限公司）、21CR6恒溫電熱水浴鍋（廣東醫(yī)療器械有限公司）、YXQ.SG41.280手提電熱蒸汽壓力消毒器（哈爾濱市松江醫(yī)療器械有限公司）、HZQQX全溫度振蕩器（上海市博訊事業(yè)醫(yī)療設(shè)備有限公司）、A13204-N分析天平（上海市第二天平有限公司）、LG-2.4A離心機(jī)（北京市醫(yī)療用具有限公司）、OLYMUPUS顯微鏡（Olymupus Co.LTD）、pHS-25型號的數(shù)字化PH計(jì)（上海市雷諾試驗(yàn)儀器有限公司）、HITACHIU-1800型號的分光光度計(jì)、BCD-216YH型號的海爾冰箱、SG-280型號的粉碎機(jī)、電爐等。

1.2試驗(yàn)方法

樣品檢驗(yàn)處理：在無菌操作下，利用粉碎機(jī)將各種類的取樣茶葉打碎，然后利用無菌包裝袋進(jìn)行密封并有效保存。

測定茶葉樣品中菌落總數(shù)：①選擇并確定茶葉的實(shí)際稀釋度：在無菌操作下，稱各種類茶葉樣品25g，利用粉碎機(jī)打碎后，放置于250ml的三角燒瓶中，分別加入225ml無菌水對其進(jìn)行稀釋，稀釋至均質(zhì)為10-1溶液。然后在以10倍的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行梯度稀釋，分別稀釋完成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等六個梯度溶液。從每個溶液濃度中移取1ml，然后滴入平皿，將營養(yǎng)型瓊脂倒入，放置進(jìn)入恒溫培養(yǎng)箱，溫度設(shè)置在36℃正負(fù)1℃的范圍內(nèi)進(jìn)行恒溫培養(yǎng)。48h之后進(jìn)行菌落數(shù)量觀察，根據(jù)實(shí)際的菌落數(shù)選擇并確定三個合適的稀釋度。②測定菌落總數(shù)：在無菌條件下，根據(jù)最后確定的三個茶葉稀釋度，各吸取1ml滴入培養(yǎng)皿，迅速倒入溫度適合的營養(yǎng)型培養(yǎng)瓊脂。對每個茶葉稀釋度進(jìn)行三次重復(fù)，然后放入溫度設(shè)置在36℃正負(fù)1℃范圍內(nèi)的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行菌落培養(yǎng)。48h之后，再進(jìn)行菌落觀察并記錄試驗(yàn)結(jié)果。

檢驗(yàn)大腸菌群的方法：大腸菌群，其實(shí)是指要么具有某些特性，要么與糞便污染相關(guān)的一組或一群細(xì)菌。通常屬于需氧型細(xì)菌或兼性厭氧型細(xì)菌，大多數(shù)在37℃時，能夠?qū)⑷樘沁M(jìn)行分解，并形成能夠產(chǎn)酸也能夠產(chǎn)氣的無芽孢桿菌，并且這些菌都屬于革蘭氏陰性菌。故此，對大腸菌落進(jìn)行檢測時，都需要按照其既定定義進(jìn)行。就目前來看，我國對進(jìn)出口食物進(jìn)行大腸菌落檢測時采用的方法主要有三種，分別是國標(biāo)法、LST法以及熒光法。

1.2.1國標(biāo)法：即國家標(biāo)準(zhǔn)，通常采用三步法進(jìn)行大腸菌落檢測，分別是乳糖發(fā)酵、分離培養(yǎng)以及證實(shí)等試驗(yàn)。（1）乳糖發(fā)酵試驗(yàn)：在茶葉樣品稀釋完成之后，選擇三個適宜的稀釋度，在每一個稀釋度上接種乳糖膽鹽發(fā)酵管，每個需接種三管，放置進(jìn)溫度設(shè)置在36℃正負(fù)1℃范圍內(nèi)的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)46-48h。在此過程中，需要觀察其是否有氣體產(chǎn)生。（2）分離培養(yǎng)試驗(yàn)：對有氣體產(chǎn)生的發(fā)酵管進(jìn)行處理，將其對應(yīng)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移接種在伊紅美藍(lán)的瓊脂平板之上，放置進(jìn)溫度設(shè)置在36℃正負(fù)1℃范圍內(nèi)的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24h。在此過程中，需要不斷觀察其菌落的具體形態(tài)。（3）證實(shí)試驗(yàn)：對平板上相對可以的菌落進(jìn)行深入分析，將其挑起進(jìn)行革蘭氏染色試驗(yàn)，觀察具體情況。同時，對其進(jìn)行乳糖發(fā)酵管接種，接種完成后放置于溫度設(shè)置為36℃正負(fù)1℃范圍內(nèi)的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22-26h。在此過程中，也必須觀察其是否產(chǎn)氣。

國標(biāo)法檢測完成之后，撰寫報(bào)告時，必須證實(shí)大腸桿菌中陽性菌的具體管數(shù)。同時，還需要查詢MPN表，將每100ml/g大腸菌群的實(shí)際MPN值進(jìn)行核對并報(bào)告。

1.2.2LST法：即國家商業(yè)檢疫局原來制定并采用的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，與美國PDA制定并采用的標(biāo)準(zhǔn)方法效果相同。該方法主要包括兩個試驗(yàn)，分別是推測和證實(shí)試驗(yàn)。（1）推測試驗(yàn)：對茶葉樣品稀釋完成之后，選擇三個適應(yīng)的稀釋度，在每個稀釋度上接種LST肉湯，每個需接種三管。接種完成之后，將培養(yǎng)皿放置于溫度設(shè)置在36℃正負(fù)1℃范圍內(nèi)的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)46-50h。在此過程中，需要切實(shí)觀察培養(yǎng)皿是否有氣體產(chǎn)生。（2）證實(shí)試驗(yàn)：對有氣體產(chǎn)生的LST肉湯管進(jìn)行處理，在其培養(yǎng)物上接種BGLB肉湯管。接種完成之后，將其放置于溫度設(shè)置為36℃正負(fù)1℃范圍內(nèi)的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)46-50h。在此過程中，同樣需要切實(shí)觀察培養(yǎng)皿是否有氣體產(chǎn)生。

LST法檢測完成之后，由于BGLB產(chǎn)生的氣體為陽性，所以同樣需要查詢MPN表，將樣品茶葉中每ml/g含有大腸菌群的實(shí)際MPN值。

1.2.3熒光法：即快速檢測大腸菌群的標(biāo)準(zhǔn)，主要包括三個試驗(yàn)，分別是推測、對照、證實(shí)等試驗(yàn)。（1）推測試驗(yàn)：在雙料管中滴加比例為1∶10的樣品稀釋溶液，重復(fù)三管；移取比例為1∶10的樣品稀釋溶液滴加到MUGal肉湯之中，重復(fù)三管；移取比例為1∶10的樣品稀釋溶液滴加到MUGal肉湯的單料中，重復(fù)三管。將所有試管放置于溫度設(shè)置在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。然后利用波長為366nm的紫外線進(jìn)行照射，若呈現(xiàn)的熒光反應(yīng)為蘭色，則大腸菌群為陽性。（2）對照試驗(yàn)：設(shè)置一個空白對照的試管，在MUGal肉湯中加入無菌形態(tài)下的生理鹽水，后續(xù)步驟按照推測試驗(yàn)進(jìn)行。（3）證實(shí)試驗(yàn)：設(shè)置陽性和陰性的對照菌管各一個。陽性對照管為MUGal肉湯中滴加大腸桿菌，陰性對照管為MUGal肉湯中滴加沙門氏菌。將所有對照管放置進(jìn)溫度設(shè)置為37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)完成之后，將試驗(yàn)管放置于黑暗之處，用波長為366nm的紫外燈進(jìn)行照射。如果熒光反應(yīng)為蘭色，則大腸菌群為陽性；如果熒光反應(yīng)不是蘭色，則大腸菌群為陰性。

熒光法檢測完成之后，與國標(biāo)法和LST法一樣，同樣需要查詢MPN表，進(jìn)行檢測報(bào)告完成。

2　結(jié)果與分析

2.1茶葉樣品中菌落總數(shù)的調(diào)查

不同種類的茶葉細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行抽樣檢查表明：茶葉產(chǎn)品整體情況較好。由上表可知：茉莉花茶和綠茶的茶湯在前三個稀釋度中的菌落總數(shù)正隨著這稀釋度的遞增而不斷增加，且該趨勢越發(fā)顯著；而普洱和康磚則與之不同，在稀釋度不斷增加的同時，其茶湯稀釋度中的菌落總數(shù)反而不斷減少，但這一趨勢變化具有一定程度的滯后性。該滯后性產(chǎn)生的原因可能是由于茶葉中存在多酚類物質(zhì)。茶葉中存在的多酚類物質(zhì)有較強(qiáng)的殺菌作用，故此，在高濃度的茶葉中，能夠檢測到細(xì)菌的總數(shù)會很少。另外，由于茶葉檢測的意義在于低濃度茶葉樣品中菌落總數(shù)的數(shù)值必須小于1％，所以，對茶葉中所含微生物進(jìn)行計(jì)數(shù)時，選擇的適宜稀釋度應(yīng)該為10-2、10-3以及10-4。

由試驗(yàn)的整體結(jié)果顯示：所有茶葉樣品的菌落總數(shù)均在2000cfu/ml至200000cfu/ml范圍內(nèi)。且按照茶葉所受污染的具體程度進(jìn)行遞減排序，各類茶葉的順序?yàn)榭荡u＞普洱＞茉莉花茶＞綠茶＞包裝綠茶。其中，由于普洱和康磚都是黑茶，且需要必要的發(fā)酵生產(chǎn)，所以受到微生物污染的侵染較為嚴(yán)重，其侵染途徑也相對要比其他茶葉的途徑多。另外，花茶屬于再加工茶品，所以，受到微生物污染和侵害的途徑也相對較多。由此，這幾種茶的細(xì)菌總數(shù)相對綠茶而言，都較高。

2.2不同方法檢測各類茶葉大腸菌落的對比分析

就傳統(tǒng)的大腸菌落檢測方法而言，其準(zhǔn)備工作異常繁瑣，且試驗(yàn)過程耗時較長，最少需72h。相比而言，熒光法只需24h，簡單快捷。下圖是國標(biāo)法、LST法以及熒光法對茶葉中大腸菌落的具體檢測結(jié)果：

雖然在統(tǒng)計(jì)學(xué)上，國標(biāo)法和LST法與熒光法之間沒有顯著性差異，且LST法在茶葉大腸菌群的檢測中具有很好的檢出性，但是前兩者檢出的大腸菌群在數(shù)量上明顯多過熒光法檢出的。分析原因，是受到茶樣中自身內(nèi)含物影響或干擾所致，但都沒有產(chǎn)生非特異性反應(yīng)。另外，在試驗(yàn)過程中，出現(xiàn)有試管本身帶有熒光的現(xiàn)象，這可能是由于試管本身沒有清洗干凈或是殘留物等影響。除此之外，茶葉成分復(fù)雜，茶樣顆粒較大、或壞死pH值過高等，都會對整個檢測試驗(yàn)產(chǎn)生干擾。

參考文獻(xiàn)

[1]王立波等.茶葉中大腸菌群檢測方法初步比較[J].中國茶葉, 2010,07:19-20.

[2]陳利燕等.茶葉中大腸菌群的污染途徑初探[J].中國茶葉加工, 2005,01:36-37.

作者簡介：武疆（1982-），女，山西長治人，碩士，講師，研究方向：生物學(xué)、微生物。