轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)及其在瓜菜作物上的應(yīng)用

張艷艷，季葦芹，楊玉文，關(guān) 巍，趙廷昌

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 長春 130118； 2.植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室·中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 北京 100093）

隨著功能基因組時代的到來，轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等各種組學(xué)技術(shù)相繼出現(xiàn)，其中轉(zhuǎn)錄組學(xué)是率先發(fā)展起來以及應(yīng)用最廣泛的技術(shù)[1]。利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)分析植物對生物脅迫和非生物脅迫的應(yīng)答機(jī)制，成為當(dāng)前逆境生理研究中的重要課題[2]。Velcuescu等[3]首先提出了轉(zhuǎn)錄組的概念，它是生物體的特定細(xì)胞或組織在某一功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出所有RNA的集合，包括mRNA和各種非編碼RNA，如rRNA、tRNA、還有最近發(fā)現(xiàn)的snoRNA、snRNA、microRNA等。對組織或細(xì)胞中的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA并利用近幾年興起的轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（RNA-squencing，RNA-seq）進(jìn)行測序，可以發(fā)現(xiàn)未知轉(zhuǎn)錄本、單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）以及各種分子標(biāo)記等基因資源，能夠反映出物種轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平，并可以揭示逆境脅迫下植物的分子機(jī)制，其應(yīng)用具有遠(yuǎn)大前景。目前對于瓜菜作物的遺傳學(xué)背景了解甚少，其基因組信息還比較缺乏，對一些關(guān)鍵基因以及對生物和非生物脅迫應(yīng)答的機(jī)制也不是很清楚。轉(zhuǎn)錄組學(xué)作為功能基因組學(xué)的前沿學(xué)科，在弄清楚植物與環(huán)境互作的信息方面發(fā)揮著不可替代的作用，被越來越多地應(yīng)用到瓜菜作物的研究中來，為獲得瓜菜作物與環(huán)境互作的關(guān)鍵基因及重要代謝通路等生物學(xué)信息奠定理論基礎(chǔ)，同時對克隆瓜菜作物重要功能基因、遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源鑒定以及分子標(biāo)記輔助育種均有不可估量的作用。筆者對功能基因組學(xué)中的轉(zhuǎn)錄組學(xué)的主要技術(shù)方法及在瓜菜作物上的應(yīng)用予以闡述。

1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)的主要技術(shù)方法

隨著研究的深入，人們建立了一系列的方法和技術(shù)用于轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究，目前研究轉(zhuǎn)錄組學(xué)主要有表達(dá)序列標(biāo)簽（Expressed squence tags，ESTs）、基因表達(dá)系列分析技術(shù)（Serial analysis of gene expression，SAGE）、大規(guī)模平行測序技術(shù)（Massively parallel signature sequencing，MPSS）、基 因芯 片（Microassay）及基于二代測序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組測序分析（RNA sequencing，RNA-seq）等方法。其中，由于RNA-seq能夠較為快速、準(zhǔn)確地為人們提供更多的生物體轉(zhuǎn)錄信息，故成為最新興起的利用深度測序進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析的技術(shù)，受到廣泛關(guān)注。

1.1 表達(dá)序列標(biāo)簽（Expressed sequence tags，ESTs）

表達(dá)序列標(biāo)簽是從一個隨機(jī)選擇的cDNA克隆進(jìn)行5’端和3’端單向測序獲得長度300～500 bp的cDNA部分序列，攜帶有表達(dá)基因的部分遺傳信息[4]。通過將ESTs數(shù)據(jù)庫與基因數(shù)據(jù)庫已知序列進(jìn)行比對，可以了解到生物生長發(fā)育、繁殖分化、遺傳變異和衰老死亡等一系列生命過程。ESTs已廣泛應(yīng)用于基因識別、基因圖譜的繪制、基因預(yù)測、基因克隆及功能分析等多個方面。在瓜菜作物如黃瓜、甜瓜、番茄、辣椒和西瓜等基因表達(dá)研究[5]、構(gòu)建遺傳學(xué)圖譜[6]及分子遺傳標(biāo)記[7-13]研究中也有相關(guān)報道。

1.2 基因表達(dá)系列分析技術(shù)（SAGE）和大規(guī)模平行測序技術(shù)（MPSS）

基于短序列測序的轉(zhuǎn)錄組研究方法，SAGE是Velculescu等[14]在1995年首次建立的一種高效、快速分析基因表達(dá)譜的開放性差異基因表達(dá)技術(shù)。該技術(shù)無需知道物種的基因組信息，便能夠整體地檢測所有轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平，對發(fā)現(xiàn)低拷貝基因有著重要意義[15]。然而多數(shù)序列標(biāo)簽為低豐度轉(zhuǎn)錄本，并不適合對遺傳信息匱乏的瓜菜作物轉(zhuǎn)錄組研究。

MPSS技術(shù)是在SAGE技術(shù)上進(jìn)行改進(jìn)，由Brenner等[16]2000年建立，成為一種新型基因克隆技術(shù)，可以獲得更長的短標(biāo)簽序列，從而提高轉(zhuǎn)錄本的精確度。其特有的微球熒光測序還可以直接高通量讀出序列[17-18]，被認(rèn)為是功能基因組研究的有效工具，可在短時間內(nèi)檢測到細(xì)胞或組織內(nèi)幾乎所有基因的轉(zhuǎn)錄情況。

然而，這2種技術(shù)過程中包含了酶切、克隆或雜交等繁瑣步驟，這些步驟可能會導(dǎo)致序列出現(xiàn)堿基偏向性，從而影響轉(zhuǎn)錄本的正確性[19]。

1.3 基因芯片（Microassay）技術(shù)

基因芯片是基于核酸雜交的一種轉(zhuǎn)錄組研究技術(shù)，利用紅、綠熒光染料分別標(biāo)記實驗樣本和對照樣本cDNA，混合后與基因芯片雜交，可顯示實驗樣本和對照樣本基因的表達(dá)強(qiáng)度[20]。目前，基因芯片主要應(yīng)用于基因表達(dá)檢測、尋找新基因、基因突變及基因文庫作圖等方面研究。

基因芯片技術(shù)比較成熟，能夠準(zhǔn)確地檢測較高表達(dá)的基因。但因雜交背景高，受基因拷貝數(shù)的限制無法檢測出低豐度基因，以及數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)有限，可能出現(xiàn)注釋錯誤。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（RNA-sequencing，RNA-seq）

以雙脫氧終止法核酸技術(shù)（Sanger技術(shù)）為代表的第一代測序技術(shù)完成了人類基因組的繪制，在測序長度（可達(dá) 1 000 bp）和堿基準(zhǔn)確率（高達(dá)99.999%）有著明顯的優(yōu)勢，但因其實驗周期長，花費(fèi)大和測序通量低，并不能滿足在大規(guī)模測序中應(yīng)用的需求[21-23]。

隨著生命科學(xué)的發(fā)展進(jìn)入后基因組時代，應(yīng)運(yùn)而生的是RNA-Seq技術(shù)，它可同時對數(shù)十萬乃至數(shù)百萬條DNA進(jìn)行測序，也可用于檢測總RNA或mRNA等轉(zhuǎn)錄本的研究，能夠全面、深入和細(xì)致地分析一種生物的組織或細(xì)胞的基因組、轉(zhuǎn)錄組，因此又被稱為深度測序[24]。

RNA-Seq 最初由 Ugrappa Nagalakshmi等[25]和Zhong Wang等[26]分別發(fā)表了利用RNA-Seq技術(shù)闡述裂殖酵母（fission yeast）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）轉(zhuǎn)錄組的研究論文，標(biāo)志著該技術(shù)的建立，極大地推動了許多非模式植物、農(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)作物的全基因組測序工作。因該技術(shù)可以獲得全部轉(zhuǎn)錄本的豐度信息及具有較高的準(zhǔn)確度，故能夠應(yīng)用于瓜菜功能基因組學(xué)研究，且在瓜菜作物抗逆、抗病基因發(fā)掘和種質(zhì)資源評估應(yīng)用方面前景廣闊。

相較傳統(tǒng)的測序技術(shù)而言，RNA-Seq因具有高通量、低成本、對物種遺傳背景和靈敏度要求較低、重復(fù)性好、精確度高、不需要太大的RNA量且可檢測到低至幾個拷貝的轉(zhuǎn)錄本等特點，從而表現(xiàn)出其獨(dú)特的優(yōu)越性，日漸成為轉(zhuǎn)錄組研究的主要方法[27-29]。RNA-Seq已廣泛涉及營養(yǎng)、發(fā)育階段、病原物、非生物脅迫等研究領(lǐng)域，對于獲得物種或組織的轉(zhuǎn)錄本信息及轉(zhuǎn)錄本上基因的相關(guān)信息、發(fā)現(xiàn)新基因和可變剪切以及進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化和基因表達(dá)差異分析等[30-33]均具有促進(jìn)作用。

2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在瓜菜作物上的應(yīng)用

轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)因具有測序通量高、時間短且成本低、信息量大等優(yōu)勢，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于瓜菜作物轉(zhuǎn)錄組的研究中，如辣椒（Capsicum annuumL.）[34]、南瓜（Semen cucurbitae）[35]、西葫蘆（Cucurbita pepoL.）[36]、西瓜（Citrullus lanatus）[37-38]、黃瓜（Cucumis sativusL.）[39]、甘薯（Ipomoea batatas）[40]、大蒜（Allium sativumL.）[41]、西蘭花（Brassica oleracea）[42]、番茄（Solanum lycopersicum）[43-44]等作物。這些研究運(yùn)用RNA-seq技術(shù)，有助于發(fā)現(xiàn)瓜菜作物轉(zhuǎn)錄組的重要基因和SSR分子標(biāo)記。此外，瓜菜作物在受到生物和非生物因素影響后，會引起自身代謝失衡等生理狀態(tài)的變化，而運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法，可以研究特定時間、特定狀態(tài)下內(nèi)源因子和外源因子調(diào)控的基因表達(dá)差異情況，在瓜菜非生物脅迫和抗病機(jī)制研究應(yīng)用方面前景廣闊。

2.1 非生物脅迫條件下轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在瓜菜作物上的應(yīng)用

非生物脅迫如干旱、高鹽、冷害、高溫、水澇等會影響植物水分、光合、呼吸、物質(zhì)代謝等過程，進(jìn)一步誘導(dǎo)植物相關(guān)基因的表達(dá)，最終積累某些物質(zhì)并改變其代謝途徑。而植物為了生存下來，在長期的系統(tǒng)發(fā)育中逐漸形成了對逆境的眾多的適應(yīng)和抵抗機(jī)制，轉(zhuǎn)錄水平上的基因表達(dá)和調(diào)控則在其中發(fā)揮重要作用[45]。研究非生物脅迫條件下植物的基因表達(dá)譜也已成為第二代測序技術(shù)的重點應(yīng)用領(lǐng)域，在瓜菜作物的研究上也逐漸廣泛開展起來。

陳嘉貝[46]采用RNA-Seq技術(shù)，對鹽脅迫處理前后的甜瓜進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)大量轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)發(fā)生了顯著變化。通過測定這些轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的特性和規(guī)律，為更好地理解甜瓜對鹽脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制以及對作物耐鹽機(jī)制的認(rèn)識提供參考。盧坤等[47]通過Illumina測序技術(shù)分析鑒定到3 657個油菜葉片干旱脅迫應(yīng)答相關(guān)基因，經(jīng)過GO（Gene Ontology）和 KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析，顯著富集到 ABA（abscisic acid）刺激響應(yīng)的基因，揭示了油菜抵抗或適應(yīng)外界干旱環(huán)境在轉(zhuǎn)錄水平上依賴ABA合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，以提高體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和抗氧化物質(zhì)合成基因的表達(dá)水平，這與Zhang等[48]對其他植物抗旱機(jī)制的研究結(jié)果一致。證實了ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和次生代謝途徑對油菜干旱脅迫抗性的重要性。尹波[49]借助RNA-Seq技術(shù)測定了高溫處理前后的番茄植株轉(zhuǎn)錄組動態(tài)變化，篩選到大量受高溫脅迫的基因。這些基因參與環(huán)境應(yīng)答、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等一系列應(yīng)答過程，揭示了番茄高溫脅迫下轉(zhuǎn)錄組水平的復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。此外，有關(guān)瓜菜作物耐鉀、耐寒的轉(zhuǎn)錄組研究也有相關(guān)報道[50-51]。

瓜菜抗逆轉(zhuǎn)錄組和表達(dá)譜研究表明，參與脅迫響應(yīng)的基因可通過調(diào)控涉及信號受體、轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)類蛋白編碼的基因表達(dá)以及調(diào)節(jié)編碼具有保護(hù)功能產(chǎn)物基因的表達(dá)，最終合成抗逆代謝物相關(guān)蛋白，從而提高作物的脅迫耐受性。

2.2 瓜菜作物與病原菌互作的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

在與病原菌互作研究領(lǐng)域，轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于各種瓜菜作物的病害研究。

Tan 等[52]對黃萎病菌（Verticillium dahliae）誘導(dǎo)的番茄根系中提取到的mRNA建立cDNA文庫進(jìn)行RNA-seq分析，共篩選到1 953個顯著的差異表達(dá)基因，GO、COG（Cluster of Orthologous Groups）和KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，這些基因參與生物調(diào)節(jié)、次級代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、苯丙烷代謝及植物-病原互作途徑，為挖掘防御相關(guān)基因及深入解析番茄與黃萎病菌互作機(jī)制提供廣泛的數(shù)據(jù)支持。Kong等[53]對灰霉?。˙otrytis cinerea）誘導(dǎo)前后的黃瓜轉(zhuǎn)錄組研究中，發(fā)現(xiàn)了3 512個差異表達(dá)基因，經(jīng)過GO功能注釋和KEGG代謝途徑分析，篩選到一些包括參與ABA、ET、生長素以及谷胱甘肽代謝（GSH）途徑的基因，這些基因在黃瓜抗灰霉病中發(fā)揮重要作用，這與前人對番茄灰霉病的抗性機(jī)制的研究結(jié)果一致[54-59]。Gyetvai等[60]分析了馬鈴薯晚疫?。≒hytophthora infestans）侵染寄主后的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)在寄主與病原菌親和互作過程中，一些基因出現(xiàn)了不同程度的上調(diào)或下調(diào)，較為明顯的是，病原相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)，光合作用功能基因及CO2固定相關(guān)基因下調(diào)表達(dá)，這可能是病原菌侵入寄主后，抑制了寄主植物的生長，之前的研究結(jié)果也得出較為一致的結(jié)論[61]。單春會[62]運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對未侵染（0 h）和被青霉菌侵染（48 h和60 h）的哈密瓜果實進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)數(shù)個病原菌相關(guān)分子受體（PAMP）和抗病相關(guān)基因表達(dá)量均存在差異，較為深入地揭示了哈密瓜對青霉菌侵染的應(yīng)答機(jī)制。

寄主植物受病原菌脅迫后，寄主細(xì)胞利用自身免疫受體（抗病蛋白）能夠識別病原菌效應(yīng)因子，通過激活一些參與抗病相關(guān)途徑基因的表達(dá)，誘發(fā)寄主細(xì)胞自身抗病反應(yīng)，進(jìn)而實現(xiàn)對病原菌脅迫信號的響應(yīng)、傳遞以及生物學(xué)防御。辣椒受黃單胞菌（Xanthomonas vesicatoria）侵染后，其自身可識別黃單胞菌的效應(yīng)因子，并通過基因Bs4C調(diào)控黃單胞菌類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)蛋白AvrBs4的識別，從而對病原菌起到一個防御的效果[63]。Du[64]等通過RNA-seq技術(shù)研究了番茄抗感品系接種細(xì)菌性瘡痂?。╔anthomonas perforans）6 h和6d的差異表達(dá)基因變化，篩選到植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物-病原互作、苯丙氨酸代謝等抗病相關(guān)途徑的基因，為充分了解番茄與瘡痂病菌互作機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持。

瓜菜作物的抗病性由多基因協(xié)同作用，通過一系列基因的表達(dá)調(diào)控來實現(xiàn)。瓜菜作物-病原菌互作過程中啟動的差異表達(dá)基因體現(xiàn)了作物對病原菌效應(yīng)子的識別、抗病信號級聯(lián)傳遞及抗病防御系統(tǒng)的激活等關(guān)鍵信息，通過獲得這些信息能夠有助于全面深入了解作物的抗病機(jī)制。

3 展 望

轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控是生物體最主要的調(diào)控方式，對生物體細(xì)胞RNA的調(diào)控機(jī)制研究可以從基因組水平上進(jìn)行。就目前來看，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)正逐步取代傳統(tǒng)測序方法（如基因芯片技術(shù)）而成為研究基因的主要手段?，F(xiàn)階段，轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)因其低成本和方便性受到廣泛重視和應(yīng)用。對生物脅迫和非生物脅迫處理后的瓜菜作物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，并結(jié)合生物信息學(xué)方法對轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分析，包括基因功能的注釋、特異表達(dá)基因的篩選、抗逆代謝通路的研究以及一些新基因的發(fā)掘，便于弄清楚這些基因在瓜菜作物的生理和病理方面擔(dān)任的角色以及瓜菜作物對生物和非生物耐受性的分子機(jī)制，進(jìn)一步為瓜菜作物功能基因組學(xué)的發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的發(fā)展為瓜菜作物轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究提供了新的技術(shù)手段，使瓜菜作物轉(zhuǎn)錄組研究進(jìn)入到一個快速發(fā)展的階段。目前在實際應(yīng)用中轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究面對的主要問題是如何高效的挖掘功能基因。一方面是因為基因的轉(zhuǎn)錄豐度與基因表達(dá)產(chǎn)物的活性沒有必然的聯(lián)系，用基因表達(dá)量的變化來反映生理及分子機(jī)制不具備十足的嚴(yán)謹(jǐn)性，給轉(zhuǎn)錄組學(xué)的應(yīng)用帶來了挑戰(zhàn)。另一方面是轉(zhuǎn)錄本所反映的基因信息與基因表達(dá)信息的一致性問題。這些問題都困擾著轉(zhuǎn)錄組學(xué)的發(fā)展。因此，通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)研究的瓜菜基因變化來解釋瓜菜抗逆機(jī)制應(yīng)變得慎重。在研究瓜菜作物抗逆機(jī)制方面，有必要將轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)結(jié)合起來，以提高信息分析的準(zhǔn)確性和真實性。隨著時代的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)必將受到廣泛青睞，成為瓜菜作物研究領(lǐng)域比較成熟且比較常規(guī)的分子手段之一。瓜菜作物轉(zhuǎn)錄組學(xué)也會在抗逆、抗病機(jī)制研究、品種選育和種質(zhì)資源鑒定方面不斷前進(jìn)。